PLOS ONE: Piruvato Quinase M2 desempenha um papel duplo no regulamento do /EGFR sinalização EGF via E-caderina-Dependent Manner em câncer gástrico Cells

Abstract

Fundo e visa

activação de EGFR e expressão PKM2 são instrumentais na tumorigênese. activação do EGFR PKM2 regula as funções de uma maneira dependente do compartimento subcelular e promove a transcrição de genes e o crescimento do tumor. Além disso, PKM2 é regulada positivamente nas vias induzida pelo EGFR em doenças malignas de glioma. No entanto, verificou-se que PKM2 também podiam regular a actividade da via de sinalização de EGFR /EGF em células de cancro gástrico. Nosso objetivo foi definir os mecanismos biológicos para PKM2 na regulação da motilidade celular e invasão.

Métodos

Nós empregamos transfecção estável com RNA hairpin curto para silenciar estavelmente a expressão de PKM2 na BGC823, SGC7901 e linhas celulares de cancro gástrico AGS. Os efeitos de PKM2 in vitro foram determinadas por avaliação da migração celular e invasão. A análise imuno-histoquímica foi usada para explorar a relação entre PKM2 e outras proteínas.

Resultados

Os nossos resultados indicam que o knockdown de PKM2 diminuiu a actividade de E-caderina e reforçada a via de sinalização de EGF /EGFR nas linhas de células gástricas e BGC823 SGC7901 que foram positivas para a expressão de e-caderina. No entanto, na linha celular de carcinoma gástrico indiferenciada AGS, a que falta expressão de E-caderina, PKM2 promovido a migração celular e invasão. análises de imuno-histoquímica mostrou que os níveis de expressão da caderina-E, ERK1 2 fosforilação /, e expressão PKM2 citoplasmática foram correlacionados entre si

Conclusão:.

PKM2 podem desempenhar diferentes papéis na gástrica diferente diferenciada célula cancerosa tipos, e este achado seria consistente com a pesquisa clínica anterior. Os resultados do nosso estudo revelam uma importante ligação entre PKM2 e E-caderina durante a motilidade celular câncer gástrico estimulada pelo EGFR e invasão

Citation:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) Piruvato Quinase M2 desempenha um papel duplo no regulamento do /EGFR sinalização EGF via Manner E-caderina-Dependente em células de câncer gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10.1371 /journal.pone.0067542

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 07 de fevereiro de 2013; Aceito: 20 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30971362, 81072013 & 91.229.201), fundos de pesquisa fundamental para a Universidades Central na China (No. 2010111082) e Ministério da Saúde Fundação para a State Key Departamento clínico. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

piruvato cinase (PK) medeia o passo limitante da taxa final da glicólise por catalisar a desfosforilação de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato para produzir uma molécula de ATP. As células de mamíferos têm quatro isoenzimas de piruvato-quinase (M1, M2, L, e R), que são expressas selectivamente em diferentes tipos de células e tecidos [1]. Nos mamíferos, a isoforma M1 (PKM1) é expressa na maioria dos tecidos adultos. A isoforma M2 (PKM2), uma variante de splicing alternativo do M1, é expresso durante o desenvolvimento embrionário [2]. Estudos descobriram que as células cancerosas expressam exclusivamente PKM2 [3], [4]. PKM2 tem sido demonstrado ser essencial para a glicólise aeróbica em tumores (efeito Warburg). Ao longo dos anos, avanços significativos têm sido feitas para a compreensão da função e regulação de PKM2 como uma cinase de piruvato quinase e proteína em células de cancro [5]. Um estudo recente confirmou que o PKM2 induzida por factor de crescimento epidérmico (EGF), transloca-se para o núcleo de células de glioblastoma, interage com β-catenina e leva à expressão cyclinD1, que promove a proliferação celular e a tumorigénese [6]. Estes resultados revelam um novo papel para PKM2 como um coativador transcrição. No entanto, existem algumas controvérsias a respeito da especificidade e potencial de PKM2 como alvo de um anti-câncer na terapia do cancro. Uma descoberta recente revelou que a expressão PKM2 está fortemente correlacionada com a diferenciação cancro gástrico. tipos diferenciados de cancros expressar mais proteína PKM2 do que os indiferenciadas. PKM2 foi um fator prognóstico adverso em câncer de células anel de sinete gástrica [7]. O papel biológico de PKM2 em diferentes fases de diferenciação e no desenvolvimento de cancro gástrico deve ser ainda elucidado.

Estudos anteriores sobre PKM2 têm-se centrado sobre o metabolismo do tumor e o crescimento do tumor. Houve poucos relatos sobre a metástase do tumor. E-caderina desempenha um papel crítico na manutenção da integridade do epitélio, e a perda de E-caderina afecta o repertório adesiva de uma célula [8]. Estudos anteriores [9] in vitro têm demonstrado que a perda de E-caderina em linhas celulares de carcinoma humanos está associada com a má diferenciação e uma morfologia f ibroblastóide. A activação dependente de EGF do EGFR foi relatada a ser inibida de um modo dependente da E-caderina-adesão, que inibe a activação dependente do ligando dos diferentes tirosina-quinases receptoras [10]. A nossa investigação demonstrou que o knockdown de PKM2 diminuiu a actividade de E-caderina e reforçada a via EGF /EGFR sinalização nas linhas celulares e BGC823 SGC7901 que foram positivas para a expressão de E-caderina. No entanto, na linha celular de carcinoma gástrico indiferenciada AGS, a que falta expressão de E-caderina, PKM2 promovido a migração celular e invasão. O objetivo deste estudo foi o de elucidar a função e mecanismo de PKM2 em relação a motilidade celular em linhas celulares de forma diferente diferenciadas.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e Condições e transfecção

as linhas celulares de cancro gástrico humano BGC823 (fracamente diferenciado, de acordo com o fornecedor) e SGC7901 (moderadamente diferenciado) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA). A linha celular de AGS (indiferenciado) foi cultivada em meio F12K. Todas as células foram cultivadas em meio contendo soro a 10% de bovino fetal (FBS) (Gibco, Detroit, MI, EUA) e 100 UI /mL de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO _{2 atmosfera humidificada. A linha de células de câncer gástrico humano AGS foi ordenada a partir da American Type Culture Collection (ATCC, EUA), e as linhas de células de câncer gástrico humanos SGC7901 e BGC823 foram obtidos a partir de China Centre for Type Culture Collection (Xangai, China). células SGC7901, BGC823 e AGS foram transfectadas com o siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) ou o plasmídeo PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) utilizando FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicina (0,1 ug /ml) foi usada para o rastreio de clones transfectados de forma estável. A expressão da proteína PKM2 foi examinada com a análise de Western blot utilizando um anticorpo contra PKM2 para validar a capacidade dos construtos para inibir a expressão do gene alvo; estas experiências foram repetidas três vezes. As culturas celulares foram tornadas quiescentes por uma crescente-los até à confluência e o meio foi substituído com meio fresco contendo 0,5% de soro, durante 1 dia. EGF com concentração final de 100 ng /ml foi usada para a estimulação celular. EGF foi obtido a partir de Cell Signaling Technology.}

knockdown Estável de PKM2 e sobre-expressão de PKM2

Um plasmídeo contendo uma sequência de interferência de RNA que tinha como alvo o gene PKM2 em BGC823, células SGC7901 e foi AGS construído. O oligo de sentido para a sequência 5'-siPKM2 foi CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', e o oligo anti-sentido era 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. O BGC-823, a SGC-7901 e as células foram transfectadas com AGS pcPUR + U6-siPKM2 ou pcPUR + U6-siRenilla (controlo) e seleccionada como clones resistentes puromicina. A análise por Western blot foi realizada para confirmar a supressão PKM2. Um plasmídeo contendo a sequência de cDNA PKM2 foi obtido a partir da Invitrogen. O BGC-823, células AGS SGC-7901 e foram transfectadas com pcDNA6.0-PKM2 ou pcDNA6.0-simulada (controle) e selecionado como clones resistentes a blasticidina. A análise por Western blot foi realizada para confirmar a expressão PKM2.

Extracção de proteínas e análise por Western blot

As células foram re-suspensas em tampão de lise contendo um cocktail inibidor de protease, e as proteínas extraídas foram separadas usando 8-10% de gel SDS-PAGE. p-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. Os anticorpos contra a E-caderina e P-E-caderina foram obtidos a partir de Epitomics. A fosfo-EGFR (Tyr1068),, fosfo-ERK1 /2 anticorpos fosfo-PLCγ1 (Tyr783) fosfo-AKT (Ser473) fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-cbl (Tyr700), e (Thr202 /Tyr204) foram obtidas a partir de Cell Signaling Technology.

a extracção de ARN, transcrição reversa e PCR em tempo real

o RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, CA, EUA). As amostras foram então tratadas com ADNase I durante 15 min à temperatura ambiente, e o ARN foi adicionalmente purificado utilizando um kit de limpeza de RNA (Qiagen, CA, EUA). A reacção de transcrição reversa (RT) para a síntese da primeira cadeia de ADNc foi realizada utilizando transcriptase inversa (Bio-Rad) com 2? G de ARN total. A análise por RT-PCR quantitativa foi realizada com o ABI 7500 (Applied Biosystems), e os níveis de expressão de genes para cada uma das amostras individuais foram normalizadas para GAPDH. A expressão do gene relativa média foi determinada e as diferenças foram calculados utilizando a 2 ^{-ΔΔCt método de electroforese em gel de agarose. As sequências dos iniciadores de RT-PCR foram as seguintes: 5'-sentido TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'e anti-sentido 5'-GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' para N-caderina; sentido 5'-CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'e anti-sentido 5'-AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' para a E-caderina; sentido 5'-TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'e anti-sentido 5'-GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' para MMP7; sentido 5'-CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'e anti-sentido 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' para GAPDH.}

Ensaio de Proliferação Celular

A proliferação celular foi medida utilizando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em quatro placas de 96 poços a uma densidade de 2 × 10 ^{3 células /poço. Uma placa foi retirado ao mesmo tempo todos os dias depois de as células terem aderido aos poços. A absorvância foi medida com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de 450 nm. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.}

Transwell Invasion e Wound Ensaios cura

O transpoço ensaios de invasão foram realizadas com inserções de 8,0 mícrons de poros em um de 24 poços transpoço placa. A membrana basal foi hidratada com 500 uL de meio RPMI 1640 isento de soro ou F12K 30 min antes da utilização. Para o ensaio de invasão, as linhas celulares de cancro gástrico foram adicionadas à câmara superior de um Transwell com 0,5 mg /mL de colagénio de tipo L (BD Bioscience, San Jose, CA) -Revestido filtros. Meio RPMI 1640 ou F12K meio com soro bovino fetal a 10% e 1% de cada antibiótico foi adicionada à câmara inferior. O BGC e 7901 células foram incubadas durante 36 horas. As células de AGS foram incubadas durante 24 horas. As células invasoras foram quantificadas após coloração com violeta de genciana. Cada experiência foi efectuada em triplicado, e os dados foram expressos como valores médios. O ensaio de cicatrização da ferida foi realizado em placas de 6 poços. As células tumorais em meio contendo FBS a 10% foram inoculadas em placas de 6 poços (Corning, CA). As culturas celulares foram tornadas quiescentes por uma crescente-los até à confluência e o meio foi substituído com meio fresco contendo 0,5% de soro, durante 1 dia. Feridas na monocamada foram feitas com pontas de pipetas estéreis. Em seguida, o EGF com concentração final de 100 ng /ml foi usada para a estimulação celular. As células foram então lavadas com PBS e refrescado com meio contendo 10% de FBS. Foram tiradas fotografias a tempo 0 e 24 h. Todos os experimentos foram realizados em triplicado

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética (Não: 20081012). No Hospital Zhongshan filiada à Universidade de Xiamen, Xiamen, província de Fujian, China, e obtivemos declarações consentimento por escrito de todos os participantes envolvidos neste estudo.

Preparação de amostras de tecido

amostras de tecido do tumor foram coletados de 15 pacientes diferentes câncer gástrico submetidos à ressecção curativa no Hospital Zhongshan, Universidade de Xiamen, Xiamen, China. Uma série independente da correspondente tecidos não cancerosos adjacentes de 15 dos mesmos pacientes foram coletados ao mesmo tempo. Todas as amostras de tecido foram recolhidas e divididas em duas partes imediatamente após a ressecção do tumor. Uma parte foi recolhido em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até a extracção de ARN e proteína. A outra parte foi fixada em formol 4% e embebidos em parafina para análise histológica (hematoxilina eosina e coloração IHC). Todas as amostras foram confirmadas por diagnóstico patológico (o diagnóstico histopatológico foi baseada em critérios da OMS). Todos os casos experimentais foram agrupados para a União Internacional Contra o tumor metástase-sistema de Câncer (TNM) (revista em 2002)-ing acordo.

Imunohistoquímica

secções de parafina de quatro micron de espessura foram quer corados com hematoxilina e eosina (H & e) ou analisadas para PKM2, P-ERK1 /2 e e-caderina expressão por imuno-histoquímica. A imuno-histoquímica foi realizada de acordo com os procedimentos que foram recomendadas pelo fabricante. As reacções foram visualizadas utilizando diaminobenzidina como um substrato cromogénico. As secções foram contrastadas usando hematoxilina e, em seguida, limpa e montado. A densidade média (IOD /área) foi detectada em diferentes áreas positivos das 15 amostras de cancro gástrico humano imagem Usando-Pro Plus software.

Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS v13. 0 (SPSS, Inc.), software. As amostras independentes-T de teste e análise de correlação foram usados ​​para comparar os dados. Todos os valores são expressos como as médias ± DP. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P
. ≪ 0,05

Resultados

O esgotamento dos PKM2 Promovido migração e invasão celular em BGC823 e SGC7901 células com EGF Estimulação

a expressão da proteína PKM2 nas linhas celulares de cancro gástrico BGC823, SGC7901 AGS e foi avaliada utilizando análise de Western blot. Estas linhas de células mostraram um elevado nível de expressão PKM2. Então, linhas celulares de cancro gástrico estáveis ​​com uma expressão PKM2 alterada foram estabelecidos utilizando RNA de interferência (PKM2 knockdown) nas células BGC823, SGC7901 e AGS. Como mostrado na Fig. 1A, as linhas celulares BGC823, SGC7901 e AGS com PKM2 knockdown foram estabelecidos. Observou-se que a proliferação foi reduzida nas células BGC823 AGS e depois PKM2 foi empobrecido (Fig. 1B). Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores.

Para examinar o efeito do PKM2 sobre a migração e invasão celular, empregamos bem estabelecida de cicatrização de feridas e transpo� ensaios para caracterizar a resposta motilidade celular na BGC823 e SGC7901 células . Uma camada confluente de células foi incubada primeiro a noite em meio, uma ferida zero foi introduzida, meio contendo a dose mais adequada de EGF (100 ng /ml) foi adicionado para estimular a migração, e observou-se a percentagem de selagem de feridas após 24 h ( Figura S1). As células invasoras foram quantificadas após 36 h de EGF (100 ng /ml) foi adicionada à câmara inferior. Os resultados indicam que o tratamento de BGC823-sipk e células SGC7901-sipk com EGF na sequência de uma ferida zero e no Transwell aumentou significativamente a taxa de cicatrização da ferida (Fig. 1 C, D) e invasão (Fig. 1 E, F) comparada com a das células de controlo.

o esgotamento dos PKM2 Diminuição da e-caderina Expressão e aumentar as atividades da EGF /EGFR Downstream vias de sinalização PLC-γ1 e ERK1 /2

Para investigar a mecanismo de mudanças na migração celular e invasão após o knockdown de PKM2, analisou-se a expressão de membros da Ca ^{2 + -dependente moléculas de adesão celular família e metaloproteinases. Nós descobrimos que os níveis de expressão da proteína E-caderina foram diminuídos em BGC823 e SGC7901 células quando a expressão PKM2 foi reduzida (Fig. 2A).}

O nível de ARNm da E-caderina e a fosforilação da E-caderina foram determinados em BGC823 e SGC7901 células com depleção PKM2 para avaliar se a diferença observada na expressão de e-caderina ocorreu pré ou pós-tradução. Observou-se a sub-regulação de E-caderina e ARNm aumentou a fosforilação, a qual induz a endocitose de E-caderina, em células empobrecido-PKM2 (Fig. 2A, B). Também descobrimos que o nível da proteína N-caderina expressão foi aumentado nas linhas celulares e BGC823 SGC7901 quando PKM2 foi empobrecido (Fig. 2A).

A migração celular e invasão são em grande parte regulados pela actividade de EGFR. Para analisar se a EGFR está envolvido na migração e invasão de BGC823 e SGC7901 células, estas células foram tratadas com o EGF, o qual se liga ao EGFR e activa as vias de sinalização a jusante. O tratamento com EGF resultou na fosforilação do EGFR e a activação subsequente do PLCγ1, AKT e ERK1 /2 vias (Fig. 2C). Descobrimos que PLC γ1 tinha um nível mais elevado de actividade nas células empobrecido-PKM2 do que em células empobrecido-un quer após um (24 h) de incubação de curta ou longa com EGF. No entanto, não houve diferença acentuada na actividade de AKT entre as células empobrecido-PKM2 e células não-empobrecido. PLCy é um regulador chave da migração das células a jusante de sinalização RTK [11]. A fosforilação em tirosina do resíduo 783 PLCγ1 é crítico para a sua activação [12]. PLCγ1 activação reforçada motilidade celular, e este efeito foi observado nos ensaios de raspar ferida e Transwell, como observado na Fig. 1C.

A seguir investigou o efeito de um ligando de EGFR sobre a expressão de MMP usando RT-PCR em BGC823-sipk e células SGC7901-sipk em comparação com as respectivas células de controlo. O tratamento com o ligando de EGFR, o EGF, aumentou a expressão de MMP ao nível da transcrição em BGC823 e SGC7901 células. No entanto, não houve diferenças óbvias nos níveis de MMP2 e MMP9 entre células empobrecido-PKM2 e as suas células de controlo de expressão (dados não mostrados). expressão MMP7 foi sobre-regulada em células empobrecido-PKM2 com tratamento com EGF (Fig. 2D). As vias de ERK /MAPK, desempenham papéis críticos na expressão de EGFR induzida por ligando de MMP7. Além disso, foi observado um aumento evidente na atividade ERK1 /2, após 0 h e 24 h de tratamento com EGF em células com depleção de PKM2.

O esgotamento dos PKM2 atenuou a mobilidade das células AGS e as alterações funcionais depois de resgatar PKM2 em linhas celulares de cancro gástrico

a expressão da proteína e-caderina em linhas celulares de cancro gástrico BGC823, SGC7901 AGS e foi avaliada com análise de Western blot. As linhas celulares BGC823 e SGC7901 expressam caderina-E. Em contraste, as células AGS falta expressão de E-caderina (Fig. 3A).

Para examinar o efeito do knockdown PKM2 na migração celular e invasão em células AGS, empregamos bem estabelecido de cicatrização de feridas e para ensaios de Transwell caracterizar a motilidade celular. Uma camada confluente de células foi incubada durante a noite em meio de primeiro, um arranhão ferida foi introduzido, meio contendo EGF (100 ng /ml) foi adicionado para estimular a migração, e observou-se a percentagem de selagem de feridas após 24 h. As células invasoras no ensaio Transwell foram quantificadas após 24 h de EGF (100 ng /ml) foi adicionada à câmara inferior. Para nossa surpresa, descobrimos que o tratamento de células AGS-sipk com EGF após a zero ferida e na Transwell diminuiu significativamente a taxa de vedação e invasão ferida comparada com a das células de controlo (Fig. 3B e C). Houve diferenças notáveis ​​entre a BGC823 /SGC7901 e células AGS.

Para ilustrar ainda mais o papel de PKM2 na motilidade celular, fizemos o PKM2 resgatando experiências. Nós Taked estavelmente transfectadas método usando a sobre-expressão plasmídeo vector pcDNA6.0-simulada e pcDNA6.0-PKM2 para lidar com BGC823 e AGS células que estável knockdown PKM2. A expressão de p-EGFR, E-caderina foram mostradas nas experiências PKM2 emergência (Fig. 3D). Observou-se que quando a expressão PKM2 recuperado, a fosforilação do EGFR foi significativamente reduzida em BGC823 células e aumento nas células AGS. Por outro lado, a motilidade de células de BGC823 células foi reduzida e células AGS foram declinou depois PKM2 emergência (Fig. 3E). Para esclarecer o mecanismo dessas diferenças, nós então analisada a actividade da /via de sinalização EGFR EGF.

PKM2 aumentar as atividades das EGF /EGFR vias de sinalização a jusante em células AGS e foi correlacionada com a atividade de ERK em gástrica amostras do cancro

para se analisar o EGFR podem estar envolvidos na migração e invasão de células AGS, estas células foram tratadas com o EGF, o qual se liga ao EGFR e activa as vias de sinalização a jusante. tratamento com EGF resultou na fosforilação do EGFR e a activação subsequente dos caminhos de EGFR a jusante, incluindo a PLCγ1 e ERK1 /2 vias (Fig. 4A). Verificou-se que as actividades de PLCγ1 e ERK1 /2 foi maior em células em que não foi PKM2 empobrecido do que nas células empobrecido-PKM2 Após qualquer um (24 h) de incubação de curta ou longa com EGF. Este resultado é o oposto do que foi observado com o BGC823 e SGC7901 células; em células AGS, PKM2 entrou em jogo como um estímulo e promoveu a migração e invasão celular. A seguir, investigou expressão MMP7 utilizando RT-PCR em células AGS-sipk e as células de controlo. O tratamento com EGF expressão aumentada MMP7 ao nível da transcrição em células AGS-pu6 mas não em células AGS-sipk (Fig. 4B). A actividade de ERK1 /2 era, obviamente, maior em células AGS-pu6 em comparação com células AGS-sipk após 0 h e 24 h de tratamento com o EGF (Fig. 4A).

próxima realizada imuno-histoquímica (IHC) para análises examine expressão da caderina-e, PKM2 localização e ERK1 /2 fosforilação em cortes seriados de 15 amostras de cancro gástrico humano utilizando anticorpos com as especificidades validados. A Figura 4C mostra que os níveis de expressão de E-caderina, ERK1 fosforilação 2 /, e expressão citoplasmática PKM2 foram correlacionados uns com os outros. Além disso, observou-se um elevado nível de fosforilação de ERK1 2 /no núcleo de células cancerosas sem expressão de E-caderina. Em áreas de ERK1 2 fosforilação /, também encontramos níveis mais elevados de expressão PKM2. No entanto, não encontramos a fosforilação de ERK1 /2 em áreas positivas para a expressão da caderina-E (Fig. 4C). Uma análise de correlação entre PKM2, caderina-E e P-ERK1 /2 foi realizado usando o programa Image-Pro Plus Software (Fig. 4D). A densidade média (IOD /área) foi gravado em diferentes áreas positivas de 15 amostras de cancro gástrico humano. Encontramos uma correlação significativa entre PKM2 e E-caderina em áreas de E-caderina positivo. Além disso, houve uma correlação significativa entre PKM2 e p-ERK1 /2 em áreas de E-caderina negativo.

Discussão

O estágio invasivo e metastático de progressão do cancro correlaciona-se com mau prognóstico clínico e representa a barreira mais formidável para o sucesso do tratamento. motilidade celular e invasão são as características que definem a tumores malignos, que permitem que as células tumorais a migrar para tecidos adjacentes ou por limitar membranas basais e matrizes extracelulares. motilidade celular é necessária para os processos fisiológicos de reparação de feridas e a organogénese e para o processo patológico da invasão tumoral [13]. células tumorais invasivas são caracterizadas por motilidade celular desregulado em resposta a sinais extracelulares a partir de factores de crescimento e citocinas. tumores humanos expressam níveis elevados de factores de crescimento e seus receptores, e muitos tipos de células malignas parecem exibir crescimento autocrine- ou estimulada por parácrina. Entre os sistemas de receptores do factor de crescimento mais bem estudados da família é o receptor de EGF [14]. Os sinais provenientes do meio extracelular ditar a motilidade celular. Muitos factores de crescimento, incluindo os ligandos que actuam através do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), melhorar a motilidade das células [15]. Pelo menos duas vias de sinalização intracelulares distintos são necessários para a motilidade celular mediada pelo EGFR: as vias que utilizam PLC γ e a via da MAP cinase. γ actividade PLC tem sido propostas para aumentar a motilidade celular através da mobilização de proteínas de modificação de actina a partir de uma localização associada à membrana inactivo para um local sub-membrana do citoesqueleto activa [16]. As MAP cinases Erk transmitir sinais para o núcleo, bem como sinais que regulam ligações célula-matriz.

caderinas compreendem uma grande família de moléculas de adesão célula-célula, que incluem a clássica, desmossomal, e caderinas atípicos. E-caderina, que é expresso principalmente nas células epiteliais, é uma proteína de adesão que é codificada pelo gene e funções CDH1 em vários processos, incluindo o desenvolvimento, a integridade do tecido, a migração celular, morfologia, e polaridade [17], [18], [19]. E-caderina é também um supressor de tumor cuja expressão é frequentemente reduzida ou silenciada, e a sua re-expressão pode induzir reversão morfológica [20], [21]. A activação dependente de EGF do EGFR foi relatada a ser inibida de um modo dependente da E-caderina-adesão, que inibe a activação dependente do ligando de diferentes receptores de tirosino quinases. N-caderina, tal como um promotor de invasão, é frequentemente regulada positivamente. A expressão de N-caderina nas células epiteliais induz alterações na morfologia fibroblástica a um fenótipo, tornando as células mais móveis e invasiva. Estudos recentes indicam que as células cancerosas têm-regulada N-caderina para além da perda de E-caderina. Esta mudança na expressão da caderina é chamado de "switch caderina".

Foi observada uma diminuição da regulação da caderina-E mRNA e aumento da fosforilação, que induz a endocitose de E-caderina, em células com depleção de PKM2. Descobrimos também que o nível de expressão da proteína N-caderina foi aumentada na linha celular BGC823 quando PKM2 foi esgotado. O knockdown de PKM2 promovido migração e invasão celular em BGC823 e SGC7901 células com estimulação EGF. Um aumento da atividade do EGFR é o fator crítico na determinação da motilidade celular e invasão das células BGC823 e SGC7901. Colocámos a hipótese de que a infra-regulação da expressão de E-caderina reforçada a fosforilação do EGFR e activadas vias de sinalização a jusante os quais incluem, PLCγ1 e ERK1 /2. PLC activação γ aumenta a motilidade celular, e a actividade de ERK1 /2 desempenha um papel crucial na expressão de MMP7.

As metaloproteinases de matriz (MMPs) têm sido implicados na invasão e metástase do cancro devido à sua matriz extracelular (MEC) A atividade -proteolytic [22]. MMP-7 tem sido relatada a ser produzida por células de carcinoma gástrico e está significativamente associado com os fenótipos patológicos agressivas de cancro gástrico [23]. MMP-7 pode activar pró-MMP-1, tem uma forte actividade de estromelisina-like e degrada elastina insolúvel, colagénio tipo IV, laminina-1, fibronectina, proteoglicanos e gelatinas [24]. As vias de ERK /MAPK, desempenham papéis críticos na expressão MMP7 induzida por EGF [25].

E-caderina é uma glicoproteína de adesão celular caracterizado pela primeira vez em linhagens de células humanas por Shimoyama et al [26]. O seu papel no desenvolvimento do cancro gástrico foi definida pela primeira vez por Guilford et al [27]. Existe uma correlação significativa entre o grau de expressão de E-caderina e o grau de diferenciação do tumor, bem como o tipo histológico de acordo com a Lauren e as classificações da OMS. Pacientes com tumores de E-caderina positivos têm significativamente melhores taxas de sobrevivência de 3 e 5 anos do que pacientes com tumores de E-caderina negativo [28]. câncer gástrico difuso hereditário (HDGC) é uma síndrome autossômica dominante rara, que é em grande parte atribuível a mutações germinativas e deleções no gene CDH1 associada a um início precoce, câncer histologicamente difuso, anel de sinete tipo de célula gástrica [29], [30].

Lim JY et al relataram que a expressão PKM2 foi fortemente correlacionada com a diferenciação câncer gástrico. tipos diferenciados de cancros expressar mais proteína PKM2 do que os tipos indiferenciadas; em contraste, maior expressão PKM2 está correlacionada com menor sobrevida global independente da fase em cânceres de células em anel de sinete. expressão PKM2 pode ser um fator prognóstico adverso para carcinomas de células em anel de sinete, que carecem de E-caderina [7]. Estes resultados estão em conformidade com a nossa investigação em células cancerosas gástricas. O BGC-823, SGC-7901 e linhas de células AGS é diferente tipos diferenciados. A expressão da E-caderina existe nas linhas de células de SGC-7901 e BGC-823; Em contraste, as células AGS foram derivadas a partir de tecido de adenocarcinoma gástrico maligno e falta de adesão celular mediada por E-caderina [31]. Observou-se que o knockdown de PKM2 promoveu a migração e invasão das linhas celulares SGC-7901 e BGC-823, mas suprimiu estas propriedades na linha celular AGS. Outro grupo relatou que piruvato-quinase M2 tipo é regulada positivamente em cancro colorrectal, e o knockdown de PKM2 suprimiu a proliferação e migração de células de cancro do cólon RKO [32]. Sabemos que as células RKO não possuem a expressão de E-caderina [33]. Imuno-histoquímica análise (IHC) demonstra que os níveis de expressão de E-caderina, ERK1 fosforilação 2 /, e expressão citoplasmática PKM2 foram correlacionados uns com os outros. Encontramos um alto nível de ERK1 2 fosforilação /no núcleo das células cancerosas sem expressão da caderina-E, mas com um alto nível de expressão PKM2.

Nossa hipótese é que PKM2 atenua motilidade celular e invasão quando a E-caderina é presente. Esta nova função de PKM2 pode jogar um papel na inibição reversível da motilidade celular e invasão nas fases iniciais do cancro gástrico quando as células são positivas para a expressão de E-caderina. Durante a progressão do tumor, a falta de ou muito baixa expressão de E-caderina induz uma função agressiva de PKM2 no tumor. O papel biológico de PKM2 no desenvolvimento desses tumores deve ser ainda elucidado.

Informações de Apoio
Figura S1.
A expressão da proteína EGFR nas linhas celulares de cancro gástrico BGC823, SGC7901 AGS e foi avaliada utilizando análise de Western blot. AGS células mostraram um nível mais elevado de expressão de EGFR do que as outras duas linhas celulares. Não há nenhuma diferença significativa entre BGC823 SGC7901 e células (Figura S1A). Células BGC-pu6 e células BGC-sipk foram tratados com diferentes doses de EGF. Após 40 minutos, nós detectamos o nível de fosforilação de EGFR. Nós encontramos o mais alto nível de fosforilação na dose de 100 ng /ml (Figura s1b). Por isso escolhemos a dose de 100 ng /ml como o candidato mais adequado. O experimento transpoço também mostrou a capacidade mais forte para penetrar na martrigel em BGC823 células (Figura s1c)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067542.s001
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