PLOS ONE: exome Sequencing Identifica gástrico precoce Carcinoma como um estágio inicial de câncer gástrico avançado

Abstract

carcinoma gástrico é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. detecção e tratamento precoce leva a um excelente prognóstico em pacientes com câncer gástrico precoce (EGC), enquanto que o prognóstico de pacientes com câncer gástrico avançado (AGC) continua pobre. Não está claro se EGCS e AGCs são entidades distintas ou se EGCS são os estágios iniciais de AGCs. Realizamos todo exome seqüenciamento de quatro amostras de pacientes com EGC e compararam os resultados com os de AGCs. Em ambos os EGCS e AGC, um total de 268 genes foram comummente mutado e mutações independentes foram adicionalmente encontradas em EGCS (516 genes) e AGC (3104 genes). A maior frequência de C > transições G foi observada no tipo intestinal em comparação com difusa do tipo carcinomas ( P
= 0,010). O DYRK3, GPR116, Mcm10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
e UNC5C
genes são recorrentemente mutado em EGCS e podem estar envolvidas na carcinogénese início

Citation:. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J, et al. (2013) exome Sequencing Identifica gástrico precoce Carcinoma como um estágio inicial de Câncer Gástrico Avançado. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10.1371 /journal.pone.0082770

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 17 de julho de 2013; Aceito: 27 de outubro de 2013; Publicação: 23 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (2012-P4KR 003) e uma subvenção Instituto de Pesquisa Biomédica Samsung (# SBRI-SP1B20111). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. KW é empregado por Pfizer Inc. No entanto, isso não altera a adesão do autor de todas as políticas PLoS ONE sobre os dados e materiais de partilha. Os autores declararam que não existem outros interesses concorrentes.

Introdução

carcinoma gástrico (CG) é uma doença heterogênea, com múltiplas etiologias ambientais, vias alternativas de carcinogênese e não de alta-frequência conhecida perturbação oncogênico [1], [2], [3]. A classificação Lauren tem se mostrado útil na avaliação da história natural da GC, especialmente no que diz respeito às tendências de incidência, correlações clínico-patológicas e precursores etiológicos [4]. Lauren classificados adenocarcinoma gástrico para intestinal e difuso de acordo com características morfológicas do tumor [4], [5], [6]. carcinomas do tipo intestinal são acreditados para surgir secundariamente à gastrite atrófica crónica associada com H. pylori Comprar e metaplasia intestinal [7]. Difuso tipo GC não estão associados a metaplasia intestinal e podem surgir a partir de mutações de uma única célula dentro de glândulas gástricas normais [4], [8], [9].

GC é uma das principais causas de Câncer relacionados com a mortalidade em todo o mundo. detecção e tratamento precoce resulta em um excelente prognóstico para pacientes com câncer gástrico precoce (EGC), ao passo que o prognóstico de pacientes com câncer gástrico avançado (AGC) continua sendo ruim. No entanto, não está claro se EGCS e AGCs são entidades distintas ou são do mesmo tumor progredindo desde o início para estágios avançados [10]. As assinaturas moleculares que distinguem EGC da AGC são importantes para auxiliar na identificação de novos marcadores prognósticos e possíveis alvos terapêuticos.

Recentemente, exome seqüenciamento em 22 [11] e 15 [12] amostras AGC mostrou mutações de inactivação frequentes na adesão celular e cromatina-remodelação genes, e as alterações genéticas diferiu entre os subgrupos estratificados por vírus Epstein-Barr (EBV) ou H. pylori
infecção e status de instabilidade de microssatélites (MSI). Para explorar ainda mais as alterações genéticas GCs subjacentes, realizamos toda exome sequenciamento em quatro pares de EGC e tecido normal, e compararam os resultados com os de AGCs.

Materiais e Métodos

A preparação das amostras

Tumor e tecidos gástricos não neoplásicas foram coletados a partir de amostras gastrectomia. O presente estudo foi realizado após a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Samsung Medical Center, e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito antes da cirurgia. Para amostras de tumores, massas eram > 4 cm na inspeção bruta, ea mucosa superfície de cada tumor foi adquirido. Após a incorporação em meios de outubro, o tecido foi cortado e H & E coradas. As amostras de > 90% de conteúdo de tumor foram seleccionados para a extracção do ADN com um Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e tratados com ARNase A para remover o ARN remanescente. ADN foi também extraído do tecido gástrico afectada emparelhado, o qual foi obtido distante do local do tumor e confirmado para ser livre de tumor. MSI foi analisada com cinco marcadores NCI como anteriormente descrito [13]. A presença de vírus foi detectado por ARN codificados pelo EBV In situ
hibridação como anteriormente descrito, e apenas os casos com sinal forte dentro de quase todos os núcleos celulares tumorais foram considerados positivos [14]. Detalhes adicionais para as amostras EGC são fornecidos na Tabela 1.

enriquecimento exome e sequenciamento

Foram preparadas exome enriquecimento (Kit SureSelect All Human Exon, Agilent Technologies) e bibliotecas de seqüenciamento Illumina acordo com o fabricante do instruções. Em resumo, 3 ug de ADN genómico foi cisalhada com o sistema Covaris S2; os fragmentos de DNA foram reparadas-fim, estendido com um "A" de base na extremidade 3 ', ligado com adaptadores de extremidade-emparelhado e amplificado (quatro ciclos). Exome contendo bibliotecas ligado ao adaptador foram hibridados durante 24 h com iscos de oligo de ARN biotinilados e enriquecido com esferas magnéticas com estreptavidina conjugada. As bibliotecas finais foram mais vincada 11 ciclos de PCR e submetidos a Illumina seqüenciamento em uma pista do sequenciador HiSeq 2000 com um tamanho de inserção direccionada de ~180 pb. Toda a sequenciação foi executado com emparelhado-end 65 pb lê e foi realizada de acordo com protocolo padrão de Ilumina. Em média, ~136.3 milhões de pureza filtrou-leituras foram gerados para cada amostra. A porcentagem média de duplicata lê devido a PCR e artefatos ópticos foi de 0% em nosso conjunto de dados, e ~123.7 milhões mapeados exclusivamente lê foram obtidos para cada amostra. Em média, 69,1% de leituras em cada amostra tinha pelo menos 50% de sobreposição com qualquer região alvo ± 100 bp na biblioteca exome isca SureSelect todo. As regiões-alvo em cada amostra foram sequenciadas a uma profundidade média de 113,7 ×, com ~98.8% das regiões-alvo coberta ≥1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × e ~50.8% ≥ 100 ×. resumos detalhados de qualidade de dados brutos estão descritos na Tabela S1. Para efeito de comparação, o mesmo algoritmo (SMART), utilizado no conjunto de dados anterior de amostras AGC [11], foi aplicada a estes dados para identificar variações e inserções /deleções (Indels) as alterações a partir de dados de sequenciamento de curto leitura somáticas de nucleotídeo único. O conjunto de dados foi depositado na Nucleotide Archive Europeu e pode ser acessado no http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

As mutações detectadas pelo sequenciamento exome foram ainda mais validada por PCR e seqüenciamento Sanger. Resumidamente, os iniciadores foram concebidos utilizando o software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu), e as sequências estão listadas na Tabela S3. Os produtos amplificados por PCR foram então sequenciados utilizando um ciclo v3.1 Kit Big Dye Terminator Sequencing e um sequenciador automático ABI 3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Resultados

Somatic alterações na eGCS

no total, 2.389 mutações somáticas foram identificadas nas quatro amostras EGC, dos quais 1.117 ocorreram em regiões ou locais de splicing essenciais (627 missense, 32 sem sentido, 10 local de união essencial, 169 indels e 279 de codificação sinónimo) (Figura 1, e as tabelas 2 e S2). Um GC com MSI-alta teve 727 mutações não silenciosas incluindo genes de reparo ( MSH6
e MSH3
), enquanto que os três estável microssatélite (MSS) amostras tinham uma média de 37 anos, diferença de aproximadamente 20 vezes. Os rácios nonsynonymous-a-sinónimo nos cancros MSS tendeu a ser maior do que a do MSI de alta cancro, mas a diferença não foi estatisticamente significativa. C > T e G > A transições foram a mutação mais comum (61%) na EGCS, e não houve diferença significativa em mudanças individuais de pares de bases entre os cancros MSS (Figura 2A e na Tabela S4) MSI-alta e. Dos 784 genes com mutações não silenciosas, 13 foram mutados em amostras de dois ou mais. Estes genes incluídos conhecidos por serem envolvidos na carcinogênese gástrica ( TP53
) e relatados no Catálogo de Somatic Mutações em Câncer (COSMIC) a ser mutado em GCs ( DYRK3, Mcm10, PCDH17 Comprar e UNC5C
) (Tabela 3). Dos genes selecionados para validação, PCDH17
mutação foi provavelmente não validado pelo método de Sanger por causa de baixas frequências de alelo mutante (Tabela S3). Curiosamente, em um EGC-tipo difuso com MSI-alta, um EGFR
(c.2224G > A, p.V742I). Mutação foi identificada

Comparação entre EGC e AGC

Para a comparação dos nossos resultados no EGC com os de AGCs, foram utilizados dois dados de sequenciamento toda exome recentemente publicados [11], [12]. Wang et al
. detectados 164 não silenciosa e 48 mutações sinônimas, em média, em 22 amostras de AGC com 116 × profundidade média de cobertura [11]. Zang et al
. detectados, em média, 50 não-silencioso e 16 mutações somáticas sinônimas em 15 amostras AGC com 96 × profundidade média de cobertura [12]. Em comparação directa entre os quatro EGCS e 37 AGC, não houve diferença significativa nos números de tipo mutação (Figura 1). As únicas mudanças de pares de bases em EGCS foram semelhantes a um relatório anterior por Wang et al
. [11], mostrando uma distintamente maior número de C > T e G > A transições, tanto MSS e tumores MSI-elevadas (Figura 2A e Tabela S4). Curiosamente, C > transições G foram mais comuns em intestinal-tipo do que em GCs do tipo difuso em todas as amostras MSS que incluíram três EGCS e 18 AGCs (Wilcoxon rank sum, P
= 0,010) (Figura 2B e Tabela S4).

em 37 AGC e 4 amostras de EGC, as mutações não silenciosas (missense, absurdo, do site emenda essencial e indels) foram detectadas em 3.372 e 784 genes, respectivamente. Em ambos os EGCS e AGC, 268 genes foram comummente mutado; BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI
e TP53
genes foram mutados em pelo menos duas amostras de EGC, e ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22 Comprar e genes TTN
, bem como outros, foram significativamente associados com AGCs com uma taxa de detecção falsa de < 0,2 [11], [12] (Figura 3). análise de anotação funcional usando DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) para examinar os genes encontrados sobreposição entre os dois conjuntos de amostras revelou que os termos significativamente enriquecidos incluídos actina, citoesqueleto, projeção de células e junção célula-célula (Tabela S5).

Discussão

Apesar de sequenciamento toda exome foi relatado por 37 amostras AGC [11], [12], não houve tal estudo para avaliar a carcinogênese início no nível genético. Para explorar o repertório completo de mutações somáticas em EGCS, realizamos toda a sequenciação exome de quatro amostras EGC emparelhados, e encontraram assinaturas genéticas distintas e comuns entre EGCS e AGCs que possam identificar genes envolvidos na carcinogênese início e progressão subsequente.

cancros epiteliais têm frequentemente variável apontar mutação espectros a determinados estímulos mutagénicos [15], [16]. Por exemplo, as altas taxas de A > C e C > foram observadas transições de T em adenocarcinomas esofágicas e melanomas expostas ao sol, respectivamente, o que sugere que estas mutações são atribuíveis ao refluxo gastroesofágico e exposição aos raios ultravioleta [15], [17]. Um estudo de sequenciação de todo o genoma anterior em dois adenocarcinomas gástricos mostrou frequente C > A e T > A alterações em comparação com os genomas normais [18]. Aqui, encontramos frequente C > transições G em carcinomas do tipo intestinal comparação a difundir-tipo GCs após exclusão de MSI-altos GCs. Nossos garante observação únicas futuros estudos para definir a etiologia específica que potencialmente contribui para a compreensão das vias moleculares complexas e mal compreendidos de GCs do tipo intestinal.

Através da análise comparativa, foram identificados 268 genes sobrepostos com mutações não silenciosas compartilhados por ambas as eGCS e AGC (Figura 3). Cerca de um terço das mutações não silenciosas em EGCS são compartilhados com AGC e 8% das mutações não silenciosas encontrados em AGC são compartilhados com EGCS. Um estudo anterior com análise de expressão do gene mostraram que a maioria das alterações associadas com EGCS são mantidas em AGC e outras alterações de expressão marcar a transição de EGC para AGC [10]. Em geral, esses resultados indicam EGC que representa uma fase precoce molecular de AGC, e os genes mutados comumente desempenham papéis importantes na progressão de EGC para o AGC. Nós reconfirmou que TP53
é o gene mais frequentemente mutado em GCs, com a TP53
mutações encontradas em metade dos EGC e dois terços das amostras AGC. Entre os genes que se sobrepõem, AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A
e RPL22
foram anotados como oncogenes, enquanto que ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2
e TP53
eram genes supressores de tumor pelo gene Census Sanger (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). Dos genes do Censo Câncer, que pela primeira vez identificado um EGFR
mutação (c.2224G > A, p.V742I) de forma difusa do tipo EGC com MSI-alta. Em um estudo recente sobre 63 MSI-alta GCs, EGFR
mutação não foi detectada por sequenciação directa do domínio quinase (exons 18, 19, 20 e 21) [19]. A mesma mutação V742I tem sido relatada em um paciente com cancro do endométrio e de uma linha de células de glioma de [20], [21]. O significado clínico desta mutação rara precisa ser validado em um futuro próximo.

Embora a prevalência de mutações recorrentes em EGCS foi relativamente baixa, 13 genes foram mutado em pelo menos duas amostras, e teve muito poucos sinónimo, mutações intrônicas e /ou não traduzidas. Entre estes 13 genes, DYRK3, GPR116, Mcm10, PCDH17, PCDHB1, RDH5
e UNC5C
pode ser específica para GC fase inicial, sugerindo um possível papel no início da carcinogênese. Em nossa série, PCDH17
mutações ocorreram em GCs do tipo intestinal com MSS, incluindo uma amostra EBV-positivo. análises genômicas globais anteriores do colo e pancreáticos cancros também revelou mutações missense em alguns membros da PCDH
(protocadherin) subfamílias [22], [23]. No entanto, as mutações detectadas nas nossas EGCS Ilumina por sequenciação não foram confirmados por sequenciação de Sanger, provavelmente porque as frequências de alelos mutantes eram muito baixos. UNC5C
pertence à família dos receptores dependência funcional, cujos membros partilham a capacidade para induzir a apoptose na ausência de seus ligandos [24], [25]. metilação aberrante deste gene tem sido relatada no decurso da carcinogénese gástrica, e esta metilação desapareceu em GC altamente avançadas [26]. Para os restantes genes, a sua relevância funcional em GC permanece obscura.

A perda da função de moléculas de adesão celular aumenta a capacidade das células tumorais para invadir tecido circundante, e a disfunção no complexo-remodelação da cromatina promove a instabilidade cromossómica que impulsiona a tumorigénese [27]. Nenhuma das nossas amostras EGC tinham mutações que alteram a proteína de genes-cromatina remodelação encontrados em AGCs, tais como ARID1A, MLL3, PBRM1
e MBD2
[11], [12], a cromatina sugerindo modificação ocorre atraso na progressão da GC.

no geral, nosso estudo sugere que EGC e AGC compartilhar mutações somáticas comuns, e AGC está associada a alterações genéticas cumulativas adicionais na adesão celular e genes-remodelação de cromatina. As assinaturas moleculares que distinguem EGC da AGC são importantes para ajudar a identificar novos marcadores prognósticos e possíveis alvos terapêuticos. Maiores estudos são necessários para determinar o significado biológico dos genes mutados recorrentemente em EGCS.

Informações de Apoio
Tabela S1.
Resumo das estatísticas de sequenciamento toda exome para quatro pares de amostras gástricas
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s001
PDF ()
tabela S2. : Lista de todas as mutações somáticas em cancros gástricos primeiros identificados por sequenciação exome
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s002
(XLS)
Tabela S3.
Primers para seqüenciamento Sanger, freqüência do alelo e os resultados de validação
doi: 10.1371. /journal.pone.0082770.s003
(PDF)
Tabela S4.
Comparação de somática espectros ponto de mutação em cânceres gástrico, por estado tumor e tipo histológico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s004
(PDF)
Tabela S5. análise de caminho
DAVID dos 268 genes que se sobrepõem entre câncer gástrico precoce e avançados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0082770.s005
(XLS)

• PLOS ONE: A análise custo-eficácia Avaliando vigilância endoscópica para o cancro gástrico para populações com baixa para Intermediate Risk
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