PLOS ONE: MicroRNA 135a Suprime Linfonodo Metástase através de regulação negativa dos ROCK1 em câncer gástrico precoce

Abstract

Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel fundamental na progressão do cancro gástrico e metástase. Este estudo investigou o papel de miRNA-135a no câncer gástrico precoce (EGC), incluindo nó de linfa (LN) metástase. Examinamos a correlação entre a expressão miRNA-135a e os resultados clínicos em 59 pacientes que se submeteram à cirurgia para EGC. Utilizando linhas de células de cancro gástrico, foi realizada análise funcional e do gene alvo. expressão miRNA-135a foi regulada em 33,9% dos pacientes. Estes doentes mostraram um estágio mais avançado de forma significativa (TNM stage≥IB, 35,0% versus 12,8%, p = 0,045) e maior taxa de metástases LN (30.0% vs 5.1%, p = 0,014) do que aqueles com a regulação positiva de expressão miRNA-135a. Numa análise multivariada, a regulação negativa de miRNA-135a foi um fator de risco independente para LN metástase (odds ratio ajustada, 8,04; 95% intervalo de confiança, 1,08-59,81; p = 0,042). análises funcionais utilizando linhas celulares de cancro gástrico mostrou que miARN-135a suprimida a viabilidade celular, a transição epitelial-mesenquimal, invasão celular, e a migração. ROCK1 foi alvo de miRNA-135.º e sua expressão foi inversamente correlacionada com a de miRNA-135a. expressão ROCK1 foi significativamente aumentada em pacientes com EGC LN metástase do que naqueles sem LN metástase. Os nossos resultados confirmam o papel tumor-supressora de miRNA-135a, e demonstrar o seu papel na LN metástase em EGC. miRNA-135a e seu gene alvo ROCK1
pode ser novos alvos terapêuticos e prognósticos para EGC

Citation:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et ai. (2014) MicroRNA 135a Suprime Linfonodo Metástase através de regulação negativa dos ROCK1 em câncer gástrico precoce. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 23 de novembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela concessão 1.110.532-3 a partir do Centro Nacional do Câncer, na Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. HA é um membro do conselho editorial PLOS e isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer gástrico continua a ser a segunda causa mais comum de mortalidade por cancro em todo o mundo, apesar de diminuir incidência e mortalidade nos países desenvolvidos [1 ].

Em áreas, incluindo a Coreia do Sul e Japão, onde triagem para câncer gástrico é realizada amplamente, a detecção precoce é muitas vezes possível. Porque um aumento da taxa de detecção precoce de câncer gástrico pode levar a um melhor prognóstico, participações em melhorar a qualidade de vida dos pacientes e utilizando tratamentos minimamente invasivos têm aumentado. Em pacientes com cancro gástrico, o nó de linfa (LN) metástase é um dos factores de prognóstico mais importantes, e a incidência geral de uma metástase LN no cancro gástrico precoce (EGC) varia de 5 a 20% [2] - [4].

Gastrectomia com LN dissecção é considerado o tratamento padrão para o cancro gástrico; No entanto, 80 a 95% dos pacientes com EGC não requerem uma dissecção LN se o cancro gástrico é completamente excisado por tratamentos menos invasivos, tais como ressecção endoscópica [5] - [7] ou cirurgia minimamente invasiva ( por exemplo
, ressecção em cunha simples ou cirurgia de navegação sentinela LN) [8] - [10]. Embora não tenham sido realizados estudos de marcadores prognósticos e preditivos biológicas para LN metástase em EGC, não existem ferramentas de previsão para a metástase nodal da EGC na verdade.

Vários estudos têm relatado que a profundidade da invasão, tamanho do tumor e invasão linfática são associado com a metástase em LN EGC [4], [11]. No entanto, a maioria destes factores foram determinados após um exame patológico final dos tecidos ressecados, que não é útil para determinar a estratégia de tratamento.

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs de codificação pequenas não proteicos. Estudos têm demonstrado que as alterações na expressão de miARN contribui para a patogénese de cancros, incluindo os de origem gastrointestinal [12] - [15].

miARNs têm também sido demonstrado ser útil na diferenciação de tecidos normais e de cancro [ ,,,0],16], [17]. Além disso, miARNs são expressos diferencialmente em cada fase da carcinogénese do cancro gástrico [18]. miRNA-27 [19] e da família miRNA-200 regulada por ZEB1 [20] têm demonstrado estar relacionada com a etapa de transição epitelial-mesenquimal (EMT) em câncer gástrico. Portanto, miARN pode ser associado com o processo de metástase em LN EGC. Entre miARN, miARN-135a tem sido mostrado para ser um supressor tumoral miARN, e a sua expressão é regulada negativamente em vários tipos de cancro incluindo o carcinoma das células renais [21] e linfoma [22]. Por sua vez, a sobre-expressão ou restauração da miARN-135a promove apoptose e suprime a proliferação de células tumorais por meio de seus genes alvo c-myc [de 21] e JAK2 [de 22], respectivamente. Em um in vitro
estudo, miRNA-135a suprimida actividades migratórias e invasivos de células cancerosas gástricas [23]. No entanto, o papel supressor tumoral de miRNA-135a no câncer gástrico não é claro.

O objetivo deste estudo foi verificar a correlação entre a expressão de miRNA-135a e os resultados clínicos em pacientes EGC incluindo LN metástase.

Materiais e Métodos

amostras de tecidos humanos e dados clínicos

Cinquenta e nove pacientes adultos com diagnóstico de EGC no Centro Nacional do Câncer, a Coreia, a partir de janeiro de 2011 a abril de 2013, foram prospectivamente incluídos em este estudo. Esses pacientes foram tratados com uma gastrectomia aberto ou assistidas por laparoscopia com D1 + ou mais dissecção LN. A extensão da LN dissecção seguido as recomendações do japonês câncer gástrico Association [24]. O estágio após a cirurgia foi avaliada de acordo com o 7 ^{ª edição do Comité Misto americana sobre o sistema de estadiamento do câncer de TNM [25]. tecidos humanos, incluindo tanto cancro gástrico e tecidos normais correspondentes de cada paciente, foram imediatamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. A partir da revisão de prontuários, características clínico-patológicas, incluindo idade, sexo, Helicobacter pylori
status, características do tumor, estágio e status de LN metástase foram obtidos e analisados. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Conselho de Administração do Centro Nacional do Câncer, Coreia do Institutional Review (NCCNCS-11-445).}

Cultura de células e transfecção

A linha gástrica humana normal das células epiteliais HFE145 [26], [27] foi um presente do Dr. Hassan Ashktorab e Duane T. Smoot (Universidade Howard, em Washington, EUA) e comercialmente disponíveis gástricas linhas celulares de cancro AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 e SNU719 foram obtidos a partir do celular Korea Line Bank (KCLB, Seoul, Coreia do Sul). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Entre as linhas celulares do cancro gástrico, linhas de células MKN28 e SNU668 foram seleccionadas porque eles raramente expressar miARN-135a, e linhas celulares YCC KATOIII e foram seleccionados porque eles têm uma expressão basal significativo de miARN-135a (Figura 1A). Transfecções com imita miRNA-135a (imita Mirvana ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, EUA), um inibidor de miRNA-135a (inibidor Mirvana ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, EUA), e ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- foram realizados UGBioneer, Seul, Coreia) em SNU668, YCC2, MKN28, e linhas celulares utilizando Lipofectamina KATOIII RNAiMAX e reagentes Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante; 3 '. MKN28, SNU668, YCC2, e KATOIII linhas de células foram recolhidas dois dias após a transfecção, e foram realizadas várias análises.

extracção de ARN e miARNs quantificação

O ARN total foi isolado a partir de 13 linhas celulares e 59 tecidos dos pacientes com cancro gástrico, respectivamente, utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Utilizou-se o kit de PCR TaqMan universal reagentes master mix (Applied Biosystems, Tóquio, Japão). A amplificação e a detecção foram realizadas utilizando um sistema 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, Tóquio, Japão) com 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C (15 segundos) e emparelhamento /extensão a 60 ° C (60 segundos). Isto foi precedido por transcrição reversa a 50 ° C durante 30 minutos e desnaturação a 95 ° C durante 10 minutos. Para quantificar miRNAs maduros, TaqMan microRNA Assays kits (Applied Biosystems, Tóquio, Japão) foram utilizados para a detecção de miRNA-135a e um controle de miRNA (RNU6B).

Ocidental análise de mancha

A proteína foi extraiu-se a partir de 13 linhas celulares e 59 amostras de tecido dos pacientes EGC usando tampão RIPA (Biosesang, Seul, Coreia), incluindo um cocktail inibidor de protease (Sigma, St. Louis, MO, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, transferência de Western foi efectuada utilizando anti-ROCK1 e anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) anticorpos. Os sinais foram detectadas com um kit ECL privilegiada (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

ensaios de proliferação celular

A proliferação celular foi medida utilizando um ensaio MTT. As células foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços (3 x 10 ^{3 células por poço) e transfectadas com imita miARN-135a depois de dois dias de incubação. Subsequentemente, a 200 ul de MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, EUA) foram adicionados a cada poço. Depois de quatro horas de incubação adicional, as soluções de MTT foram descartados, 200 ul de DMSO (Amresco, Solon, OH, EUA) foram adicionados a cada poço e a placa foi agitada suavemente. A absorvância foi medida num leitor de ELISA (Moecular Devices, Sunnyvale CA, EUA) a um comprimento de onda de teste de 570 nm.}

ciclo celular análise

As células foram plaqueadas em placas de cultura de 60π e transfectadas com miARN -135 imita ou um imita miRNA controle negativo (imita-NC). Estas células foram colhidas por tripsinização e fixadas em etanol a 70% durante pelo menos duas horas à temperatura de -20 ° C. Os sedimentos celulares foram lavados com solução salina fria tamponada com fosfato e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente em PI /RNase de Tampão de Coloração (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA). Após a coloração, as amostras foram analisadas com um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e 10.000 eventos foram recolhidas por amostra. Os dados da citometria de fluxo foram analisados ​​usando o software celular Quest (Becton Dickinson, San José, CA, EUA). Os ensaios de

migração trans-filtro e invasão

As células foram transfectadas com imita miARN-135a , inibidores de miARN-135a, ROCK1 siRNA, e controlo ROCK1 siARN negativo (pARNc) durante um dia e, em seguida, transferida para a câmara superior da placa de Transwell revestidas com 0,5 mg /ml de colagénio tipo I (BD Bioscience, Bedford, MA, EUA) e uma diluição de Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, EUA) 01:15. RPMI 1640 com 10% FBS e 1% de antibióticos (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) foi adicionada à câmara inferior e a placa de incubação foi de 20 horas. Migram e invadem as células foram quantificados usando hematoxilina e eosina.

As construções plasmídeo repórter luciferase

O tipo selvagem 3 'UTR de ROCK1 contendo sítios de ligação para miRNA-135a foi amplificada utilizando gDNA de SNU668 células como um modelo. As construções mutantes foram correlacionados criado por mutação das regiões de semente de os sítios de ligação de miARN-135. Tanto o tipo selvagem e mutante UTR 3 'foram clonados no jusante do gene da luciferase em pGL3 um vector controlo. As construções foram verificadas através de sequenciação.

ensaio da luciferase

Os ensaios de luciferase foram realizados em células SNU668 e YCC2. células SNU668 e YCC2 foram transfectadas com cada um dos plasmídeos (vector vazio [MOCK], ROCK1 UTR 3 'do tipo selvagem [WT], e ROCK1 3' UTR mutante [MUT], como um local de ligação de miARN-135a), em conjunto com miRNA- 135a imita, inibidores de miARN-135a, e o ARN de controlo negativo em placas de 24 poços. Dois dias após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas. Os ensaios de luciferase foram realizados em lisados, utilizando um kit de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA). A actividade da luciferase foi normalizada para p-galactosidase.

imuno coloração

imuno-histoquímica (IHQ) coloração foi realizada em 20 casos representativos de grupos de baixa e alta expressão Rock1. A recuperação de antígenos foi feito com um tratamento térmico durante 30 min em tampão de pH 8,0 de Tris-EDTA (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, EUA) a 95 ° C. lâminas de tecido foram incubadas a 42 ° C durante 30 min com o mAb anti-ROCK1 (ab134181, EPR638Y clone, monoclonal de coelho, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, EUA). Os controlos negativos foram utilizados de forma idêntica com IgG de coelho não imunizado. Os resultados foram interpretados por um patologista experiente (MC Kook).

A análise estatística

escala de dados são dados como média desvio ± padrão (SD). Qui-quadrado ou teste exato de Fisher eo teste de Mann-Whitney foram utilizados para comparar variáveis ​​categóricas e variáveis ​​contínuas, respectivamente. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para comparar o padrão de expressão de genes entre miRNA-135a e ROCK1. Um modelo de regressão logística multivariada foi utilizada para determinar fatores independentes associados à LN metástase. Co-variáveis ​​que foram significativas usando teste exato de Fisher qui-quadrado ou ( P Art < 0,05) foram inseridos no modelo de regressão logística. Todos os dados foram analisados ​​em Stata 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, EUA). A valor P
inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

níveis de expressão de miRNA-135a estão associados com a progressão e metástase em LN EGC

Um estudo anterior mostrou que a expressão de miRNA-135a é regulada negativamente em linhas celulares de cancro gástrico [23]. Ao utilizar qRT-PCR, nós também descobrimos que a expressão de miARN-135a é regulada negativamente em várias linhas celulares de cancro gástrico em comparação com o que, em uma linha de células epiteliais gástricas normais (Figura 1A).

Contudo, a correlação entre expressão miRNA-135a e os resultados clínicos em câncer gástrico não foi investigada. Portanto, medimos os níveis de expressão de miRNA-135a no cancro gástrico primário e seus níveis correspondentes em tecidos normais de 59 pacientes com EGC. Jusante e a sobre-regulação de genes em tecidos de tumor em relação aos tecidos normais foram definidos como a proporção de tumor para os níveis normais de expressão de genes de tecido de < 1,0 e >. 1.0, respectivamente

Inversamente ao resultado de in vitro
experiência, apenas 20 (33,9%) dos 59 pacientes com EGC exibiu down-regulação da expressão do miRNA-135a. No entanto, esses pacientes apresentaram significativamente um estágio mais avançado (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; bruto relação estranha [OR], 2,11; 95% intervalo de confiança [IC], 1,08-4,10) e um mais elevada taxa de metástases LN (30.0% vs 5.1%, p = 0,014; OR bruto, 2,73; IC de 95%, 1,50-4,98) do que aqueles com a sobre-regulação da expressão de miARN-135a (Tabela S1). A sensibilidade e especificidade do estatuto de expressão miRNA-135a para a previsão de LN metástases eram 75,0% e 72,5%, respectivamente. Além disso, os pacientes com mais estágio avançado (Figura 1B) ou LN metástases (Figura 1C) mostrou uma proporção significativamente mais baixa de tumores aos níveis normais de expressão de miARN-135a do que aqueles com estágio IA ou sem metástases LN. Uma análise de regressão logística multivariada mostrou também que miRNA-135a para baixo-regulação foi independentemente associada com LN metástase (OR ajustado, 8,04; IC 95%, 1,08-59,81; p = 0,042; Tabela 1). Colectivamente, estes resultados sugerem que a infra-regulação da expressão de miRNA-135a pode estar associada com a progressão do cancro gástrico incluindo LN metástase.

miRNA-135a suprime a viabilidade das células de câncer gástrico, EMT, migração e invasão

para investigar ainda mais a associação entre miARN-135a e os resultados clínicos, realizamos ensaios funcionais para a viabilidade celular, ciclo celular, EMT, migração e invasão em linhas celulares de cancro gástrico. A sobre-expressão de miARN-135a por imita miARN-135a suprimiu significativamente a viabilidade celular (Figura 2A) e aumentou a fracção subdiploid de SNU668 células, uma linha celular que raramente expressa miARN-135a (Figura 2B), sugerindo que o aumento da apoptose de células de cancro gástrico. No entanto, a supressão de miARN-135a por inibidores de miARN-135a induzida nem um aumento da viabilidade celular, nem uma diminuição na fracção subdiploid YCC2 células, de uma linha celular que expressa miARN-135a substancial (Figura 2A e 2B). Também foi investigada a associação entre a expressão miRNA-135a e EMT em células de câncer gástrico, porque miRNA-135a para baixo-regulação foi um fator de risco independente para LN metástases em pacientes EGC (Tabela 1). A expressão aumentada de miARN-135a foi associada à supressão da EMT e mostraram um aumento na expressão da caderina-E e a supressão de ambos N-caderina e Slug em SNU688 células. Em contraste, a inibição da expressão de miARN-135a resultou na activação de EMT incluindo a supressão da expressão de E-caderina e a sobre-regulação de ambos N-caderina e Slug YCC2 em células (Figura 2C). Na avaliação de consequências funcionais, a superexpressão de miRNA-135a por imita miRNA-135a suprimiu significativamente a capacidade de migração e invasão de SNU668 células cancerosas gástricas (Figura 2D). Por outro lado, o bloqueio de miRNA-135a por inibidores de miRNA-135a aumentou significativamente a migração e invasão de YCC2 células cancerosas gástricas (Figura 2E). No geral, nossos resultados sugerem que o miRNA-135a é um regulador supressor tumoral para a proliferação do câncer gástrico e metástase.

ROCK1 é um gene alvo de miRNA-135a no cancro gástrico

Para elucidar os mecanismos subjacentes os efeitos do miRNA-135a sobre os resultados clínicos, buscamos alvos putativos usando o banco de dados TargetScan 6.2. De 718 alvos conservadas, foram selecionados alvos com maior pontuação cuja infra-regulação pode resultar em aumento da proliferação de células cancerosas, migração e invasão. Descobrimos que ROCK1 pode ser um gene alvo de miARN-135a, porque a inibição ou supressão de ROCK1 foi reportado para promover a apoptose e para suprimir a migração, invasão e proliferação de células cancerosas incluindo as do cancro gástrico [28] - [30]. TargetScan análise revelou que a sequência de 3 'UTR da ROCK1 tem um possível local de ligação para miARN-135a (Figura 3A). Para confirmar se ROCK1 é um alvo de miARN-135a, foi realizado um ensaio da luciferase. As construções 3'UTR luciferase descritos na secção de métodos foram co-transfectados em células com SNU688 imita miARN-135a e em células com inibidores de miARN YCC2-135a. Nós também construído ROCK1 3'UTR MUT por mutação pontual C → G no sítio de ligação possível (Figura 3A). A actividade de luciferase relativa do ROCK1 3'UTR WT foi significativamente aumentada na presença de inibidores de miARN-135a (Figura 3B). Por outro lado, esta actividade foi significativamente diminuída na presença de imita miARN-135a (Figura 3C). Em linhas celulares de cancro gástrico, miRNA-135a e ROCK1 mostrou um padrão de expressão adversária. A análise Western blot mostrou que a expressão ROCK1 foi regulada para baixo, na presença de imita miARN-135a, e supra-regulados na presença de inibidores de miARN-135a (Figura 3D e 3E). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o miRNA-135a suprime a expressão ROCK1 diretamente pela segmentação sua 3'UTR.

A expressão de ROCK1 é inversamente correlacionada com a de miRNA-135a em pacientes com EGC

Análise de 59 pacientes com EGC mostrou que os níveis de expressão ROCK1 tinha uma correlação negativa significativamente com os de miARN-135a (r = -0,697, p < 0,001; Figura 4A). Além disso, os pacientes com a sobre-regulação da expressão de miARN-135a tinham níveis significativamente mais baixos de expressão de proteína ROCK1 do que aqueles com a sub-regulação de miARN-135a (média do tumor a taxa normal, 0,81 vs 1,55, p < 0,001; Figura 4B) .

ROCK1 está associada com LN metástase em EGC e está envolvida na migração de células de câncer de estômago e invasão suprimida por miRNA-135a

Para melhor avaliar a relação entre a expressão ROCK1 e os resultados clínicos em EGC, analisou-se os padrões de expressão ROCK1 em referência ao estado metástases LN dos pacientes incluídos. Os pacientes com metástases LN tinha uma expressão significativamente mais elevada de proteína ROCK1 do que aqueles sem metástases LN (média do tumor a taxa normal, 1,86 vs. 0,93; p = 0,007; Figura 5A). Além disso, os níveis de coloração IHC ROCK1 foram semelhantes aos da expressão ROCK1 na análise de Western Blot ( ie
, LN pacientes sem metástases tinha fracos padrões de coloração IHC Figura 5B [], mas aqueles com LN metástases tinha forte coloração IHC positiva [Figura 5C]).

Finalmente, para investigar se as habilidades migração e invasão suprimidos conferidos pelo miRNA-135a-regulação observada em linhas celulares de cancro gástrico foram o resultado de ROCK1-regulação, foi realizada a migração e ensaios de invasão utilizando linhas celulares de cancro gástrico transfectadas com específica ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNA suprimida actividades migratórias e invasivos em SNU668 células (Figura 5D). Em células YCC2 co-transfectadas com inibidores de miARN-135a e ROCK1 siRNA (Figura 5E), ensaios de migração e invasão mostrou que a inibição de ROCK1 por ARNsi atenua significativamente o reforço efeitos migratórios e invasivos de miARN-135a a sub-regulação por inibidores de miARN-135a (Figura 5F).

Colectivamente, estes resultados sugerem que ROCK1 está associado com a metástase em pacientes LN EGC, e que esta resulta de um aumento da expressão ROCK1 no contexto de miARN-135a a sub-regulação. Portanto, ROCK1 podem estar envolvidos na miRNA-135a-suprimida a metástase do câncer gástrico.

Discussão

No presente estudo, descobrimos que miRNA-135a teve tumorais funções supressoras no câncer gástrico. Em pacientes com EGC, down-regulação do miRNA-135a foi um fator de risco independente para LN metástase. Em células cancerosas gástricas,-regulada miRNA-135a suprimida carcinogênese gástrica pela proliferação suprimindo celular, EMT, e metástase. Além disso, também identificado um novo gene alvo de miARN-135a, ROCK1, o que foi associado com a metástase LN no cancro gástrico.

Em pacientes com EGC, a avaliação de LN metástase antes do tratamento é um passo importante na determinação de estratégias de tratamento. tratamentos menos invasivos, tais como ressecção endoscópica [5] - [7] ou cirurgia de navegação sentinela ln [9], [10] pode ser possível em pacientes sem EGC LN metástase. Essas abordagens de tratamento têm melhorado a qualidade de vida dos pacientes em relação a complicações tardias associadas a tratamentos cirúrgicos convencionais, incluindo síndrome de dumping, perda de peso e sintomas relacionados com refluxo [31]. Portanto, os biomarcadores sensíveis e mais específicos são necessários para prever o estado de LN metástases em doentes com EGC. No presente estudo, o miRNA-135a para baixo-regulação era um fator independente para LN metástase, eo valor de predição do estado de expressão miRNA-135a foi relativamente alta, com uma sensibilidade de 75% e uma especificidade de 73%. Embora sejam necessários novos estudos de validação, estes resultados mostraram que a medição dos níveis de miRNA-135a antes de determinar o plano de tratamento para pacientes EGC poderia ser um teste útil para predizer o estado LN.

Curiosamente, miRNA-135a tem sido relatada para ser supressora de tumor e oncogénica. A sobre-expressão de miARN-135a tem sido associada com a supressão da proliferação do tumor e crescimento do carcinoma de células renais [21] e com um aumento da apoptose e melhor sobrevivência livre de doença em linfoma [22]. Em contraste, o miRNA-135a foi envolvido no cancro colorectal progressão [32] e no aumento da migração de células da mama e da invasão [33]. No presente estudo, miARN-135a foi demonstrado ser um supressor tumoral miARN, que está em concordância com o resultado de um estudo anterior [23]. Especialmente, a maior expressão de miRNA-135a suprimiu várias etapas da carcinogênese gástrica, incluindo proliferação, migração e invasão. Além disso, também descobrimos que miARN-135a pode suprimir EMT, que relatou a ser associado com a iniciação do processo de passos múltiplos da carcinogénese e promoção da metástase [34], [35]. Antes do presente estudo, a relação entre miRNA-135a e EMT não foi investigado, apesar de estudos anteriores mostraram que os miRNAs como miRNA-27 [19], o miRNA-200 da família [20], miRNA-7 [36] e miRNA-1228 [37] suprimir EMT através de seus próprios genes alvo em câncer gástrico. Tomados em conjunto, miRNA-135a é um supressor tumoral miRNA no câncer gástrico.

Um estudo anterior analisando 353 humanos tecidos com cancro gástrico mostrou que os padrões de miRNAs de expressão são diversas e que alguns miRNAs foram associados com a progressão e prognóstico em gástrica cancro [14]. No estudo, miARN-135a foi classificado como um miARN oncogénicos no cancro gástrico, com base nos resultados de análises de DNA microarray. No entanto, numa recente [23] e o nosso estudo, miARN-135a actuou como um supressor de tumor, apesar da elevada taxa de pacientes com miARN-135a sobre-regulação. Embora muitos pacientes (66%) apresentaram-regulação de miARN-135a semelhante ao resultado de um estudo anterior [14], estes pacientes mostraram um estágio avançado significativamente menor e uma menor taxa de metástases LN. Além disso, in vitro
estudos adicionais também mostraram que uma maior expressão de miRNA-135a foi associada à supressão da carcinogênese gástrica. Estes resultados sugerem que os padrões de miRNAs de expressão pode ser diferente de resultados clínicos e, portanto, para confirmar as funções exatas de miRNAs específicos, são necessários mais estudos.

ROCK1 é um membro da Rho-associado de serina /treonina família de cinases, que funciona como um regulador central da actina organização do citoesqueleto e dinâmica [23], [38]. ROCK1 tem uma gama diversa de funções na tumorigénese, incluindo migração, invasão e metástase [28]. ROCK1 é alvo de vários miRNAs em vários tipos de câncer, incluindo miRNA-584 em carcinoma de células renais [39], o miRNA-335 em neuroblastoma [40], e miRNA-146a no câncer de próstata [41]. No cancro gástrico, ROCK1 foi positivamente correlacionada com a metástase e LN fase TNM [42], e está envolvido na supressão induzida por miARN-148a da migração celular e invasão do cancro gástrico [30]. Além disso, ROCK1 inibidor promoveu a apoptose em células de cancro gástrico [29]. No presente estudo, descobrimos que ROCK1 é alvo de miRNA-135a no câncer gástrico e sua expressão está positivamente associada com LN metástases em pacientes EGC. In vitro
experimentos também mostraram que ROCK1 está envolvido na motilidade celular câncer gástrico e invasão. Estes resultados sugerem que ROCK1 pode ser um alvo terapêutico novo com a capacidade para inibir a metástase do cancro gástrico.

Em conclusão, nós identificamos miARN-135a como um novo biomarcador de prognóstico para LN metástases em doentes com EGC e demonstraram que miRNA-135a suprimida carcinogênese gástrica ( ou seja
, proliferação, EMT, e metástase em linhas celulares de cancro gástrico), visando ROCK1. Embora estes resultados necessitam de validação em outros grupos de pacientes independentes, eles sugerem que miRNA-135a e sua ROCK1 gene alvo pode ser um novo biomarcador e alvo terapêutico para câncer gástrico com LN metástase.

Informações de Apoio
Tabela S1 .
características clínico-patológicas de pacientes com câncer gástrico precoce de acordo com o status de expressão miRNA-135a
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

• PLOS ONE: associação entre os polimorfismos no gene XRCC1 e Tratamento resultados de pacientes com cancro gástrico avançado: uma revisão sistemática e meta-Analysis
• PLOS ONE: Segmentação Caderina-17 inactiva Ras /Raf /MEK /ERK sinalização e inibe a proliferação celular no câncer gástrico