PLoS ONE: Flotillin2 Expression коррелируется с HER2 уровней и плохим прогнозом рака желудка

Абстрактный

Цель
<р> ген Flotillin известен как промотор опухоли или глушителем, в зависимости от типа опухоли или стадии опухоли. Нашей целью было изучить клиническую значимость flotillin2 экспрессии белка в развитии рака желудка.

Методы
<р> Мы исследовали уровни flotillin2 и erbB2 в ткани микрочипов 282 образцов рака желудка и проанализировали связь между уровнями flotillin2, клиникопатологическими факторы и прогноз. Регулирование erbB2 по flotillin2 осматривали с flotillin2 миРНК-трансфицировали клеток рака желудка.

Результаты
<р> Flotillin2 частично колокализуются с erbB2 на плазматической мембране, как обнаружено с помощью конфокальной микроскопии, уровни erbB2 были снижены после того, как flotillin нокдаун в СГК-7901 раковых клеток, и экспрессия flotillin2 положительно коррелирует с тем из erbB2. В неопухолевых слизистой оболочки желудка, не была выражена flotillin2 в эпителиальной отсеке. При раке желудка, положительное окрашивание flotillin2 было показано в 129 (45,7%) из 282 случаев, кроме того, он был в значительной степени связано с сортом Lauren, гистологический тип, лимфоваскулярной инвазии и локализацией опухоли. Кроме того, анализ выживаемости показал, что flotillin2 экспрессия была независимым прогностическим фактором плохой выживаемостью (р &л; 0,001).

Выводы
<р> Эти результаты указывают на то, что положительная корреляция существует между flotillin2 и уровнями экспрессии erbB2, flotillin2 возможно участие в стабилизации erbB2 на плазменной мембране, flotillin2 достоверно коррелирует с прогрессированием рака и плохим прогнозом при раке желудка
<р> Цитирование:. Чжу Z, Ван J, Sun Z, Sun X, Ван Z, Сюй H (2013) Flotillin2 Expression коррелируется с HER2 уровней и плохим прогнозом рака желудка. PLoS ONE 8 (5): e62365. DOI: 10.1371 /journal.pone.0062365
<р> Редактор: Джозеф Najbauer, Университет Печ медицинской школы, Венгрия
<р> Поступило: 15 февраля, 2013 года; Принято: 20 марта 2013; Опубликовано: Май 2, 2013
<р> Copyright: © 2013 Чжу и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа при поддержке грантов от Национального фонда естественных наук Китая (81272718), научно-исследовательский фонд молодых ученых »по докторской программе высшего образования Китая (20122104120008) и фонд научных исследований Первой больницы Китайского медицинского университета (FSFH1208). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Многие мембранные белки плазмы, как известно, участвует в клеточной пролиферации, адгезии клеток, клеточной подвижности и инвазии опухолевых клеток, что составляет более двух третей известных в настоящее время мишеней для лекарственных средств. Клеточная мембрана и связанные с ним белки имеют существенный интерес в отношении различных аспектов опухоли, канцерогенных и метастатических механизмы для молекулярной диагностики и терапии [1]. Flotillins связаны с везикулярного инвагинации плазматической мембраны, а также выступать в качестве регуляторов сигнальной трансдукции [2]. Среди flotillin членов семьи, существуют два различных гена flotillin (flotillin1 и 2), flotillin2 экспрессии белка было сообщено в некоторых раковых клеточных линий человека и образцах опухолей [3], [4], [5], [6]. Поскольку flotillin2 непосредственно взаимодействует с сигнальными молекулами, такие как рецепторы, киназ, молекул адгезии и G белков, он действует в качестве модулятора опухоли посредством регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, адгезии и инвазии [4].

сверхэкспрессии из erbB2 (эпидермальный ростовой человеческого рецептора фактора 2), также известный как HER2, является мембрана-ассоциированной тирозин-киназы, который может привести к активации клеточных систем сигнальной трансдукции, что приводит к трансформации клеток и пролиферацию клеток событий, связанных с раком, таких как рак молочной железы рак, рак яичников и рак желудка [7], [8], [9]. Высокий уровень экспрессии erbB2 было достоверно коррелирует с вторжением увеличилось опухоли, метастазирование, устойчивость к химиотерапии, и плохим прогнозом у пациентов [10]. Недавние исследования показали, что белок flotillin2, среди других функций, принимал участие в эндоцитических механизмов и процессов клеточных людьми, а также было обнаружено, что в молекулярном комплексе с erbB2 [11]. Для того, чтобы понять, является ли стабилизация erbB2 на плазматической мембране опосредуется flotillin2 и их клиническое значение, мы провели сравнительный анализ мембраны Протеомические рака желудка человека.
<Р> В этом исследовании мы описываем flotillin2 и выражение erbB2 уровни положительно коррелируют на клеточном уровне, а также в желудочном ткани рака и мы покажем, что erbB2 усвоена и деградирует с помощью механизма при flotillin2 истощения. Кроме того, клинико-патологический значение flotillin2 далее оценивали с использованием образцов архивных тканей и статистический анализ. Мы обнаружили, что flotillin2 является независимым прогностическим фактором, также является потенциальным новым биомаркером метастазов в лимфатических узлах. Наши данные будут способствовать пониманию рака желудка рака и горных биомаркеров для диагностики и лечения этого заболевания.

Материалы и методы

образцов тканей и последующая деятельность

A в общей сложности 282 пациентов, перенесших операцию по поводу рака желудка в период с января 2006 года по декабрь 2009 года на первый филиал больницы Китайского медицинского университета был выбран для этого исследования. Все образцы пациентов, полученных были собраны и архивируются в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советами первый филиал больницы Китайского медицинского университета в. Диагноз был подтвержден по меньшей мере двумя патологи и постановка была основана на патологических данных в соответствии с 7-го американского Объединенного комитета по разработке руководящих принципов рака. Средняя продолжительность наблюдения составила 51 (диапазон 5-78) месяцев.
<Р> 282 пациентов, перенесших gastroctomy были подвергнуты закрыть клиническое наблюдение, в том числе грудной клетки и брюшной КТ, уровень СЕА, и анализ крови на 2- до 3-месячными интервалами и ежегодной гастроскопии. Общей выживаемости (ОВ) ставки были определены как интервал от начальной операции до клинически или рентгенологически доказанной рецидива или метастазирования и смерти, соответственно. Конечная дата последующего исследования для проведения анализа был 29 июня 2012 года

Этика заявление
<р> Этическое одобрение данного исследования было получено от Комитета по этике исследования Китайского медицинского университета, Китай. Все пациенты, обеспечивающие опухолевой ткани, а также нормальные образцы тканей желудка письменное согласие до хирургического удаления рака желудка, чтобы обеспечить эти исследования должны быть предприняты.

TMA строительство и иммуногистохимии

гематоксилином и эозином (Н &Amp; E) -stained срезы скринингу на оптимальное опухолевой ткани и незлокачественных ткани, прилежащей к опухоли (по крайней мере 2 см от опухоли) и АПМ слайды были построены с ткани ручной выстроив инструмента. Два ядра были собраны из каждого фиксированных формалином, парафин (FFPE) образца желудочной ткани рака и от каждого нормального образца слизистой желудка с использованием 1,0-мм диаметр штампа инструмента. Образцы из того же пациента были замечены рядом друг с другом, чтобы обеспечить аналогичные условия реакции для нормальной и опухолевой ткани данного пациента. Иммуногистохимическое анализ проводили на образцах FFPE, как описано ранее с использованием набора для Envision (Dako Cytomation, Glostrup, Дания) [12]. Скороварка поиск опосредованного антиген проводили в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 7 минут. Срезы инкубировали с 1 200 разбавлением анти-flotillin2 (Santa Cruz, SC-25507) и erbB2 (SC-33684) в течение ночи при температуре 4 ° С, а затем инкубировали с козьим антителом против мышиного или анти-кроличьего Envision System Plus-HRP ( Dako Cytomation) в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывки три раза в PBS в течение 10 минут каждый, срезы инкубировали с ДАБ в течение 1 мин, контрастному окрашиванию гематоксилином Майера, обезвоженной, и смонтированный.

Оценка иммуногистохимическим окрашиванием

иммунореактивности оценивали независимо друг от друга двумя исследователями, которые были ослеплены к исходу пациента. Оценка была основана на интенсивности окрашивания и степень окрашивания. Окрашивание интенсивности для flotillin2 и erbB2 оценивали как 0 (отрицательный), 1 (слабый), 2 (умеренная) и 3 (сильный). Окрашивание степени оценивали как 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) и 4 (76-100%), в зависимости от процента положительных -stained клетки. Сумма интенсивности окрашивания и оценки степени окрашивания был использован в качестве окончательной оценки окрашивания. Образцы были разделены на три группы в соответствии с их общей оценки: 0-1, отрицательный, 2-4, слабый положительный, и 5-7, сильной положительной

анализ FISH для клеток рака желудка
<. р> амплификация гена erbB2 определяли двухцветными методом FISH с использованием зонда Kit Passvision HER2 ДНК (Vysis Inc. Downers Grove, IL, USA) в соответствии с протоколом производителя. HER2-Спектр Оранжевый зонд содержит последовательность ДНК, специфическую для человека локуса гена erbB2 и гибридизуется в области 17q11.2-q12 хромосомы человека. СЕР 17 (хромосома перечисление зонда 17) использовали в качестве контроля содержит альфа-сателлитной ДНК. Ядро контрастно с 40, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Голых мышей желудка модели рака (SGC-7901, MGC-803 и BGC-823) были сделаны, как описано ранее [13], [14]. Опухолевые горок наблюдали под BX60 флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой (DP50) (Olympus, Токио, Япония), и изображения были захвачены с программным обеспечением видоискателя. Ячейка считается, чтобы показать усиление, когда был найден определенный кластер или более 10 сигналов для erbB2.

Культура клеток и трансфекцию
<р> Желудочный клеточные линии рака SGC-7901 (умеренно дифференцированная), MGC -803 и КУП-823 (слабо дифференцированы) были приобретены у банка клеток китайской академии наук. раковых клеточных линий поддерживали в среде RPMI 1640 (город Hyclone, Логан, США) с добавлением 10% FBS. Все клеточные линии были в 5% СО2 в увлажненной атмосфере при 37 ° С. Для миРНК трансфекции клетки высевали в шесть-луночные планшеты при плотности 2 × 10 5 клеток /лунку, за 24 ч до трансфекции миРНК ориентации не перекрывающиеся части последовательности мРНК использовали для flotillin2. Для истощения flotillin2, пула двух различных миРНК с последовательностями ориентации построить GAGGUUGUGCAGCGCAAUU и GGAUGAAGCUCAAGGCAGA [15], клетки были высеяны без антибиотиков, выращивали в течение 24 ч и трансфицировали с помощью Липофектамин трансфекции реагента (Invitrogen) в соответствии с производителем процедура. Через 4 ч трансфекции среду заменяли на полную среду для роста, содержащей сыворотки и антибиотики, и клетки выращивали в течение 3-х дней, прежде чем были начаты эксперименты.

иммунофлуоресценции, Вестерн-блот и QRT-ПЦР
<р> Клетки дважды промывали холодным PBS и лизировали на льду в RIPA буфере с ингибиторами протеазы и количественно с помощью метода BCA. 50 мкг белка лизаты разделяли на 6% -ном SDS полиакриламидном, electrotransferred к поливинилиденфторида мембраны (Millipore, Bedford, MA) и блокировали в 5% обезжиренного сухого молока в Трис-буферном солевом растворе (рН = 7,5). Мембраны иммуноблоттинг в течение ночи при 4 ° C с анти-flotillin2 /erbB2 поликлональных антител, как описано выше IHC, соответственно, а затем следуют их соответствующими вторичными антителами. Сигналы были обнаружены с помощью усиленной хемилюминесценции (Pierce, Rockford, IL). Для иммунофлуоресценции связывания первичного антитела визуализировали с помощью TRITC /FITC-конъюгированный козий против мышиного IgG антитела, и предметные стекла затем исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

PCR амплификации для количественного определения flotillin2, erbB2 и мРНК GAPDH в клетках были сделаны в LightCycler системе (Roche Applied Science) с использованием набора LightCycler FastStart ДНК Master SYBR Green I (Roche Diagnostics). Короче говоря, мастер смесь готовили на льду, содержащий 1 мкл комплементарной ДНК, 2 мкл ДНК-LC Master SYBR Green I Mix, 50 нг праймеров, и 4 мМ MgCl2. Условия амплификации 40 циклов состоял из денатурации при 95 ° С в течение 10 с, отжиг при 65 ° С в течение 10 с и удлинение при 72 ° С в течение 10 с. Продукты были затем подвергнуты температурным градиентом от 68 до 95 ° С при 0,1 ° С /с, с непрерывным контролем флуоресценции для производства Кривые плавления продуктов. Уровни экспрессии были нормализованы к экспрессии мРНК erbB2.

Статистический анализ
<р> χ 2 тест или использовали точный критерий Фишера для пропорции, в зависимости от обстоятельств, чтобы проанализировать взаимосвязь между flotillin2 и выражение erbB2 и клинико-патологических переменных. Показатели выживаемости были рассчитаны по методу Каплана-Мейера и различия между кривыми выживаемости были исследованы с помощью теста лог-ранга. Одномерный пропорционального риска Кокса регрессии были использованы для оценки индивидуального соотношения рисков (ОР). Существенные переменные в однофакторного анализа (P ≪ 0,05) были затем введены в многомерном анализе. HR с 95% доверительный интервал (ДИ) измеряли для оценки риска опасности отдельных факторов. Р &л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое. Анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения версии программы SPSS 19.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс).

Результаты

Выражения flotillin2 и erbB2 в желудочном
рака

окрашивали разделы микрочипов ткани (ТМА) 282 сердечников ткани были классифицированы по их цитоплазматической иммуногистохимического интенсивности окрашивания против flotillin2 и белка erbB2. 282 читаемых образцы включали 282 карциномы желудка, 181 пери-карциномой и 101 образцов нормального желудочного эпителия ткани. Опухолевые клетки показали типичный диффузный мембрана окрашивание flotillin2 можно найти в карциномы желудка (рис 1а) с аналогичным расположения erbB2 (рисунок 1b), в неопухолевых желудка, а также flotillin2 и erbB2 оба были не выражены. Положительное окрашивание flotillin2 было показано, в 129 (45,7%) из 282 образцов, erbB2 было 59 (20,9%). Амплификация гена erbB2 определяли с помощью двойного цвета рыбьего ксенотрансплантатов у голых мышей. ErbB2 амплификации гена в образце кластера (красный) наблюдался в MGC-803, КУП-823 и SGC-7901 клетки, erbB2 избыточная экспрессия только в человеческом SGC-7901 клетки рака желудка (рис 2а-с).

Ассоциация между выражениями flotillin2 с erbB2

Мы проанализировали клеточную локализацию erbB2 и flotillins в SGC-7901 клетку рака желудка. Мы могли бы показать с помощью конфокальной микроскопии, что flotillin2 частично совместно локализуется с erbB2 на плазменной мембране (рис 1а-е). Наши данные показывают, что экспрессия flotillin2 сделать имеет значительную корреляцию с тем из erbB2 (р &ЛТ; 0,001) в анализе иммуногистохимического массива ткани (таблица 1). Кроме того, взаимодействие между flotillins и erbB2 может быть продемонстрировано с помощью иммуноблот (рис 2d) и качественных экспериментов RT-PCR (рис 2E), сбивание эндогенного flotillin2 привело к сносу erbB2. Далее мы проанализировали влияние flotillins на интернализации и последующей деградации erbB2. Как описано ниже, erbB2 и HER2 также имеют много отношения клинико-патологическими факторами общего.

Ассоциация между flotillin2 и клинико-патологические факторы
<р> В этом исследовании 282 больных раком желудка с достаточными первичными опухолями материалов и последующей -до время были доступны, чьи ткани были собраны в течение последних 6 лет. Таблица 2 дал описательную статистику для измеренных параметров для этих пациентов. Средняя продолжительность наблюдения составила 54 месяцев (диапазон 9-78 месяцев). 5-летняя общая выживаемость (ОВ) ставка составила 48,2%
<р> Мы обнаружили, что повышенная экспрессия flotillin2 и erbB2 было и в значительной степени связано с гистологическим типом (р &л; 0,001, соответственно)., Класс Лорен (р &ЛТ; 0,001, соответственно) и лимфоваскулярная инвазии (р = 0,059 и р &л; 0,001, таблица 2). Кроме того, flotillin2 был достоверно коррелирует с размером опухоли (р = 0,006), Т стадии (р = 0,001) и метастазов в лимфатических узлах (р = 0,033, таблица 2). Тем не менее, не наблюдалось значимой корреляции между flotillin2 выражения и других параметров, включая возраст, пол, местоположение, макроскопического типа и печеночного метастаза.

Выражение flotillin2 по отношению к прогностической
<р> Использование пропорционального риска регрессии Кокса модели, одномерные соотношения между характеристиками опухоли и исход пациентов были получены (таблица 3). Из 282 пациентов, проанализированных, статистически значимых различий в ОС были замечены, с плохим исходом для пациентов с более высоким окрашивания flotillin2 и erbB2. Другие прогностические факторы, которые были признаны коррелировать с ОС были возраст (P = 0,042), размер (P = 0,001), макроскопического типа (р = 0,001), Pt (P &л; 0,001) и П.Н. стадии (P &лт; 0,001) (таблица 3). Используя лог-ранговый, существуют значительные различия в ОС между положительными и отрицательными пациентами flotillin2 и erbB2 (P < 0,001, соответственно) у всех пациентов были показаны на рисунке 3.
<р> Кокс многомерный пропорционального опасности модели регрессии затем был использован для определения того, какие факторы были совместно предикативна ОС. Переменные, которые считались значимыми при однофакторного анализа были включены в анализ. Значение, с поправкой на других сопутствующих случайных величин, был дан в таблице 4. многомерный анализ совместного влияния flotillin2 и erbB2 с другими прогностическими факторами показали, что РХ (Р &л; 0,001) и П.Н. стадии (P &л; 0,001) flotillin2 (HR = 1,485, 95% ДИ:. 1.278-1.725, P &л; 0,001) был лучше, независимо друг от друга, чем прогностический маркер erbB2 (HR = 1,375, 95% ДИ: 1.133-1.947 P = 0,004) для ОС (таблица 4)

Обсуждение
<р> оценка биологических прогностических факторов имеет клиническое значение, особенно для лечения заболевания с плохим исходом, таких как рак желудка. Настоящее исследование подтвердило конститутивную экспрессию flotillin2 в желудочном образцах ткани рака и клеточных линий, мы также обнаружили, что flotillin2 был независимым прогностическим фактором бедных общей выживаемости больных раком желудка. Кроме того, данное исследование показало, впервые, позитивные отношения между выражениями flotillin2 и HER2 при раке желудка. В предыдущем исследовании, Pust и др. (2012) обнаружили, что линии рака молочной железы клеток, полученной из отдаленных метастазов показали более высокий уровень мРНК и белка flotillin выражения, чем те, которые получены из первичного рака желудка. Таким образом, они объяснили роль flotillin2 как ткане и стадии конкретного модулятора опухоли, где он выступает в качестве ингибитора или промотора образования и прогрессии опухоли в зависимости от его белковых партнеров взаимодействия, таких как рецепторы фактора роста или молекул клеточной адгезии [11] , Наши результаты согласуются с этим описанием, потому что flotillin2 выражение в настоящем исследовании, положительно коррелирует с экспрессией HER2, который был положительно коррелирует с плохим прогнозом при раке желудка.
<Р> Данные из двух недавних публикаций показывают, что flotillin имеет функциональную роль в рецептор сигнализации тирозинкиназы, особенно в активации МАР-киназы сигнализации и регуляции передачи сигналов FGF в клетках HeLa [16], [17]. В клетках рака молочной железы SKBR3, результат, что Akt фосфорилирования уменьшается при истощении flotillin-2, но не после того, как flotillin-1 нокдаун, согласился с нашими данными. Таким образом, рецепторные тирозинкиназы или рецепторной тирозинкиназы-опосредованной сигнальных путей может регулироваться flotillins различными способами и /или способом, типоспецифичной клеток, возможно, что различные сигнальные пути, запускаемые erbB2 регулируются либо flotillin2. Тем не менее, снижение уровня erbB2 вызвано flotillin2 бросовой поддержку нашей гипотезы о flotillin2-опосредованной стабилизации erbB2.
<Р> ErbB2, как известно, ассоциируется с плохим прогнозом при раке желудка, flotillins были описаны, связаны с опухолью генеза. Мы показали, что flotillin2 совместно локализуется с erbB2 в плазматической мембране и играет функциональную роль на регуляцию erbB2 при раке желудка. Высокая экспрессия flotillin2 ассоциируется с плохим прогнозом и снижением продолжительности жизни, и он выступает в качестве потенциального предиктор рецидива рака желудка. Сообщалось, что эстроген рецепторы участвуют в желудочном канцерогенезе и flotillin2 взаимодействует с рецепторами [18], [19], что указывает на значительное влияние flotillin2 функции на развитие рака желудка. С другой стороны, на основе наших тканей микрочипов исследований, flotillin2 избыточная экспрессия высоко связано с увеличением миграции клеток и злокачественной трансформации, приводящей к вовлечению лимфатических узлов и повышенной инвазивности. В нашем исследовании, повышенный уровень flotillin2 и HER2 оба показали значительную корреляцию с гистологического типа (P < 0,001 оба), класс Lauren (P &лт; 0,001 оба), в то время как flotillin2 также получить высокую значимость с Т стадии (P &лт; 0,001) и лимфатических узлов метастаз (р = 0,033). Эта сильная корреляция предполагает, что flotillin2 можно использовать в качестве биомаркера для идентификации подмножества больных раком желудка с более агрессивным фенотипом. Многомерный анализ показал flotillin2 служит лучше прогностического маркера для прогнозирования риска возникновения метастазов и рецидивов (HR = 1,485, 95% ДИ: 1.278-1.725), чем Her2 (HR = 1,375, 95% CI: 1.133-1.947) для ОС. Мы полагаем, что flotillin2 избыточная экспрессия может способствовать усилению пролиферации и развития рака желудка.
<Р> В заключение, это первая демонстрация положительной корреляции между flotillin2 и уровнями erbB2 в культуре клеток рака желудка, а также в тканях. Кроме того, flotillin2 уровень экспрессии коррелирует с плохим прогнозом при раке желудка, что указывает на flotillin2 может быть прогностическим биомаркером рака желудка. Было установлено, что erbB2-гиперэкспрессией опухоли, более вероятно, быть устойчивыми к лечению с антителом на основе (трастузумаб /Герцептин) терапии, которая стала клиническое лечение первой линии у больных с erbB2-гиперэкспрессией метастатическим раком желудка [20] , [21]. Тем не менее, даже в сочетании с другими химиотерапевтическими препаратами, более чем 20% пациентов с erbB2-сверхэкспрессии не показывают никакого ответа на лечение. Таким образом, путем ориентации flotillin2 выражение, новые стратегии в лечении рака могут быть разработаны.

• PLoS ONE: Множественный к многообразных взаимосвязей между микроРНК и генов-мишеней в желудочном Cancer
• PLoS ONE: Социально-демографические и географические факторы в показателях смертности и пищеводу рака желудка в…