expressão do receptor de angiotensina II e sua relação com pylori infecção por Helicobacter no estômago do gerbilo da Mongólia

Angiotensina II a expressão do receptor e sua relação com Helicobacter pylori -infecção
no estômago do gerbilo da Mongólia da arte abstracta
Fundo
O papel do sistema renina-angiotensina na fisiologia gástrica e doença tenha ainda sido escassamente explorado. O primeiro objetivo do estudo foi investigar a presença de linha de base e localização dos receptores da angiotensina II (AT1R e AT2R) no estômago do gerbilo da Mongólia. Um segundo objetivo foi elucidar se a presença de infecção por H. pylori
está associada a alterações na expressão desses receptores.
Métodos
H. pylori
-negative e H. pylori
infectadas (estirpe SS1 ou TN2GF4) gerbilos da Mongólia machos foram investigados. Os estômagos foram examinados em seis ou 12 meses após a inoculação através da utilização de imuno-histoquímica, western blot e morfometria microscópica.
Resultados
AT1R e AT2R foram localizados numa variedade de células na parede gástrica do gerbil, incluindo uma subpopulação de células endócrinas na mucosa antral e células inflamatórias infiltrantes H. pylori
estômagos infectados. Os gerbos infectados com a estirpe SS1 mostrou um aumento significativo da expressão de proteína do AT1R antral e um aumento do número de leucócitos polimorfonucleares infiltrantes (PMN) aos 12 meses. A expressão da proteína AT1R correlacionada com o número de PMN e a expressão antral de mieloperoxidase.
Conclusões
receptores da angiotensina II estão presentes numa variedade de células na parede gástrica do gerbilo da Mongólia. Os resultados indicam uma influência dependente da estirpe de H. pylori
sobre a expressão do AT1R gástrica e uma relação entre a expressão do AT1R gástrica e a infiltração da mucosa PMN.
Fundo
O papel do sistema renina-angiotensina (RAS) em fisiologia gástrica e doença tem sido ainda pouco explorado. Alguns estudos relataram as acções da angiotensina II (Ang II) sobre o fluxo sanguíneo da mucosa, a secreção de ácido e contração do músculo liso [1-3]. Outros têm implicado a influência da RAS em lesão gástrica induzida pelo estresse e danos de isquemia /reperfusão da mucosa gástrica [4, 5].
A personagem endócrino clássico de RAS é bem conhecido por seus efeitos sobre a regulação hemodinâmica e homeostase dos fluidos corporais. Menos é conhecido acerca do impacto regulador de tecido com base SRA local que tenha sido demonstrada num certo número de órgãos, e.g. do cérebro, do pâncreas, do esófago e do cólon [6-8]. produção intersticial de Ang II pode ocorrer após a produção local de angiotensinogênio (AGT), ACE e renina, ou através de vias alternativas, incluindo a clivagem de circular AGT por outras enzimas expressas localmente, tais como catepsina D e quimase [9]. Ang II funciona principalmente através de dois receptores, designado Ang II tipo 1 receptor (AT1R) e receptor de tipo 2 Ang II (AT2R). Por conseguinte, o mapeamento da expressão e localização de receptores de Ang II é de grande importância em explorar o potencial de sinalização de Ang II em diferentes configurações fisiológicos e patológicos. Nos últimos anos RAS foi mostrado para ser envolvida em várias condições patológicas, tais como a inflamação, a cura de feridas e carcinogénese [10, 11]. Estudos epidemiológicos também têm demonstrado associações entre o polimorfismo relacionado RAS gene (SNPs) e para o desenvolvimento da úlcera péptica e câncer gástrico [12, 13]. No entanto, as associações entre a expressão tecidual de receptores de Ang II e infecção pelo Helicobacter pylori
não foram relatados. O potencial do RAS para modular reações inflamatórias locais faz com que seja de interesse para investigar sua relação com a gastrite bem definida evocado por H. pylori
.
No presente estudo, examinamos a expressão de receptores de Ang II no não infectado e H. pylori
gerbilo da Mongólia infectado. Este modelo animal é interessante, porque ele pode facilmente ser infectados com H. pylori
, dando uma inflamação crónica activa com alterações patológicas que imitam a maioria das lesões encontradas nos seres humanos, incluindo úlceras gástricas, metaplasia intestinal gástrica e um cancro gástrico semelhante imagem [14]. Se H. pylori
infecção por si só causa câncer gástrico em gerbilos da Mongólia permanece em debate [15].
Um primeiro objetivo do estudo foi investigar a presença de base e localização do AT1R eo AT2R no estômago do gerbilo da Mongólia. Um segundo objetivo foi elucidar se a presença de infecção por H. pylori
está associada a alterações na expressão desses receptores.
Métodos
Animais
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experiências em animais da Universidade de Gotemburgo. Trinta agentes patogénicos livres (SPF) gerbos específicas do sexo masculino Mongolian (Charles River, Uppsala, Suécia), sete semanas de idade, foram utilizados. Eles foram separados aleatoriamente em três grupos de igual tamanho, composto por um grupo controle e dois grupos que estavam a ser infectados com H. pylori
. Cinco animais foram mantidos em cada gaiola e a sala foi regulada em relação à temperatura (18-22 ° C), humidade (cerca de 55%) e ciclo luz /escuro (12 /12h). Os gerbos tiveram livre acesso a comida (2016F, Harlan Tek. Lab, Blackthorn, Inglaterra) e água potável. Eles foram autorizados de uma semana de aclimatação antes da inoculação.
Cepas bacterianas e inoculação of Two H. pylori
cepas diferentes foram usados ​​para inoculação, a estirpe TN2GF4 [16] ea tensão Sydney 1 (SS1) [ ,,,0],17]. Ambas as estirpes são conhecidos por causar uma inflamação crónica activa na mucosa antral e corporal gástrica gerbil. As bactérias foram cultivadas em placas de Columbia. Estas culturas foram então usadas para inocular 500 ml de caldo de Brucella contendo 5% de soro de vitelo recém-nascido, 10 ug /ml de vancomicina e 5 ug /ml de trimetoprim. Os frascos foram incubados durante 24 horas em condições aeróbicas a 37 micro ° C. As bactérias foram examinadas por microscopia de contraste de fase, antes de serem administrados aos animais. Os gerbos foram infectados com 0,5 ml da suspensão bacteriana ou caldo de Brucella apenas (controles) usando uma agulha de alimentação. contagens viáveis ​​foram feitas na suspensão para determinar as doses infecciosas reais, que eram 7 × 10 7 unidades e 4 × 10 7 unidades para SS1 e TN2GF4, respectivamente.
Curso de tempo e sacrifício
após um período de jejum de 24 horas com livre acesso a água potável, cinco animais de cada grupo foram sacrificados seis ou 12 meses após a inoculação. Os animais foram anestesiados por injecção intraperitoneal de medetomodin (0,5 mg /kg) e cetamina (75 mg /kg). Uma laparotomia na linha média foi realizada e os estômagos foram, em seguida, removido e aberto ao longo da grande curvatura. Uma metade foi utilizada para a cultura, e os espécimes foram coletados a partir da outra metade para análises histológicas e análise de western blot. Os animais foram sacrificados por incisão cardíaca. Os achados histopatológicos e estado bacteriológico foram relatados anteriormente [14].
Imunohistoquímica
Os espécimes parede cheia (antro e do corpo) foram coletadas imediatamente após a abertura dos estômagos, fixadas em Histofix (produtos Histolab AB, Gotemburgo, Suécia ) à temperatura ambiente (TA) durante a noite e depois lavadas em PBS durante 24 horas. Os espécimes foram subsequentemente desidratados, embebidos em parafina, cortadas em 5-u
secções espessas e montadas em lâminas de vidro. Antes da coloração, immunohistocemical, as secções foram desparafinadas e fervidas em tampão de ácido cítrico (0,01 M, pH 6,0, 10 min). O TM Sistema Immunocruz de coloração (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foi utilizado para o protocolo de imuno-histoquímica. Depois de inibição da actividade da peroxidase endógena, a ligação não específica de anticorpos secundários foi bloqueada por incubação com soro de cabra normal durante 30 min à TA. A seguir dois anticorpos primários policlonais, diluições e tempos de incubação foram então usadas: de coelho anti-AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech, 1: 100 em PBS, 2 horas à temperatura ambiente) e de coelho anti-AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech, 1: 100 em PBS, 2 horas à temperatura ambiente). Após incubação com anticorpos primários, as secções foram lavadas três vezes em PBS e sondadas com um anticorpo secundário biotinilado; o complexo foi detectada utilizando peroxidase de rábano -streptavidin (HRP) e a cor foi desenvolvida utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
Uma forte coloração inesperada, de células com um aspecto típico de células endócrinas foi observada após coloração imuno-histoquímica com este método baseado peroxidase. Immunoflourescens marcação foi feito para excluir ainda mais a possibilidade de que esta coloração foi um resultado de biotina endógena, de actividade de peroxidase endógena ou de ligação não específica do anticorpo secundário. O seguinte protocolo foi utilizado: depois de ferver no tampão de ácido cítrico, a ligação não específica de anticorpos secundários foi bloqueada por incubação com soro normal de cabra (sc-2043, Santa Cruz Biotech) durante 30 min à TA. As secções foram incubadas com anticorpos primários como acima. As lâminas foram então lavadas três vezes em PBS e sondadas com um anticorpo secundário de Alexa Flour 488 de IgG anti-coelho de cabra conjugado com (A-11034, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, EUA), diluída a 1: 400 em PBS durante 1 hr à TA. As lâminas foram em seguida lavadas três vezes em PBS e montadas com meio de montagem de fluorescência (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), após o que as imagens foram capturadas com um microscópio de fluorescência. Para confirmar a localização de AT1R em células endócrinas, dupla imunomarcação foi realizada utilizando o descrito protocolo acima peroxidase de base para AT1R e o protocolo immunoflorescens rotulagem acima descrito para um anticorpo primário contra cromogranina A (C-20, Santa Cruz Biotech, 1: 100 em PBS, 2 horas à temperatura ambiente). Não ligação do anticorpo secundário (Alexa Flour 568-conjugada de burro anti-IgG de cabra, A-11057, Molecular Probes Inc, 1: 800 em PBS, 1 h a RT) específica foi bloqueada por incubação com soro de burro normal (sc-2044 , Santa Cruz Biotech). Preabsorpion com um excesso (5 ×) bloqueando péptido (SC-1173P, Santa Cruz Biotech) foi realizada como um controlo para a especificidade do anticorpo AT1R, enquanto o anticorpo primário foi omitido para o AT2R.
O gerbil AT1R e AT2R ter > 90% de aminoácidos de identidade de sequência de homologia com humano, rato e Ang rato receptores II [18, 19]. Em gerbilos, como em ratos e ratinhos, há dois subtipos AT1R (AT1aR e AT1bR) que são codificadas por genes diferentes, mas com 95% de homologia de sequência de aminoácidos. Estes subtipos de receptor são conhecidos por ser diferencialmente localizada e regulada, mas tem uma afinidade semelhante para Ang II. Devido à elevada homologia de sequência de aminoácidos entre o gerbil AT1aR e AT1bR, assumiu-se afinidade de ligao igual aos subtipos AT1R para o anticorpo AT1R utilizado no presente estudo. Além disso, os anticorpos utilizados para os receptores de coloração Ang II são estabelecidos pelo fabricante, em camundongos, ratos e seres humanos. Portanto, para confirmar a especificidade destes anticorpos em roedores, as secções de blocos embebidos em parafina de gerbilo normal e glândulas supra-renais humanas foram coradas como acima (excepto que ambos os anticorpos primários foram diluídos 1:50 em PBS) e os padrões de distribuição para a Ang II Os anticorpos do receptor foram estudados. Os estudos de distribuição adrenais mostraram que o anticorpo anti-AT1R células corticais supra-renais predominantemente manchado na zona glomerular (coloração da cápsula em torno da glândula, células vasculares de músculo liso (VSMC) e células endoteliais também foi observado) em ambos gerbilo e secções humanos. O anticorpo anti-AT2R células coradas medula adrenal e células da zona glomerular no gerbilo e glândula supra-renal humana (coloração de VSMCs e as células endoteliais também foi observado usando este anticorpo). Estes resultados concordam com estudos previamente relatados [20], e a forte semelhança dos padrões de coloração do gerbil e as glândulas supra-renais humanos suportar uma utilidade geral dos anticorpos nos tecidos gerbil.
Western blot Depois de abrir os estômagos, espécimes de parede antral espessura completa foram imediatamente removidos, congelados em azoto líquido e armazenado a -70 ° C. As amostras foram homogeneizadas em gelo (Polytron PT-MR 2100, Kinematica, Suíça) em tampão A (10% de glicerol, Tris-HCl 20 mM pH 7,3, NaCl 100 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, EDTA 2 mM, 2 nM de EGTA , ortovanadato de sódio 10 mM, 10 ug /ml de leupeptina e 10 ug /ml de aprotinina) [21] e centrifugadas a 30000 g durante 30 min a 4 ° C. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão B (1% de NP-40 [Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suécia] em tampão A) e agitou-se a 4 ° C durante 1 h antes de centrifugação a 30.000 g durante 30 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram analisados ​​quanto ao teor de proteína pelo método de Bradford [21] e armazenadas a -70 ° C até análise posterior. As amostras foram diluídas em tampão de SDS e aquecido a 70 ° C durante 10 min antes de serem carregadas num gel de 10% NuPage BisTris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Uma faixa foi carregada com padrões de peso molecular prestained (SeeBlue ™, Invitrogen AB, Lidingo, Suécia), e os lisados ​​de células inteiras de PC-12 (por AT1R; sc-2250, Santa Cruz Biotech), HEP G2 (para AT2R; SC- 2227, Santa Cruz Biotech) e HL60 (para mieloperoxidase (MPO); 12-354, Upstate Lake Placid, Nova Iorque, EUA) foram utilizados como controlos positivos. membranas Polyvinyldifluoride (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) foram incubadas com anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra AT1R (N-10, Santa Cruz Biotech), AT2R (H-143, Santa Cruz Biotech) ou MPO (07-496, Upstate). Um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com fosfatase alcalina (sc-2007, Santa Cruz Biotech para os anticorpos AT1R e AT2R, e IgG 12-448, Upstate, para o anticorpo de MPO) e o substrato CDP-Star (Tropix, Bedford, MA, EUA ) foram utilizados para identificar proteínas imunorreactivas por Quimiluminescência. As imagens foram capturadas por uma câmera CCD refrigerado (LAS-1000; Fujifilm, Tóquio, Japão). E quantificação semi foi feito comparando amostras para controlos positivos utilizando o software calibre 3.3 (Fujifilm, Tóquio, Japão)
microscópica morfometria
espécimes de tecido da parede antrais foram fixadas em Histofix (Histolab Products AB) e embebidos em parafina. Quatro u
de espessura foram montadas em lâminas de vidro e codificados rotineiramente coradas com hematoxilina /eosina (H & E). O grau de infiltração da mucosa do mononucleares e polimorfonucleares leucócitos foi estudada no microscópio de luz. A lâmina tenderá a aumentar de volume em consequência do afluxo de células inflamatórias. Por conseguinte, o volume relativo da lâmina foi avaliada por morfometria para reflectir a infiltração de ambos os mononucleares e polimorfonucleares leucócitos. Isto foi realizado por H.F.H. num microscópio de luz, com uma grelha de 10 x 10 metros quadrados inserido na ocular e uma lente objectiva 25 x. Usando o método de ponto de contagem de [22], a densidade de volume da lâmina foi determinada e expressa em percentagem da mucosa (neste caso definido como a região entre a superfície da mucosa e da parte inferior das glândulas). o volume da mucosa é aqui definida como camada epitelial + lâmina própria. A infiltração da mucosa de leucócitos polimorfonucleares (PMN) foi avaliada por P.H. em um microscópio de luz, com uma grade de 10 × 10 metros quadrados inseridos no ocular, uma lente objetiva de imersão × 50 óleo (N. A. 1.4) e uma lente de imersão em óleo topo do condensador (N. A. 1.4). PMNs foram identificadas como células mais ou menos redondos em lâmina com um núcleo multilobulada ou bilobulados com uma coloração escura. Determinou-se o número de PMN em uma região quadrado da mucosa, assim como o número total de quadrados sobre a lâmina; o número de PMNs é expressa por um milímetro 2 lâmina própria. A contagem foi iniciada a partir da parte inferior das glândulas e terminou após a avaliação de um a sete faixas completas da mucosa, o que resulta em um mínimo de 0,077 mm 2lamina própria analisadas em cada secção. amostragem sistemática com um início aleatório foi utilizado para a seleção das áreas a serem estudadas em ambas as análises. Áreas com folículos linfóides não foram incluídos.
Análise estatística
O teste de Kruskal-Wallis e o significado avaliada Mann-Whitney U-teste nas diferenças de expressão da proteína entre o controle, o TN2GF4-infectados eo SS1-infectados grupos. O teste U de Mann-Whitney avaliada significado em diferenças na infiltração da mucosa de células inflamatórias entre os gerbos infectados e TN2GF4-SS1-infectados. Uma relação linear entre AT1R-proteína e PMN, e uma relação linear entre AT1R e ln (MPO) na mucosa antral, foram testados com correlação de Pearson. Todos os testes foram bicaudais, e significância estatística foi estabelecido em p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS, versão 15.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Resultados
Localização de AT1R e proteína AT2R
Imunoreatividade ao AT1R e as proteínas AT2R foi observada em todos gerbil espécimes estudados, e não a coloração foi observado nas secções de controlo. O anticorpo geralmente AT1R induziu uma coloração mais distinta do que o anticorpo AT2R.
Vários compartimentos de tecido, tanto no corpo e antro, independente da presença ou ausência de infecção por H. pylori
, exibiram imunorreactividade para tanto do Ang II subtipos de receptores (ver Tabela 1 para uma visão geral dos resultados e Figura 1 para secções representativas. veja também adicionais de arquivo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 15 para imagens de alta resolução). Assim, a imunorreactividade para ambos o AT1R e o AT2R foram encontrados em células endoteliais de vasos localizados na lamina própria, na submucosa (Figura 1B) e a muscularis própria, bem como em células do músculo liso da mucosa muscular e muscularis propria (Figura 1C e 1G) e em algumas células mesenquimais localizadas na lamina propria e submucosa. fraca coloração de ambos os receptores também foi observado, principalmente na parte basal da maior parte das células epiteliais. Não foi observada coloração distinta de estruturas neurais intramurais. A imunorreactividade apenas para AT1R foi observado nas células de músculo liso vascular de vasos na submucosa, na muscularis propria e serosas tanto do corpo e partes antral do estômago (Figura 1A e 1G). Curiosamente, uma forte imunocoloração para AT1R apareceu em um subconjunto de células, principalmente na base das glândulas antrais. Estas células mostraram um aspecto típico de células endócrinas, isto é, que eram bastante pequena, com os corpos celulares perto da membrana basal; uma corda estreita de citoplasma foi observado em alguns casos (Figura 1G, 1H e 1I). Essa coloração AT1R não pôde ser encontrado em células endócrinas-like na mucosa oxíntica. imunocoloração dupla para AT1R e para o marcador de pan-endócrino cromogranina A [23] confirmou a localização do AT1R numa subpopulação de células endócrinas no gerbilo mucosa antral (Figura 1M) e 1N .table 1 Localização da proteína AT1R e AT2R na gástrica parede do gerbilo da Mongólia
compartimento de tecido

tipo celular
AT1R

AT2R
Mucosa
epitélio
a maioria das células epiteliais
+, principalmente em partes basais
+ principalmente em peças basais
células epiteliais pequenas na base das glândulas
+++ em algum endócrina como células no antro
não
Lâmina própria
Vasculature
+ no endotélio
+ no endotélio
estruturas nervosas
não
nenhuma
As células mesenquimais
++ em algumas células;
++ em leucócitos no H. pylori
infectado
+ em algumas células;
++ em leucócitos em H. pylori
infectado
camada muscular da mucosa
As células musculares lisas
++
+
submucosa
Vasculature
+ no endotélio;
++ em VSMC
+ em endotélio;
não em VSMC
estruturas nervosas
não
há células mesenquimais
++ em algumas células;
++ em leucócitos no H. pylori
infectado
+ em algumas células;
++ em leucócitos no H. pylori
infectado
muscular própria
músculo liso células
++
+
Vasculature
+ no endotélio;
++ em VSMC
+ no endotélio;
não em VSMC
estruturas nervosas
n.o.
n.o.
Serosa
Vasculature
n.o. no endotélio;
++ em VSMC
não
não: não observado (ou inespecífica) imunorreatividade
+: imunorreatividade fraca, mas com localização distinta
++: facilmente reconhecido imunorreatividade
+ ++: forte imunorreatividade
VSMC: células musculares lisas vasculares
Figura 1 Demonstrando a localização imuno-histoquímica de AT1R e AT2R no estômago do gerbilo da Mongólia. A-F mostra seções da região antral de um gerbil SS1-infectados, 12 meses após a inoculação. A) células do músculo vascular liso (VSMC) em uma artéria localizado na mancha serosa positivo para a proteína AT1R (cor verde). B) As células endoteliais (finais) e células mesenquimais não identificados (M) localizada na submucosa imunorreactividade para a proteína mostrando AT2R. C) As células musculares lisas na camada muscular da mancha muscular própria positiva para a proteína AT2R. D) Um controlo negativo (consecutiva à secção em A) pré-absorvido com o péptido de bloqueio para o anticorpo AT1R, mostrando autofluorescência amarelo a partir de eritrócitos. E & F) Os controlos negativos para o anticorpo AT2R, consecutivos para as seções de B & C, respectivamente. G, H mostram secções da região antral de um animal de controlo 6 meses após a inoculação e a secção em (I) é a partir de um hamster infectado-TN2GF4, 12 meses após a inoculação. imunocoloração forte para AT1R foi encontrado nas células com um aspecto típico de células endócrinas (e). Muscularis mucosae (mm), muscular própria (MP) e células do músculo liso vascular (VSMC) também coradas positivas para o AT1R. Um método baseado peroxidase (coloração castanha) foi usada para a coloração de AT1R em G, H e imunofluorescência (cor verde) foi usada para a coloração de AT1R em (I). J, K e L) secções consecutivas da região antral de um gerbil TN2GF4-infectadas, 6 meses após a inoculação. J) imunocoloração para AT1R (cor verde) mostra agregados de leucócitos (LEU) que expressam a proteína AT1R. K) Um controlo negativo a seção J, mostrando autofluorescência amarelo a partir de eritrócitos. L) A secção consecutiva a seção K, rotineiramente coradas com H & E, confirmando que os agregados são leucócitos. M e N mostra a imunocoloração dupla para AT1R (cor castanha em M) e para o marcador de pan-endócrino cromogranina A (cor vermelha em N) de uma secção antral de um animal de controlo. A seta em branco M e N pontos em uma célula na base de uma glândula antral que coradas positivas para ambos AT1R e cromogranina A. Várias das células positivas cromogranina A não foram imunopositivas para AT1R. Secção O demonstra neutrófilos (PMN) na mucosa antral de um gerbil SS1-infectados, 12 meses após a inoculação.
A intensidade e distribuição da imunorreatividade descrito acima não parecem ser diferentes entre H. pylori
-negative e H. pylori
animais infectados ou entre os animais sacrificados aos seis ou 12 meses após a inoculação. No entanto, observou-se uma diferença óbvia entre H. pylori
pylori
animais infectados -negative e H.: ao contrário dos gerbos não infectadas, as secções de ambos os antro e do corpo de animais infectados mostraram uma abundância de células inflamatórias na lâmina com imunorreactividade para ambos o AT1R e o AT2R. Em um dos animais sacrificados TN2GF4-infectadas em seis meses, os agregados de células inflamatórias foram observadas também na muscularis própria (Figura 1J, 1K e 1L). Não foram observadas diferenças óbvias nos padrões de coloração ou intensidade entre animais infectados com a cepa TN2GF4 ou a estirpe SS1, ou entre animais sacrificados aos seis ou 12 meses após a inoculação.
Quantificação de proteína AT1R e AT2R e relação com células inflamatórias
Devido ao aparecimento imunohistoquímica semelhante dos receptores da angiotensina II no corpo e antro (com a excepção de o AT1R expressando subpopulação de células endócrinas mencionados acima) em ambas as seis e 12 meses, as avaliações quantitativas foram restringidos aos espécimes antrais aos 12 meses após a inoculação .
Ambos AT1R e AT2R proteínas foram identificados por transferência de western em todas as amostras (Figura 2). Após 12 meses de infecção, a expressão da proteína do AT1R foi significativamente maior em animais SS1-infectadas do que em controlos em que o tempo (Figura 3). Não houve diferenças significativas na expressão de proteínas AT2R foram encontrados entre os diferentes grupos de gerbilos (não mostrado). Figura 2 Imagem Exemplar das transferências de Western. Painel superior: Imunoreatividade contra AT1R em 41 kDa no lisado de células PC-12 (controle positivo) e em amostras full-parede antrais. Painel inferior: Imunoreatividade contra AT2R indicando um leve banda a 44 kDa em Hep G2 (controle positivo) e as bandas em amostras de full-parede antrais
Figura 3 Boxplot mostrando a expressão da proteína AT1R 12 meses após a inoculação em gerbilos infectados com H. pylori. estirpes TN2GF4 e SS1 e em controlos. A expressão da proteína do AT1R foi significativamente maior nos animais SS1-infectadas em comparação com os controlos (teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U). Os níveis de proteína são apresentados em densidade óptica (OD). Os valores medianos são indicados pela linha transversal dentro da caixa, o intervalo interquartil pela extensão vertical da caixa e da gama total dos bigodes.
Dado que H. pylori
animais infectados mostraram uma abundância de AT1R expressando as células inflamatórias na mucosa gástrica e um aumento da expressão do AT1R antral, uma análise quantitativa das células inflamatórias na mucosa foi feito para avaliar se a sobre-regulação de proteína AT1R em gerbilos SS1-infectadas foi relacionada com a mucosa da infiltração de células inflamatórias.
o grau de infiltração da mucosa de ambos os mononucleares e polimorfonucleares leucócitos (reflectida pela densidade de volume da lâmina) não diferiram entre os gerbos infectados e SS1-TN2GF4-infectados. No entanto, a infiltração da mucosa de leucócitos polimorfonucleares (PMN) foi significativamente mais elevado nos animais SS1-infectadas do que em animais infectados TN2GF4 12 meses após a inoculação (Tabela 2). Os PMNs no H. pylori
mucosa infectado consistia quase exclusivamente de neutrófilos (Figura 1O); apenas uma eosinofílica poucos e não há células basofílicas puderam ser identificados na microscope.Table 2 Análise quantitativa das células inflamatórias na mucosa antral gerbil após 12 meses de infecção por Helicobacter pylori

Controle
TN2GF4
SS1
mucosa infiltração de mononucleares e polimorfonucleares leucócitos (reflectida pela densidade de volume (%) de lâmina)
26,7 ± 2,4
47,1 ± 2,2
41,3 ± 2,4
mucosa infiltração de leucócitos polimorfonucleares (PMN /mm2 lâmina própria)
198 ± 37
1892 ± 169
4166 ± 275 * *
Os valores são ± média erro padrão da média
** p <.; 0,01, SS1 contra TN2GF4. Mann-Whitney U-test
se uma relação linear (r = 0,75, p < 0,01) foi observada entre a expressão da proteína AT1R no antro e o número de leucócitos polimorfonucleares na mucosa antral após 12 meses de H. pylori
infecção (Figura 4). Esta relação foi suportada pela correlação entre a expressão logarítmica antral de AT1R e a expressão de mieloperoxidase (r = 0,58, p < 0,05) (Figura 5). A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima que é expresso abundantemente em neutrófilos e em menor grau em monócitos e certos tipos de macrófagos [24]. Assim, os níveis de MPO tecido serviu como marcadores proteicos de infiltração de neutrófilos no presente estudo. Se o valor outlier marcado com um triângulo na Figura 5 é excluído da análise (não mostrado numa figura separada) a relação entre AT1R MPO e torna-se visivelmente mais forte (r = 0,86 e p < 0,01). Figura 4 relação entre a expressão do AT1R no antro e do número de leucócitos polimorfonucleares (PMN) na mucosa antral após 12 meses de infecção por H. pylori.
Figura 5 relação entre a expressão do AT1R e mieloperoxidase expressão (MPO) na mucosa antral depois 12 meses de infecção por H. pylori. Se o valor outlier marcado com um triângulo é excluído da análise (não mostrado) a relação entre AT1R MPO e torna-se visivelmente mais forte (r = 0,86 e p < 0,01).

Discussão O presente estudo explorou a linha de base presença e localização de receptores de angiotensina II na parede antral e corporal do gerbilo da Mongólia e demonstraram que AT1R e AT2R foram expressas por uma variedade de células. A constatação de particular interesse era que uma subpopulação de células endócrinas na mucosa antral demonstrou uma expressão marcada de AT1R. A validade do processo de imuno-histoquímica utilizada no presente estudo foi confirmada em várias formas. Os anticorpos do receptor de Ang II foram detectados utilizando duas técnicas diferentes, e a especificidade dos anticorpos primários utilizados tanto para transferência de Western e imuno-histoquímica foi verificada por comparação dos padrões de coloração de gerbilo com os da glândula supra-renal humana e por pré-absorção com o bloqueio péptido ( AT1R).
a distribuição ubíqua de receptores de Ang II no estômago aqui relatada está em concordância com o que foi relatado anteriormente no cólon [7]. A autorradiografia do estômago de rato, também indicou que AT1R, e um baixo número de AT2R, estão presentes em todas as camadas do estômago [4]. No entanto, a localização exacta do AT1R e AT2R no estômago tenha sido ainda apenas escassamente explorado. Matsuo et al
. imunohistoquímica usado para localizar AT1R no antro humana e encontrou-o em células musculares lisas vasculares (VSMC), células mesenquimais e células musculares lisas nas camadas musculares da mucosa e muscular própria [25]. Além disso, Bregonzio
et ai.

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