Oscilador genético captura mudanças nos padrões de crescimento do microbioma intestinal

Por toda a atenção que o microbioma humano tem recebido nos últimos anos, um aspecto dessa pesquisa raramente chega às manchetes:a dificuldade de observar como ela muda com o tempo em resposta a vários estímulos. O método de análise mais comum é extrair bactérias de amostras fecais e, em seguida, sequenciar seus genomas, mas esta abordagem, embora minimamente invasivo, perde informações cruciais sobre onde e quando as alterações bacterianas ocorrem no intestino, fornecendo aos cientistas uma imagem incompleta da dinâmica do microbioma.

Agora, uma nova ferramenta criada por pesquisadores do Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering da Harvard University e da Harvard Medical School (HMS) fornece uma solução para este problema na forma de um conjunto de genes bacterianos que foram projetados para detectar e registrar mudanças no crescimento de diferentes populações de bactérias ao longo do tempo nas entranhas de camundongos vivos com precisão de uma única célula, e pode servir como uma plataforma para complexos, diagnósticos e terapêuticos baseados em biologia sintética para uma variedade de aplicações no intestino. O estudo é publicado em Nature Communications .

Manter o tempo

O sistema usa um circuito genético oscilante, chamado de repressilador, como uma espécie de relógio genético para medir o crescimento bacteriano. O repressilador consiste em três genes bacterianos que codificam três proteínas (tetR, cl, e lacI), cada um dos quais bloqueia a expressão de uma das outras proteínas. Os genes estão ligados a um ciclo de feedback negativo, de modo que quando a concentração de uma das proteínas repressoras cai abaixo de um certo nível, a proteína que estava reprimindo é expressa, que bloqueia a expressão da terceira proteína, e o processo se repete de forma cíclica.

Quando todos os três genes são inseridos em um plasmídeo e introduzidos nas bactérias, o número de ciclos de ciclo de feedback negativo concluídos pode servir como um registro de quantas divisões celulares as bactérias foram submetidas. Cada vez que a bactéria se divide, quaisquer proteínas repressoras presentes em seu citoplasma são diluídas, assim, sua concentração cai gradualmente e dispara a expressão da próxima proteína no ciclo do repressilador. Crucialmente, o ciclo do repressilador se repete após 15,5 gerações bacterianas, independentemente de quão rápido ou lentamente as bactérias estão crescendo. Isso permite que ele atue como uma medida objetiva de tempo, muito parecido com um relógio ou um relógio.

"Imagine se você tivesse duas pessoas usando dois relógios diferentes, e o ponteiro dos segundos no relógio de uma pessoa estava se movendo duas vezes mais rápido que o da outra pessoa, "explicou o primeiro autor David Riglar, Ph.D., um ex-pós-doutorado no Wyss Institute e HMS que agora lidera um grupo de pesquisa como Sir Henry Dale Fellow no Imperial College London. "Se você parasse os dois relógios depois de uma hora, eles não concordariam que horas eram, porque sua medição de tempo varia com base na taxa de movimento do ponteiro dos segundos. Em contraste, nosso repressilador é como um relógio que sempre se move na mesma velocidade, então não importa quantas pessoas diferentes estejam usando um, todos eles darão uma medição consistente do tempo. Essa qualidade nos permite estudar com mais precisão o comportamento das bactérias no intestino. "

Os pesquisadores acoplaram cada uma das três proteínas repressoras a uma molécula fluorescente de cor diferente, e desenvolveu um fluxo de trabalho de imagem chamado RINGS (inferência de crescimento baseada em repressilador no nível de célula única) para rastrear qual proteína é expressa em diferentes pontos de tempo durante o crescimento da bactéria. "À medida que uma colônia bacteriana cresce para fora, o circuito repressilador cria essas diferentes fluorescentes, assinaturas semelhantes a anéis de árvore com base nas proteínas repressoras ativas na única bactéria que deu início à colônia, "disse Riglar." O padrão dos anéis fluorescentes registra quantos ciclos de repressilador ocorreram desde o início do crescimento, e podemos analisar esse padrão para estudar como as taxas de crescimento variam entre as diferentes bactérias e em diferentes ambientes. "

Usando RINGS, a equipe foi capaz de rastrear com sucesso as divisões celulares em várias espécies bacterianas diferentes cultivadas in vitro, e observaram que a duração do ciclo repressilador da bactéria permaneceu consistente quando elas foram cultivadas em amostras extraídas de intestino de camundongo (para simular um microambiente complexo) ou expostas a um antibiótico (para simular condições de estresse e padrões de crescimento inconsistentes).

Mudança de rastreamento

Para avaliar o desempenho do repressilador in vivo, a equipe administrou E. coli contendo o circuito repressilador em camundongos por via oral, em seguida, analisou as bactérias extraídas de amostras fecais. O repressilador permaneceu ativo por até 16 dias após a introdução, mostrando que a expressão gênica oscilatória de longo prazo pode ser mantida em bactérias intestinais em mamíferos vivos. A análise RINGS detectou com sucesso mudanças nos padrões de crescimento bacteriano, e bactérias cujos circuitos repressiladores estavam em estágios diferentes poderiam ser "sincronizados" dando aos camundongos um composto em sua água potável que interrompia o ciclo do repressilador em um determinado estágio.

Finalmente, os pesquisadores testaram a capacidade do repressilador de detectar diferenças nas taxas de crescimento bacteriano que foram observadas como resultado da inflamação intestinal. Os camundongos receberam um composto indutor de inflamação, seguido por bactérias carregadas com repressilador. Depois de 15 horas, A análise RINGS mostrou que as bactérias de camundongos com inflamação tinham repressiladores em uma gama mais ampla de fases em comparação com bactérias de camundongos de controle, sugerindo que a inflamação produz um ambiente que leva a inconsistências no crescimento bacteriano, potencialmente levando a desequilíbrios no microbioma intestinal.

Este repressilador nos permite realmente sondar os meandros do comportamento bacteriano no intestino vivo, não apenas em estados saudáveis ​​e doentes, mas também espacial e temporalmente. O fato de podermos ressincronizar o repressilador quando ele já está no intestino, bem como mantê-lo sem a necessidade de administrar antibióticos seletivos, também significa que podemos estudar o microbioma em um estado mais natural com o mínimo de interrupção. "

Pamela Silver, Ph.D., autor correspondente, Membro do corpo docente do Instituto Wyss, Elliot T. e Onie H. Adams Professor de Bioquímica e Biologia de Sistemas no HMS

Além de compreender a dinâmica do microbioma, o repressilador desbloqueia o potencial para complexos, diagnósticos e terapêuticos baseados em biologia sintética para o intestino humano. As aplicações potenciais incluem a criação de um sistema que é programado para iniciar uma cascata de transcrição gênica em um determinado ponto do ritmo circadiano, ou um diagnóstico que registra quanto tempo passou após a detecção de um determinado biomarcador.

"Esta pesquisa não resolve apenas um problema específico relacionado ao monitoramento de mudanças dinâmicas na fisiologia do microbioma dentro do intestino vivo, ele fornece uma plataforma que pode levar a tipos inteiramente novos de diagnósticos e até mesmo a terapias dependentes do tempo ", disse o diretor fundador da Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., que também é o professor Judah Folkman de Biologia Vascular no HMS e do Programa de Biologia Vascular no Hospital Infantil de Boston, bem como Professor de Bioengenharia na Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas John A. Paulson de Harvard.

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