PLOS ONE: Perda de Expressão da Reprimo, um Ciclo Celular Detenção Gene induzida por p53, correlaciona-se com Invasiva Stage da progressão do tumor e expressão p73 em gástrica Cancer

Abstract

Reprimo (RPRM), um efector a jusante da a paragem do ciclo celular induzida pelo p53 em G2 /M, tem sido proposto como um gene supressor tumoral putativo (GST) e como um biomarcador potencial para a detecção não invasiva do cancro gástrico (GC). O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento epigenético do gene RPRM por metilação do promotor e sua função supressora de tumores em linhas de células de GC. Além disso, o significado clínico do produto da proteína RPRM e sua associação com p53 /p73 da família proteína supressora de tumor foi explorada. silenciamento do gene epigenética por metilação do promotor RPRM foi avaliada em quatro linhas celulares de GC. A expressão da proteína de RPRM foi avaliada em 20 tumoral e não tumoral casos pareados. O significado clínico da associação RPRM com p53 /p73 família proteína supressora de tumor foi avaliada em 114 casos de GC. função de supressor tumoral foi examinado através de ensaios funcionais. a expressão do gene RPRM foi negativamente correlacionada com o promotor metilação (classificação r Spearman = -1; p = 0,042). RPRM superexpressão inibiu a formação de colónia e crescimento independente de ancoragem. Em amostras clínicas, a expressão da proteína do gene RPRM foi detectada em 75% (15/20) de não tumor, mucosa adjacente, mas apenas em 25% (5/20) dos tecidos de tumor gástrico (p = 0,001). Correlações clínico-patológicas de perda de expressão RPRM foram significativamente associados com estágio invasivo da GC (fase I a II-IV, p = 0,02) e uma associação positiva entre RPRM e gene p73 expressão produto de proteína foi encontrada (p < 0,0001 e valor de kappa = 0,363 ). Em conclusão, o silenciamento do gene epigenética por metilação do promotor RPRM está associada à perda de expressão RPRM. Os ensaios funcionais sugerem que RPRM comporta-se como um TSG. A perda de expressão do produto de proteína do gene RPRM está associado com a fase invasiva de GC. associação positiva entre RPRM e expressão p73 sugerem que outros membros da família de genes p53 podem participar na regulação da expressão RPRM

Citation:. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- estay V, et al. (2015) Perda de Expressão da Reprimo, um Ciclo Celular Detenção Gene induzida por p53, correlaciona-se com Invasiva Stage da progressão do tumor e expressão p73 no câncer gástrico. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10.1371 /journal.pone.0125834

Editor do Academic: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, United States |

Recebido: 16 Janeiro, 2015; Aceito: 25 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Saavedra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. Isso funciona foi apoiada por doações CONICYT-FONDECYTo1014 (AHC) e CONICYT-FONDAP—30011 (AHC e JCR) do Governo do Chile

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer e o quinto mais malignidade comum em todo o mundo [1]. Apesar da incidência decrescente de GC, em parte devido ao reconhecimento de certos fatores de risco (por exemplo, Helicobacter pylori Comprar e fatores ambientais), continua a ser um dos cancros mais comuns em todo o mundo e continua a ser um desafio clínico [2 , 3]. carcinogénese gástrico envolve uma acumulação progressiva de alterações genéticas e epi, que conduz à desregulação da expressão de oncogenes e genes supressores de tumor (ETG) [4]. Reprimo (RPRM) é um romance putativo TSG [5,6] e associada a carcinogênese gástrica [7]. Além disso, propusemos que o ADN isento de células RPRM metilado pode ser um biomarcador potencial para a detecção não invasiva de GC [8,9].

RPRM é uma proteína altamente glicosilada localizada predominantemente no citoplasma e tem sido identificado como um efector a jusante de paragem do ciclo celular induzida pelo p53 em G2 /M [10]. Relatórios sugerem que a expressão RPRM é regulada por dois mecanismos, um através de metilação do DNA na sua região promotora [8] e a outra por via p53 [10]. No entanto, estudos mais recentes não têm sido capazes de confirmar estes resultados [6]. Por outro lado, o significado clínico da RPRM tem sido pouco estudado [11]. No presente estudo foi avaliado o papel da metilação do DNA na regulação da expressão RPRM, seu significado clínico e sua associação com membros do tumor p53 família proteína supressora (isto é, p53 e p73). Encontrámos metilação densa na região promotora do RPRM, que foi associada com a perda de expressão em linhas celulares de GC. Em casos clínicos, a perda de expressão foi associada com a fase de invasão da GC. Além disso, observou-se uma associação positiva entre a expressão de RPRM e p73, sugerindo que outros membros da família de genes p53 pode ser novos candidatos para a regulação da expressão RPRM.

Métodos

linhas celulares e Amostras de Tecido

Quatro linhas celulares de GC (AGS, SNU-1, KATOIII e NCI-N87) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) em dezembro de 2012 cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone) e suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e mantida a 37 ° C, 5% de CO _{2. Vinte mucosa adjacente de amostras emparelhadas tumorais e não tumorais (NTAM) foram seleccionadas para avaliação da expressão RPRM. Seis foram selecionados para avaliação de metilação RPRM. Uma coorte de 114 pacientes GC foi selecionado para correlações clínico-patológicas de produto proteína do gene RPRM. As amostras de tecido a partir de casos individuais foram classificados de acordo com a japonesa Sociedade de Pesquisa para recomendações câncer gástrico [12]. Todos os casos foram recrutados a partir do Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile entre 1993-2000 [13] e as características clinicopatológicas são apresentados na Tabela 1. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Conselhos de revisão da Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Ética Científico) e ICHJED-HCSBA (Comité de Ética Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante envolvido no estudo.}

imunohistoquímica e

Tissue microarrays (TMA) foram feitas usando uma matriz II instrumento manual de Tissue (Beecher Instruments) como anteriormente descrito [14,15]. seções centrais (4μm) foram submetidos a imunocoloração por Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos utilizados neste estudo foram RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (clone 318-6-11, Dako Dinamarca) e α proteína p73 (clone 24, Novacastra). Os resultados da coloração imunológica no tumor inteiro e NTAM, bem como secções TMA foram considerados positivos para RPRM se > 30% de células epiteliais apresentaram coloração citoplasmática, > coloração nuclear de 10% para o p53, ou > 10% nuclear /coloração citoplasmática para p73 . Avaliação da coloração imuno-histoquímica foi realizada de forma independente por dois patologistas (JV & GC). Que desconheciam os dados clínicos

seqüenciamento bissulfito e RT-PCR quantitativo Análise de Expressão

DNA de linhas celulares GC foi extraiu-se utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante, seguindo-se a conversão de bissulfito utilizando o kit EZ ouro de metilação de ADN (Zymo Research). RPRM promotor foi amplificado a partir de ADN tratado com bissulfito, utilizando os iniciadores 5'-RPRM_B_FW TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 'e 5'-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3', permitindo a detecção de 52 locais de CpG dentro de uma região de promotor de 509 pb. Os produtos de PCR foram purificados com o kit de extracção de gel QIAXEN II (Qiagen) e ligado no vector pGEM-T. O produto de ligação foi usada para transformar competente E
. coli Top10
células, de acordo com o procedimento descrito por Inoue et al. [16]. Os transformantes foram seleccionados em placas de agar LB suplementado com ampicilina (100 ug /mL), X-Gal (50 mg /mL) e IPTG (100 mM). As colónias brancas resultantes foram avaliadas pela colónia-PCR. Os clones positivos foram cultivados em meio líquido (LB /ampicilina) até a fase exponencial tardia (OD600 = 1) e os plasmídeos de ADN foram purificadas utilizando o estojo de miniprep de sistema Rendimento puro (Promega). A região promotora RPRM foi sequenciado usando M13 universal (W 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3 'e 5'-CAGGAAACAGCTATGAC RV-3') por Macrogen (http://dna.macrogen.com). software analisador BIQ foi utilizado para a análise de clones sequenciados. Todos os clones pGEM-T positivos foram cultivados em meio LB /ampicilina e armazenado a -80 ° C (em 14% de glicerol). O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen) e o ADNc foi sintetizado utilizando o kit de síntese de ADNc iScript de acordo com as instruções do fabricante (Biorad). Subsequentemente, o ADNc foi utilizado para cada reacção de PCR com cada par de iniciadores. Os iniciadores RPRM específico são: 5'-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 'e 5'-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3'. análise em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando LightCycler Fast Start DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) num sistema LightCycler 1.5 Detecção em tempo real (Roche). análise quantitativa relativa normalizada para RPL-30 foi realizada através do método de ciclo limiar comparativa [17]. Os RPL-30 primers específicos são:. RPL-30_Fw 5'-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 'e 5'-RPL30_RV AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3'

Validação de anticorpo RPRM por Immunoblot e Imunofluorescência

3x10 ^{5 AGS células foram transfectadas transientemente com pCMV6 /ou RPRM pCMV6 (Origene) vector vazio, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram incubadas durante 24 h em RPMI 1640 com FBS a 10%, na presença ou ausência de inibidor de N-glicosilação Tunicamicyn (10 ng /mL). As células foram recolhidas e os lisados ​​de células completas foram extraídas com tampão Triton (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,1M, 0,5% de Triton X-100) com Inibidor de Protease Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) e Kit de cocktail inibidor de fosfatase ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). As concentrações de proteína foram determinadas usando o Reagente de início rápido de Bradford (Bio-Rad). Cinquenta ug de proteína foram separados em SDS-PAGE a 4% a 12%. As proteínas nos geles foram electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno, utilizando o mini-sistema transblotter (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas de difluoreto de polivinilideno foram bloqueadas em leite 5% em solução salina tamponada com Tris /Tween 20 (TBST) durante 1 h. O anticorpo primário anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) foi diluído 1: 1000 em TBST /BSA a 3% /e as membranas foram incubadas em anticorpos primários a 4 ° C durante a noite. As membranas foram lavadas três vezes em TBST durante 10 minutos cada. Anti-coelho conjugado com peroxidase de anticorpo secundário (Santa Cruz) foi diluído 1: 2000 em TBST e incubaram-se sobre as membranas durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas como acima e visualizadas utilizando SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) de acordo com o protocolo do fabricante. Para avaliar a localização celular de RPRM, foi realizado ensaio de imunofluorescência. células AGS transitoriamente transfectadas com pCMV6-RPRM ou pCMV6 foram cultivadas em lamelas. As células transfectadas de forma transiente AGS foram fixadas em 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente e depois lavadas três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram permeabilizadas em 0,1% de Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) durante 10 min, bloqueadas em BSA a 3% durante 1 h à temperatura ambiente, e, subsequentemente, marcadas com um anticorpo anti-RPRM (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com um anticorpo Alexa Fluor 488 conjugado (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) durante 1 h à temperatura ambiente. As imagens foram adquiridas por microscopia confocal de varredura a laser de fluorescência (ver Informações de Apoio S1 e S2 Figs).}

Cultura de células e transfecção

Para experiências de transfecção estáveis, as células AGS foram semeadas a 3x10 ^{5 células /placa de cultura de 100 mm e transfectadas após 24 h com pCMV6-RPRM ou vector pCMV6 (Origene) vazio usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram cultivadas sob as mesmas condições com G418 (500 g /mL). meios de cultura foi trocado a cada 24 h por 14 dias.}

Colony ensaio de formação de

Para ensaio de formação de colónia, 200 células foram estavelmente transfectadas com pCMV6-RPRM ou pCMV6 vector vazio. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone) e suplementado com FBS a 10%. meios de cultura foi trocado a cada 24 h. As colónias foram coradas utilizando 0,4% de violeta cristal (Sigma) em 50% de metanol, 21 dias após a semeadura inicial, e contou aos 20 imagens feitas em microscópio invertido (Sistema de imagiologia celular Evos XL Core, a Life Technologies). Cada transfecção foi efectuada em triplicado. Além disso, replicam experiências foram realizadas para se obter mais clones para análise de expressão.

Anchorage-ensaio de crescimento independente

de crescimento de células Anchorage-independente foi analisada por plaqueamento de 1% de agarose contendo 2x10 ^{5 células transfectadas estáveis ​​com pCMV6-RPRM pCMV6 ou vector vazio em placas de 6 poços. As células foram alimentadas semanalmente por sobrejacente solução de agar mole fresco, e as colónias foram fotografadas após 4 semanas de incubação. O experimento foi realizado em triplicado.}

Análise Estatística

O coeficiente de correlação de Spearman foi calculado para analisar a correlação entre a metilação RPRM e os níveis de expressão de genes. As variáveis ​​categóricas foram analisadas por Pearson Chi-quadrado (frente e verso), o p-valor foi corrigido usando uma análise de regressão logística. As variáveis ​​contínuas foram analisadas usando t
de teste e dados de Student foi expressa como média ± SD. teste Kappa foi utilizado para analisar a correlação entre a expressão RPRM e expressão p73. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) pacote estatístico e software GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, Estados Unidos). Todos os valores foram bicaudais, com exceção de Spearman. A significância estatística foi definida como p < 0,05.

Resultados

metilação RPRM e expressão em linhas celulares de cancro gástrico

Anteriormente, nós e outros têm relatado que a expressão RPRM pode ser restaurado pelo agente de desmetilação 5-aza -2-desoxicitidina (Veja Informações de Apoio S3 e S4 Figs) [5,8,18]. No entanto RPRM metilação foi fracamente correlacionadas com a expressão [18]. Para avaliar ainda mais a associação entre a metilação do promotor RPRM e expressão de genes, a região de promotor completa do gene RPRM foi analisada por ADN bissulfito de sequenciação em quatro linhas celulares de GC (AGS, SNU-1, KATO III e NCI-N87) (Figura 1A). Assim, o estado de metilação de 52 locais de CpG, localizadas entre -207 e +302 nucleótidos relativas ao local de iniciação de transcrição (TSS), foram analisados. Esta análise mostra metilação densa em linhas celulares AGS e SNU-1 (89,6% e 86%, respectivamente), em comparação com KATO III e NCI-N87 (79,7% e 51,8%, respectivamente) (P = 0,0002) (Figura 1B) . Em seguida, o nível de expressão RPRM foi determinada por RT-PCR quantitativo. baixa expressão do gene RPRM foi observada em AGS e SNU-1 em comparação com KATO III e linhas celulares NCI-N87 (p < 0,0001) (Fig 1C). Pela análise de correlação de Spearman revelou correlação negativa significativa foi encontrada entre a densidade de metilação e expressão gênica RPRM (r = -1; p = 0,042) (Fig 1D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a metilação da região promotora RPRM desempenha um papel crítico na regulação da expressão RPRM.

metilação RPRM e expressão em tecidos de câncer gástrico

Para corroborar os dados anteriores em tecidos GC , os níveis de metilação RPRM foram determinados em amostras de tumor e 6 NTAM emparelhados. Os resultados indicam níveis de metilação mais elevados nos tecidos tumorais em comparação com tecidos NTAM (ver Figura 1E). Para investigar a expressão do produto proteico do gene em tecidos RPRM análise por CG IHC foi realizada. RPRM expressão positiva foi observada principalmente no citoplasma das células epiteliais gástricas. RPRM expressão do gene da proteína foi detectada em 75% (15/20) de amostras de tecidos NTAM. No entanto, apenas 25% (20/05) de amostras de tumor mostrou expressão do produto proteico do gene RPRM (Figura 2). Estas diferenças foram altamente significativas (p = 0,001) e sugerem que a expressão de RPRM é perdida em tecidos GC. Para avaliar o significado clínico desta perda de expressão RPRM uma coorte de 114 casos de GC foi avaliado. Perda de expressão RPRM foi encontrado em 62% (71/114) dos casos de GC. correlações clínico-patológicos de expressão RPRM são mostrados na Tabela 1. A progressão da fase I GC para as fases II-IV (p = 0,006) e metástases nos linfonodos (p = 0,037) foram significativamente associados com a perda de expressão do produto de proteína do gene RPRM. No entanto, a análise de regressão logística mostra que apenas progressão da fase I a II-IV é significativamente associada com perda de produto proteína do gene RPRM (p = 0,020).

Ensaio funcional de RPRM no câncer gástrico (formação de colónias e de ancoragem crescimento independente de)

Como a perda de expressão RPRM foi associado no GC e, principalmente, com a progressão da fase I a II-IV, um papel supressor de tumor de RPRM pode ser plausível. Portanto, os ensaios funcionais, tais como In vitro
formação de colónias e os ensaios de crescimento independente de ancoragem foram realizados em células transfectadas com AGS pCMV6 /RPRM (Fig 3A). Não linhas celulares que expressam AGS transfectadas com plasmídeos de expressão RPRM mostraram uma redução significativa do número de colónias em comparação com pCMV6- linhas transfectadas com vector vazio de células transfectadas com vector vazio pCMV6-(p < 0,05) (Fig 3B). O efeito da sobreexpressão RPRM no crescimento independente de ancoragem num ensaio de formação de colónias em agar mole, também foi avaliada na linha de clones de células transfectadas estáveis ​​AGS. As colónias foram contadas após a sementeira inicial e a incubação em agar mole, durante 4 semanas. As células transfectadas com vector vazio mostrou o crescimento da colônia robusta, pelo número e tamanho das colónias. Isto foi muito reduzida quando RPRM foi re-expressos em células de AGS (Figura 3C).

Associação de expressão RPRM e p53 /p73 tumor supressor da família de proteínas no cancro gástrico

RPRM foi definida como um gene mediada por p53 em células de fibroblastos embrionários [18]. No entanto, tem sido relatado que a regulação da expressão RPRM pode ser independente do estado do gene p53 em células neuronais tratadas com cobre [19]. Por outro lado, a p73 pode activar a transcrição de genes p53-responsivo [20]. Considerando este cenário, avaliamos a expressão da p53 e outro membro da família de proteínas p53, p73 TSG. A expressão de p53 foi localizada nos núcleos de células da mucosa gástrica. expressão da p53 positivo foi detectado em 23,5% (20/114) dos casos de GC. o tamanho do tumor estava apenas associada com a expressão de p53 (p = 0,035, ver Tabela 2). A expressão de p73 foi localizada nos núcleos celulares e citoplasma das células epiteliais. expressão p73 foi positiva em 30,6% (34/114) das amostras de GC. Curiosamente, as correlações clínico-patológicos significativos de expressão p73 foram associados com a fase invasiva (fase I 55,6%; 10/18 para as fases II-IV de 25,8%; 24/93, p = 0,012) e nó de linfa de metástases (p = 0,038) (Tabela 2 ). Desde perdas de expressão de RPRM e proteína do gene p73 produtos têm correlações clínico-patológicas semelhantes, avaliou associação entre as expressões de níveis de ambas as proteínas. Para este fim os casos foram separados em quatro grupos de acordo com a expressão de RPRM e proteína p73 produtos. A análise mostrou que 22 out 111 casos de GC foram positivos para ambas as proteínas RPRM e p73, ao passo que 57 a 111 foram negativos. Esta associação foi estatisticamente significativa (p < 0,0001). Com um valor de kappa de 0,363 (Tabela 3)

Discussão

RPRM é uma proteína citoplasmática altamente glicosilada, inicialmente identificado como um efector a jusante da p53 parada do ciclo celular induzida pelo G2 /M. Anteriormente, foi proposto que RPRM é silenciado por metilação do promotor, embora tenha sido fracamente correlacionadas com a expressão [5,8]. Além disso, RPRM tem sido proposto como um gene supressor tumoral putativo no carcinoma de células renais e tumores da pituitária [5,6]. Neste estudo, foi demonstrado que a expressão do gene RPRM está fortemente associado com o seu estado de metilação da região promotora, sugerindo epigenética silenciamento de expressão do gene RPRM. Além disso, mostra-se que o produto de proteína do gene RPRM foi diminuída em comparação com o tecido GC mucosa gástrica não canceroso. Estes resultados são semelhantes ao de Luo et al
. [11], relataram que a perda de RPRM em GC, quando comparado com amostras de tecido de úlcera gástrica. Além disso, a nossa conclusão sobre perda de expressão de RPRM na transição da fase I a fases II-IV é clinicamente relevante. Luo et al
. [11] relataram uma conclusão semelhante, mas em um pequeno número de fase I GC casos (n = 15). Esses achados podem ter significado clínico como um fator preditivo para a progressão da GC. Por conseguinte, com esta perda de expressão RPRM na progressão da GC, os nossos ensaios funcionais (formação de colónias e de ancoragem independente crescimento) também proposto um papel supressor tumoral putativo para RPRM em GC.

Embora p53 foi inicialmente descrito como um RPRM indutor [10], os estudos clínicos realizados até à data não foram capazes de confirmar tal constatação [6,18]. Aqui, identifica-se que a perda de expressão RPRM correlaciona-se com a perda de expressão de um outro membro da família p53, p73. Embora TSG p73 é expresso a um nível muito baixo em tecidos humanos normais [21], é sobre-expresso em muitos cancros humanos diferentes, tais como da mama, neuroblastoma, do pulmão, esófago, estômago, cólon, ovário e bexiga [14,22]. Além disso, tem sido relatado que a p73 pode activar a transcrição de genes p53-responsivo, incluindo p21Waf1 /Cip1, Bax, MDM2, ciclina G, GADD45 e IGFBP3 [20]. Assim, com base em nossos resultados, propomos que a expressão RPRM poderia ser regulada por p73 em um modo independente de p53.

Em resumo, nossos dados sugerem que o silenciamento epigenético do gene RPRM por metilação do promotor está associada com perda de RPRM expressão e, por conseguinte, os ensaios funcionais proposto um papel supressor tumoral putativo de RPRM em GC. Em amostras clínicas, RPRM é perdida nas fases invasivos de GC e a sua expressão está correlacionada com a de p73 sugere que outros membros da família do gene p53 podem participar na regulação da expressão RPRM. Mais pesquisas são necessários para caracterizar o papel de RPRM na progressão da GC e validar a regulação biológica de RPRM por p73.

Informações de Apoio
S1 Data. . Os dados subjacente ao estudo
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s001
(ZIP)
S1 Fig. Efeitos de Tunicamicyn sobre proteína RPRM.
RPRM é uma proteína citoplasmática altamente glicosilada visualizada a 25 kD por Western blot, a tunicamicina inibidor da glicosilação (TK) desloca a banda RPRM de 25 kD a 15 kD em células com sobre-expressão RPRM AGS (pCMV6 /RPRM) (RPRM tamanho previsto de 12 kDa). As células foram incubadas durante 24 h em RPMI 1640 com FBS a 10%, na presença ou ausência do inibidor de tunicamicyn de N-glicosilação (10 ng /mL). RPRM expressão foi determinada por Western blotting utilizando um anticorpo policlonal RPRM (painel superior, diluição 1: 1000, Sigma-Aldrich). A expressão de β-actina (painel inferior, a diluição 1: 2000, Santa Cruz) representa carga de proteína
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s002
(TIF)
S2 Fig. Localização de expressão RPRM em superexpressão AGS linha de células de imunofluorescência de RPRM na linha de células de câncer gástrico AGS transfectadas com RPRM pCMV6 vector de codificação.
24 h células após a transfecção foram fixados em paraformaldeído a 4% e incubadas com anti-RPRM-coelho (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) e anticorpo secundário Alexa Fluor-488 (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene). A expressão positiva da RPRM (VERDE) é visto principalmente no citoplasma. As imagens foram capturadas em usar software multicanal Axio Vision4 em microscópio de fluorescência Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s003
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S3 Fig. RPRM expressão é silenciado por metilação do promotor.
A) análise de RT-PCR da expressão de ARNm RPRM na linha celular de cancro gástrico AGS com e sem o inibidor da metilação do DNA 5-azacitidina (1 uM durante 72 horas). GAPDH foi usada como um controlo. B) A amplificação de RPRM por metilação PCR específico em linha de células de câncer gástrico AGS. A amplificação de MYOD1 metilado foi utilizado como controlo. linha celular de AGS foi metilado na região promotora. NC: controle negativo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0125834.s004
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S4 Fig. RPRM expressão é silenciado por metilação do promotor (gel original).
A) análise de RT-PCR da expressão de ARNm RPRM na linha celular de cancro gástrico AGS com e sem o inibidor da metilação do DNA 5-azacitidina (1 uM durante 72 horas). GAPDH foi usada como um controlo. B) A amplificação de RPRM por metilação PCR específico em linha de células de câncer gástrico AGS. A amplificação de MYOD1 metilado foi utilizado como controlo. linha celular de AGS foi metilado na região promotora. NC:. Controle negativo
doi: 10.1371 /journal.pone.0125834.s005
(TIFF)

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer Sabina Magedson por sua contribuição na construção Tissue microarrays. Também gostaríamos de agradecer Hiroshi Kawachi para análise histológica dos casos, Ignacio Wichmann por seus valiosos comentários sobre o nosso manuscrito e Oslando Padilla por seu apoio importante na análise estatística.

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