PLOS ONE: Nanostring-Based MultiGene Ensaio para predizer recorrência para pacientes com câncer gástrico após Surgery

Abstract

Apesar dos benefícios da quimioterapia adjuvante ou quimioradioterapia, aproximadamente um terço do câncer gástrico estágio II (GC) pacientes desenvolveram recorrências. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um algoritmo prognóstico para câncer gástrico (GCPS) que pode robustamente identificar grupo de alto risco de recorrência entre os pacientes fase II. Realizou-se a expressão do gene de múltiplos passos de perfis estudo. Em primeiro lugar, um perfil de expressão de genes de microarranjos de blocos de tumor embebidos em parafina e arquivadas foi usada para identificar genes candidatos prognósticos (n = 432). Em segundo lugar, utilizou-se um ensaio de expressão do gene focado incluindo genes de prognóstico para desenvolver um ensaio clínico fiável (GCPS) na fase II pacientes do mesmo grupo (N = 186). Em terceiro lugar, um corte pré-definida para fora da GCPS foi validado usando uma coorte independente fase II (n = 216). O GCPS foi validado em outro conjunto com a fase II GC submetidos à cirurgia sem tratamento adjuvante (N = 300). GCPS foi desenvolvido pela soma do produto dos coeficientes de regressão de Cox e os níveis de expressão de genes normalizados de 8 (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, Nox4, TFDP1). Um ponto de corte definido prospectivamente para GCPS classificadas 22,7% do coorte de validação tratados com quimioradioterapia (N = 216) como grupo de alto risco com taxa de recorrência em 5 anos de 58,6% em comparação com 85,4% no grupo de baixo risco (taxa de risco de recorrência = 3,16, p = 0,00004). GCPS grupo de alto risco também identificou entre os pacientes estágio II tratados apenas com cirurgia (taxa de risco = 1,77, p = 0,0053)

Citation:. Lee J, Sohn I, Do IG, Kim KM, Parque SH, Parque JO, et ai. (2014) Nanostring-Baseado MultiGene Ensaio para predizer recorrência para pacientes com câncer gástrico após a cirurgia. PLoS ONE 9 (3): e90133. doi: 10.1371 /journal.pone.0090133

editor: Ju-Seog Lee, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Setembro, 2013; Aceito: 26 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa Intramural do Centro Médico Samsung. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Patrick Tan é um membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cancros gástricos são tumores altamente letais com taxas de sobrevivência de cinco anos sendo um dos piores relatado por quaisquer tumores sólidos. De acordo com dados do National Cancer Institute Vigilância, Epidemiologia e Resultados Finais (SEER) do Programa, a sobrevivência de cinco anos para pacientes com câncer gástrico (GC) melhoraram apenas modestamente ao longo dos últimos 50 anos, passando de 12 para 22 por cento [1]. A propensão de GC para disseminação metastática precoce tem sido bem documentada em estudos anteriores [2], [3]. Com base nos recentes ensaios de fase III adjuvante, benefício de sobrevivência da quimioterapia adjuvante ou quimioradioterapia foi documentada em GC [4] - [7]. No entanto, 25 a 40% de todos os pacientes GC cirurgicamente ressecado ainda desenvolver recorrências que não são passíveis de re-ressecção [4], [7] - [9]. Durante a fase patológica III e IV GC, as taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos são muito pobres (fase III, de 57,6%, fase III-B, 39,6%; e estágio IV 26,3%) [8], implicando que esses tumores têm um comportamento intrinsecamente agressivo. Em contraste, os pacientes GC patológicas fase II têm resultado clínico mais favorável com 5 anos as taxas de sobrevida livre de doença de 76% -90% após a cirurgia e tratamento adjuvante [8], [9]. No entanto, existe um amplo espectro de agressividade clínica mesmo dentro da mesma fase com alguns pacientes a ser curado com cirurgia sozinha enquanto alguns pacientes logo após reincidência terapia adjuvante de cirurgia e radioquimioterapia. Assim, com base na hipótese de que existe uma heterogeneidade molecular significativa, nós projetamos uma expressão do gene de grande escala profiling estudo para desenvolver um teste molecular que pode eficientemente discriminar baixo risco de grupos GC de alto risco de recorrência após a cirurgia.

Um teste molecular que identifica pacientes de alto risco de recorrência pode levar a otimizadas estratégias de tratamento perioperatório em GC. A fase de descoberta incluiu pacientes GC de todos os estágios clínicos tratados com quimioradioterapia (N = 520). blocos de tumor a partir destas pacientes foram submetidos a descoberta de genes utilizando um ensaio de prognóstico do Genoma DASL Total (WG-DASL) (Illumina, San Diego, CA), um método de perfil de expressão de genes de microarranjos de tecido embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE). O objetivo foi desenvolver hipótese para utilidade clínica e descobrir prognóstico candidato ou genes de referência internos que ajudarão ensaio de expressão genética design focado. Os resultados desta fase sugeriu que a utilidade clínica de uma expressão gênica baseada em algoritmos de prognóstico podem, eventualmente, caracterizar um grupo de alto risco entre os pacientes em estágio II.

O objetivo do projeto era desenvolver uma hipótese com utilidade clínica e descobrir candidato genes de referência prognósticos ou internos, a fim de projetar ensaios de expressão de genes focados. Os resultados a partir da fase de descoberta sugere que a utilidade clínica de um algoritmo de prognóstico baseia-expressão do gene pode, eventualmente, caracterizar um grupo de alto risco entre os pacientes da fase II. Com o uso de um algoritmo prognóstico de várias etapas robusta, câncer gástrico prognóstico Score (GCPS) para pacientes GC fase II foi desenvolvido para identificar pacientes de alto risco de recorrência após a cirurgia.

Métodos

A partir de Setembro de 1994 a dezembro de 2005, 1.557 pacientes do GC foram submetidos a gastrectomia curativa da Samsung Medical Center. Entre esses, 1.107 pacientes foram selecionados com base nos seguintes critérios: diagnóstico histológico de adenocarcinoma do estômago; ressecção cirúrgica do tumor sem doença residual macroscópica ou microscópica; idade ≥18; estágio patologia IB (T2bN0, T1N1 mas não T2aN0) a IV, de acordo com a American Joint Committee on Cancer (AJCC) sistema de estadiamento (6 ^{th Ed); registro completo cirúrgico e registo de tratamento, e os pacientes que receberam o regime INT-0116 como tratamento adjuvante [7]. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Centro Médico Samsung, Seoul, Coreia do Sul (número de aprovação IRB: SMC 2010-10-025). Todos os participantes do estudo fornecidos por escrito formulário de consentimento informado recomendado pelo IRB. Nos pacientes que tenham falecido no momento da entrada no estudo, formulários de consentimento informado por escrito foram dispensados ​​pelo IRB. Desenho do estudo e grupos de pacientes são fornecidos de acordo com a observação de orientação (Figura 1A, 1B, Arquivo S1, Seção 1). Da coorte de 1.107 pacientes, um conjunto descoberta de 520 pacientes e um conjunto de validação de 587 pacientes foram designados e alocados para 6 lotes estratificados por tamanho do tumor e ano da cirurgia para o ensaio WG-DASL aleatoriamente.}

Para evitar conclusões falso-positivos devido à sobre-montagem, algoritmos de prognóstico e seus pontos de corte pré-definidos foram testadas em grupos independentes que não foram utilizados para a descoberta do gene prognóstico e construção de algoritmo. Um estudo de 4 fases foi projetado, com 4 grupos independentes pré-definidos recrutados a partir do Centro Médico Samsung. Os primeiros 3 coortes incluem pacientes com características clínicas e patológicas similares de coortes do estudo tratados com quimioradioterapia (File S1, Seção 2). A primeira fase (fase de descoberta) do estudo incluiu pacientes GC de todos os estágios clínicos que foram tratados com quimio-radioterapia (N = 520) [8]. blocos de tumor a partir destas pacientes foram submetidos a descoberta de genes usando o prognóstico GT-DASL (Illumina, San Diego, CA), uma expressão de genes de microarranjos método de perfil para FFPE [7]. Uma validação externa ad-hoc do conjunto de genes foi realizada para minimizar qualquer viés de coorte institucional único. A segunda fase (desenvolvimento de algoritmos) foi de traduzir os resultados da primeira fase em um formato de teste clinicamente aplicável. Nós escolhemos a plataforma nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA), devido à sua capacidade para interrogar os níveis de expressão de até 800 genes utilizando ARN total extraído a partir de FFPE em um único tubo de reacção-[8]. Nós rastreados fase II, os doentes da primeira fase (N = 186) para o de novo
descoberta de genes prognósticos, as combinações ideais selecionados de genes utilizando o gradiente de encolhimento menos absoluto e operador de seleção algoritmo (LASSO) [10], e depois construiu uma GCPS primeira geração (GCPS-g1), adicionando os produtos da expressão gênica normalizada e os coeficientes do modelo de Cox para DFS. Na terceira coorte de fase II pacientes (n = 216). Na quarta fase (teste de utilidade clínica em uma cirurgia configuração somente), foi testada a utilidade clínica potencial da GCPS em II pacientes em estágio tratados apenas com cirurgia. Um protocolo de carimbo de tempo (Figura S12) foi desenvolvido antes do processamento desta coorte final. Nós posteriormente desenvolveu uma GCPS refinada de segunda geração (GCPS-g2) (o conjunto de genes final), analisando o estágio combinado coortes II a partir das segunda e terceira fases do estudo.

perfis de expressão genética genome- toda DASL ensaio

antes de cada gene profiling experimento, amostras de tecido foram alocados aleatoriamente para diferentes lotes estratificados por tempo de cirurgia (antes de 2000 vs. depois de 2000) e o tamanho do tumor (≤ 5 cm vs > 5 cm) para minimizar qualquer variações da qualidade do ADN. O ARN total foi extraído a partir de secções de 2-4 ^ m 4-FFPE secções espessas de blocos de tumor primário representativos utilizando o puro kit de alta ARN de parafina (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemanha), após remoção de elementos não tumorais por macrodissection Manual guiada por hematoxilina e eosina lâminas coradas. ensaio GT-DASL foi realizada utilizando 200 ng de ARN seguindo as instruções do fabricante [11]. Para o ensaio nCounter, 200 ng de ARN total foi hibridado com o costume concebido conjunto de códigos de 800 genes durante 18 horas a 65 ° C e processado de acordo com as instruções do fabricante [12]. Os dados foram normalizados para níveis de expressão média de 48 genes de referência internos seleccionados a partir de experimento de microarray. A descrição detalhada da fase de descoberta utilizando o ensaio WG-DASL é fornecida em S1 Arquivo, Seção 3. A comparabilidade na qualidade do DNA de tecido FFPE e tecidos congelados frescos usando ensaio DASL foi publicado anteriormente [13], [14].

prognóstico construção do modelo e validação

O algoritmo para o desenvolvimento ensaio à base de n-Counter para a utilidade clínica com base em WG-DASL é fornecido no arquivo S1, secções 4-6. Foi utilizado o algoritmo de lasso inclinação para ajustar um modelo de previsão com base no modelo de riscos proporcionais de Cox para DFS utilizando as sondas com valor <marginal p; 0,01 (Figura S2 no arquivo S1) [10]. Usamos licença um fora de validação cruzada com a descoberta de novo em cada deixar um fora passo para avaliar o desempenho do modelo prognóstico dentro da coorte descoberta. corte de ponto ótimo foi determinado pela criação de um enredo para p-valores para cada ponto de corte para o escore prognóstico. Para estudo de validação, foram utilizados um algoritmo definido priori e valores de ponto cortado. O método de validação para GCPS é descrita no arquivo S1, Seção 7.

Resultados

expressão do gene Microarray perfis de pacientes GC tratados com quimioradioterapia adjuvante (fase 1)

Realizamos perfil de expressão do gene de FFPE da coorte descoberta de 520 casos de fase IB-IV tratados com radioquimioterapia GC padrão após a ressecção curativa utilizando o ensaio GT-DASL (Figura 1). Entre eles, 432 amostras passaram RNA de controle de qualidade (banco de dados GEO GSE 26253) (Arquivo S1, Seção 3). O desfecho primário foi DFS. A análise univariada identificou 369 sondas que foram significativamente associados à sobrevida livre de doença em p < 0,01 sem ajuste para outras variáveis ​​clínicas (File S1, Seção 3d). Em seguida, gradiente Lasso foi usado para desenvolver um algoritmo prognóstico para prever a recorrência (File S1, Seção 3-E). O procedimento leave-one-out validação cruzada (LOOCV) com de novo
descoberta de genes prognósticos e a construção de um algoritmo de prognóstico em cada etapa foi usado para examinar a robustez do algoritmo prognóstico. De acordo com as assinaturas de prognóstico de genes (26 genes, Arquivo S1, Seção 3F) e fases patológicas (localizada vs. avançado), 432 pacientes foram categorizados nos seguintes grupos: baixo risco e estágio IB /II (N = 145; 5 anos DFS, 84,8%), de alto risco e estágio IB /II (N = 90; 5 anos DFS, 61,1%), de baixo risco e fase III /IV (N = 83; 5 anos DFS, 48,9%), e de alto risco e fase III /IV (N = 114; 5 anos DFS, 36,9%) (Figura 2). Como uma análise ad-hoc, testamos esta assinatura gene usando perfil de expressão gênica dados da coorte de pacientes Singapura (N = 199) para minimizar qualquer tendência inerente de uma única coorte instituição [15]. Na coorte externa paciente, o gene assinatura foi capaz de separar o grupo de alto risco (N = 100) no grupo de baixo risco (N = 99) para a recorrência com significância estatística (p < 0,00001; taxa de risco (HR), IC de 95%, 1,62-3,28) (Figura 2); 2.3. Estes dados sugerem a principal utilidade clínica do perfil de expressão gênica de GC na identificação de pacientes de alto risco entre os pacientes em estágio II (baixo vs alto risco estágio IB /II, 84,8% vs. 61,1%; estágio de baixa vs. alto risco III /IV, 48,9% vs. 36,9%). Portanto, para o desenvolvimento do ensaio clínico e validação, focada no desenvolvimento de um gene-set que pode robustamente prever recorrência em pacientes em estágio II.

O desenvolvimento de câncer gástrico prognóstico Score (GCPS) para a fase II GC usando o ensaio nCounter (fase 2)

Nós projetado um conjunto de sonda nCounter composta de candidatos genes prognósticos a partir de dados WG-DASL microarray (fase 1), bem como genes do câncer conhecidos, os genes da quinase, e acoplado à proteína G os genes de receptores. Para resolver o problema da variabilidade na integridade de moléculas de RNA em FFPE arquivado devido a variáveis ​​pré-analíticas, tais como tempo de fixação e idade dos blocos, foi aplicado a normalização dentro de amostra usando um conjunto de 48 genes de referência internos selecionados a partir de dados de microarranjos base na variação mínima ao longo dos casos e falta de associação com o prognóstico (File S1, Seção 4). Correlação entre as taxas de risco de genes prognósticos baseados em nanostring e WG-DASL são fornecidos no arquivo S1, Seção 4b, e Figura S3 em S1 Arquivo.

Nós perfilado 186 fase II, os doentes a partir do conjunto de descoberta. Depois de avaliar a robustez dos algoritmos de prognóstico construídos por gradiente LASSO através LOOCV, aplicamos LASSO gradiente para todos os 186 pacientes e identificou 8 genes (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, Nox4 e TFDP1) que, em combinação fornecida robusta prognóstico informações (Tabela 1). O GCPS foi então desenvolvido como uma combinação linear das estimativas de regressão de Cox e os níveis de expressão destes normalizados 8 genes. A análise de ponto de corte demonstra que o GCPS era mais robusto na identificação de 25% dos pacientes com piores resultados (File S1, Seção 4). Nós escolhemos um ponto de corte de 0,2205 para validação prospectivo em coorte de validação independente.

Validação de GCPS e seu ponto de corte predefinido na fase II, os doentes tratados com GC quimioradioterapia (fase 3)

para evitar o potencial over-fitting problema associado com a validação cruzada [16], nós validado GCPS com o algoritmo fixo e pontos de corte em uma coorte de pacientes independente que não foi utilizado na descoberta do gene. As características clínicas e patológicas de 216 pacientes em estágio II da validação definir foram semelhantes aos da coorte descoberta (File S1, secção 6, e as Figuras S4-6 em S1 Arquivo). Quando aplicamos GCPS-g1 ao conjunto de validação, a distribuição escore de risco foi muito semelhante, sugerindo que o desempenho analítico robusto do ensaio (File S1, Secção 7, e Figura S7 é S1 Arquivo). O corte de ponto pré-definido (0,2205) para GCPS-g1 classificadas 22,7% dos tumores a partir da validação definido como o grupo de alto risco. A estimativa Kaplan Meier de 5 anos DFS para os pacientes de alto risco foi de 58,6%, em comparação com 85,4% para os pacientes de baixo risco (HR de recorrência, 3,16; p = 0,00004) (Figura 3). GCPS foi significativa em ambos intestinal- e diffuse- tipo GC, como mostrado na Figura S8 no ficheiro S1 (Ficheiro S1, secção 7b). A análise multivariada mostra ainda que GCPS-G1 fornecida informação de prognóstico adicional, além de outros factores conhecidos, tais como a classificação Lauren, grau de diferenciação, idade e tipo de cirurgia (HR, 3,027; p = 0,00016; Tabela 2). Portanto, GCPS pode ser usado para identificar a fase II pacientes que permanecem em alto risco mesmo após quimioradioterapia adjuvante padrão e que têm risco semelhante de recorrência como III pacientes em estágio.

GCPS como fator prognóstico para pacientes GC estágio II tratados com a cirurgia apenas com base em um protocolo desenhado prospectivamente (fase 4)

a revisão da base de dados clínicos identificados 306 pacientes que não receberam tratamento pós-operatório com base na decisão compartilhada entre médicos e pacientes (Arquivo S1, Seção 1, Tabela S1 S1 Arquivo). Estes pacientes foram submetidos a análises exploratórias para avaliar o papel prognóstico do GCPS em pacientes tratados com cirurgia só e testar a hipótese de que o benefício de quimioradioterapia é limitado em pacientes de alto risco definidos pelo GCPS. Para esta etapa, desenvolvemos GCPS-g2 (Tabela S8 no arquivo S1), a segunda geração do GCPS, analisando todas as fases casos II das fases 2 e 3 para maximizar o tamanho da amostra. Nós prospectivamente testado o algoritmo predefinido GCPS-G2 e cortar-pontos, como descrito no protocolo de carimbo de tempo (Figura S12 no ficheiro S1). O GCPS-g2 previu recorrência em 300 estágio tumores II com uma razão de risco de 2,131 (IC 95%, 1,428-3,180; p = 0,00021) (HR, 3,16) (Figura S9 em S1 Arquivo). Para minimizar a possibilidade de sobre-montagem do algoritmo para pacientes tratados com quimioradioterapia, nós também testou o GCPS-g1, que foi previamente validado no grupo tratado com quimioradioterapia, em cirurgia sozinha coorte (Figura S10 no arquivo S1). A taxa de risco para GCPS-g1 (HR, 1,77; IC 95%, 1,18-2,67; p = 0,0053) é semelhante ao de GCPS-g2 (Figura 3). Portanto, o GCPS robustamente previu recorrência na fase II GC com ou sem tratamento pós-operatório. Com base nesses dados, pode-se especular que pacientes em estágio II de alto risco definidos pelo GCPS não ganhou um grande benefício de quimioradioterapia.

A expressão de genes prognósticos adversos em microambientes tumorais

Em todos 3 fase II coortes incluídos neste estudo, o aumento dos níveis de 4 genes de expressão de GCPS (Nox4, LAMP5, MATN3 e CLIP4) foram associados com mau prognóstico. Uma vez que as funções conhecidas destes genes sugerem a sua expressão em microambientes em vez de células tumorais reais, foi realizado o ensaio de nCounter para tumores microdissecadas contra componentes do estroma a partir de 4 tumores de alto risco representativos (Figura S11 no ficheiro S1). A expressão destes genes foi significativamente maior nos componentes do estroma, em comparação com as células cancerosas epiteliais, com Nox4 mostrando as diferenças mais acentuadas (p = 0,04).

Discussão

Em uma fase inicial de descoberta, realizamos WG-DASL em todos os pacientes estágio GC. Em seguida, com base nos dados WG-DASL, observamos que a segregação do grupo de alto risco do grupo de baixo risco foi mais significativo na fase inicial Ib /II pacientes (baixo vs alto risco estágio IB /II, 84,8% vs. 61,1%; fase de alto risco baixo vs. III /IV, 48,9% vs. 36,9%). Portanto, para o desenvolvimento do ensaio clínico e validação, focada no desenvolvimento de um gene-set que pode robustamente prever recorrência na fase II, os doentes. Nós desenvolvido e validado um algoritmo prognóstico para câncer gástrico, GCPS, que pode robustamente identificar grupos de alto risco de recorrência entre os pacientes fase II. GCPS, desenvolvido utilizando a plataforma nCounter, mostrou que o desempenho robusto em amostras de FFPE. Além disso, a inclusão de genes de referência internos permitiu a aplicação de GCPS para pacientes individuais. Portanto, sugerimos que GCPS pode ser facilmente aplicado para o uso clínico de rotina. O GCPS de 8 genes (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, Nox4 e TFDP1) foram descobertos e validados em mais de 700 pacientes GC fase II. Descobrimos que o GCPS identificados pacientes GC de alto risco para a recorrência de tratamento independentemente adjuvante e que os pacientes do GC de alto risco fase II mostrou DFS semelhante para a Fase III pacientes. Notavelmente, o GCPS previu recorrência de ambos os tipos Lauren (difuso ou intestinal) (Figura S8 no arquivo S1).

Nossos dados demonstram claramente a presença de heterogeneidade molecular em GC, que foi associado com resultados clínicos, mas independentes de informações estadiamento clínico-patológico. Nossos dados indicam que pacientes em estágio IB /II tinha muito mau prognóstico quando seus tumores expressa assinaturas genéticas com risco alto. Houve uma diferença de 23,7% em 5 anos DFS entre de alto risco e de genes de baixo risco assinaturas no estádio IB /II pacientes e 5 anos DFS da fase de alto risco IB /pacientes II era inferior a 60%, apesar da utilização de radioquimioterapia adjuvante (Figura 1). Portanto, pode ser necessário para projetar prospectivamente um julgamento a questionar se quimioradioterapia é necessário para estágio IB /II pacientes com perfis de expressão gênica de baixo risco. A fim de minimizar qualquer potencial viés de variações na prática clínica ou cirurgia em um único centro, foi realizada uma validação externa ad hoc da assinatura para validar a assinatura. Como mostrado nos resultados, a assinatura consistentemente previsto recorrência em Singapura coorte.

Entre os 8 genes finais GCPS (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, Nox4 e TFDP1), CDC25B e CDK1, os quais são conhecidos por estarem associados com a proliferação celular, foram correlacionadas com bom prognóstico (estimativas de regressão de Cox negativos na Tabela 2). Notavelmente, uma tendência similar foi observada para o cancro do cólon por um ensaio de expressão do gene [17], [18]. Estes resultados podem reflectir o estado de diferenciação destas células tumorais, uma vez que gástrico e mucosa de cólon normal de células epiteliais têm altas taxas de turnover. TFDP1 codifica o factor de transcrição DP-1, que actua como um regulador positivo da transição G1 /S do ciclo celular durante a [19], [20]. Particularmente no carcinoma hepatocelular, TFDP1 sobreexpressão foi substancialmente associado com a progressão da doença [19]. Desde o âmbito do presente estudo não inclui o estudo funcional desses genes, o seu significado biológico deve ser investigado em estudos futuros. Recentemente, Cho et al.
Realizaram o maior perfil de expressão gênica em 213 pacientes GC usando tecidos congelados frescos [21]. Eles identificaram 6 genes prognósticos (CTNBB1, EXOCS3, TOP2A, LBA1, CCL5 e LZTR1) para a sobrevivência do paciente após a ressecção curativa. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, GCPS é o único conjunto de genes que agora foi validado em mais de 700 fase II, os doentes GC, independentemente de classificação Lauren (difuso ou intestinal), um fator prognóstico conhecido, ou de tratamento adjuvante.

Em conclusão, com a utilização de uma abordagem de múltiplos passos, desenvolvemos 8-gene GCPS, que foi capaz de identificar de forma robusta GC pacientes de alto risco de recorrência da fase II após a cirurgia, independentemente do tratamento adjuvante. Atualmente, com o julgamento ARTISTA-II em curso (NCT
.761.461), pretendemos validar o nosso GCPS em um ensaio desenhado prospectivamente fase III.

Informações de Suporte
arquivo S1.
1. As características dos pacientes de grupos de estudo em cada etapa (Tabela S1). uma. Tabela S1. Características dos pacientes. 2. As características clínicas e patológicas de casos examinados em cada fase. 3. Descrição pormenorizada do passo de detecção utilizando o ensaio GT-DASL (passo 1). uma. Figura S1. QA dos dados WG-DASL. b. Tabela S2. Comparação de peixes e resultados IHC para o status HER2 no câncer gástrico no Passo 1. c. Tabela S3. Lista de sondas que são diferencialmente expressos entre os grupos de pacientes HER2-positivo e HER2 negativo no Passo 1. d. Tabela S4. Lista de todas as sondas com valores de p <univariadas; 0,01 no Passo 1. e. Figura S2. algoritmo Gradiente Lasso. f. Tabela S5. Lista de 26 sondas incluídas no modelo de previsão montado por todo o conjunto de dados (n = 432). g. Tabela S6. Multivariada Cox resultados da análise de regressão em conjunto descoberta do gene (n = 432). 4. Projeto de ensaio de expressão genética focado usando a plataforma nCounter. uma. Tabela S7. Lista de genes de referência para o ensaio nCounter. b. Figura S3. Correlação entre as taxas de risco de genes prognósticos baseados na normalização quantil e auto-normalização usando ensaio WG-DASL. 5. Ensaio nCounter e controle de qualidade. 6. Seleção de corte para câncer gástrico prognóstico Score (GCPS (Figura S4, S5, & S6) um valor S4 DFS análise de acordo com cada quartil de GCPS-g1 b Figura S5 Corte pontos para...... GCPS-g1. c. Figura S6. DFS de acordo com ponto de corte otimizada do GCPS-g1. 6. Distribuição de GCPS entre set descoberta e conjunto de validação. a. Figura S7. Distribuição de GCPS-g1 dentro da descoberta e validação set. b Figura S8 GCPS:... intestinal vs tipo difuso 7. Teste de utilidade clínica do GCPS-g2 em pacientes tratados apenas com cirurgia a Figura S9 DFS da II pacientes em estágio tratados com quimioradioterapia com base no quartil de GCPS-g2.... b. Figura S10. DFS de fase II, os doentes tratados com cirurgia sozinha com base em quartil de GCPS-g2. c. Figura S11. a expressão de genes prognósticos adversos incluídos no câncer gástrico prognóstico pontuação de acordo com compartimentos de tecido (tumor contra o estroma). expressão normalizada níveis são mostrados. d. Tabela S8. Lista de sondas nCounter incluído no GCPS-g2. 8. protocolo de estudo de validação O câncer gástrico. uma. Figura S12. Gástrica protocolo de estudo de validação do câncer
doi:. 10.1371 /journal.pone.0090133.s001
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