Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами-в-помощь по научным исследованиям Министерства образования, культуры, науки, спорта и технологий Японии, и, частично, грантом-в-помощь для третьей всеобъемлющей 10-летней стратегии борьбы против рака и по исследованию рака Министерства здравоохранения, труда и благосостояния Японии, так и для Национального института биомедицинских инноваций (Программа для раскрутки фундаментальных исследований в области наук о здоровье). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Reg IV и CDX2 Expression коррелируются в GC клетки
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека в мире. Рак развивается в результате многочисленных генетических и эпигенетических изменений [1]. Ранее мы проводили последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) из четырех основных ШС и выявили несколько генов, GC-специфические [2]. Из этих генов, <ЕМ> регенерирующий островок полученный члену семьи 4
( REG4
, которая кодирует белок, Reg IV) является кандидатом на роль гена для экспрессии рака специфических [3]. REG4
является членом REG
семейства генов, который принадлежит к кальций-зависимой лектин надсемейства. REG4
первоначально был идентифицирован с помощью анализа последовательности с высокой пропускной способностью большого воспалительной библиотеки кДНК заболевания кишечника [4]. Reg IV является мощным активатором рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) /Akt /активатор белка-1 (AP-1) сигнального пути в клетках рака толстой кишки и увеличивает экспрессию Bcl-2, Bcl-XL и сурвивина, которые являются белки связано с ингибированием апоптоза [5]. Амплификация REG4
гена сообщается при раке поджелудочной железы [6]. Reg IV был идентифицирован как один из генов, повышающей регуляции в раковых клетках инициирующие [7]. Ранее мы исследовали влияние принудительного экспрессии Reg IV в GC-клеточной линии. Мы показали, что Reg IV ингибирует 5-фторурацил (5-ФУ) -индуцированное апоптоз посредством активации EGFR в GC клетки [8]. В противоположность этому, Reg IV-избыточно экспрессирующие клетки не показали значительных различий в пролиферации и инвазии активности по сравнению с клетками, трансфицированных пустым вектором [8]. Эти данные поддерживают идею о том, что Reg IV белок участвует в желудочном канцерогенезе
<р> GC можно разделить на четыре фенотипа в соответствии с выражением: муцина. Желудочная или foveolar фенотипа; кишечного фенотипа; кишечного тракта и желудка смешанный фенотип; и ни желудка, ни кишечный фенотип [9]. Четкие генетические изменения, по всей видимости, связаны с желудочной и кишечной фенотип GC [10]. В наших предыдущих наблюдений, была выражена Reg IV в 30% случаев ГК и коррелировала с кишечной фенотип [11]. Ряд иммуногистохимического анализа Reg IV было зарегистрировано в злокачественных опухолях человека [11] - [20]. В целом, эти анализы сообщили, что Reg IV выражается в клеток аденокарциномы, отображающих кишечную фенотип. Сообщалось, что экспрессия Reg IV индуцируется Gli1, который является одним из ключевых факторов транскрипции в сигнальной ежа пути [21], или факторами роста, такими как EGF, трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа), фактор роста гепатоцитов (HGF), или основной фактор роста фибробластов (bFGF) [22]. Тем не менее, эти молекулы вряд ли будут составлять ассоциации между экспрессией Reg IV и кишечном дифференциации фенотипа.
<Р> Ранее мы обнаружили, что экспрессия Reg IV коррелировало с выражением CDX2 [11]. CDX2 является млекопитающим Хвостовой связанных с кишечным фактором транскрипции и важным для поддержания клеток эпителия кишечника [23], [24]. Несколько линий доказательств указывают на то, что кишечная метаплазия желудка и кишечника фенотипа GC связаны с внематочной CDX2 выражением [9], [25]. В настоящем исследовании, мы исследовали, регулирует ли CDX2 выражение Reg IV в дс и обнаружили, что CDX2 непосредственно связывается с 5'-фланкирующей области гена REG4
и усиливает активность промотора.
Результаты
<р> Сначала расследованных индукция экспрессии Reg IV по CDX2 в линиях GC клеток. Вестерн-блот-анализ CDX2 в 9 ГХ клеточных линий показал, что ни одна или выражение низкого уровня CDX2 не был обнаружен в MKN-7, ТМК-1, ГСК-44PE, и КАТО-III (рис. 1А). Для того, чтобы определить, является ли CDX2 и выражение Reg IV были тесно коррелировало в GC клетки, Вестерн-блоттинга и количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (QRT-PCR), анализ Reg IV были проведены на линии 9 GC клеток. Как показано на рис. 1А, экспрессия белка Reg IV был обнаружен только в 3-х клеточных линиях с высоким уровнем REG4
транскриптов, измеренных с помощью QRT-PCR. Из клеточных линий 5 GC с экспрессией белка CDX2, 2 клеточные линии (MKN-1 и MKN-28) не имели обнаруживаемой экспрессии REG4
транскриптов и белка. Клеточные линии с выражением незаметного CDX2 белка (MKN-7, ТМК-1, ГСК-44PE, и КАТО-III), не показал REG4
транскрипты или белок (рис. 1А).
<Р> Далее, мы получили поликлональные популяцию MKN-7, ТМК-1, ГСК-44PE и клеток КАТО-III, выражающую высокие уровни CDX2 путем инфицирования клеток с дефектом репликации ретровирусов, несущих полную длину человеческой CDX2 кДНК, потому что нет или выражение низкого уровня CDX2 был обнаружен в этих клеточных линий. Тем не менее, избыточная экспрессия CDX2 не удалось активировать экспрессию Reg IV Вестерн-блот (данные не показаны). Поскольку возможно, что одна CDX2 недостаточно для активации экспрессии Reg IV, выражение <ЕМ> CDH17
(кодирование LI-кадгерин белок), который является одним из целей CDX2 [24], также была исследована. Тем не менее, активация экспрессии LI-кадгерина не был найден в MKN-7, ТМК-1, ГСК-44PE и КАТО-III клетки, экспрессирующие высокие уровни CDX2 (данные не показаны). Потому что мы показали активацию экспрессии LI-кадгерина по CDX2 в HT-29 линии клеток рака толстой кишки [24], индукция экспрессии Reg IV был исследован в той же клеточной линии. Как показано на рис. 1B, индукция экспрессии Reg IV был обнаружен в НТ-29 клеток, инфицированных ретровирусов, несущих полноразмерную кДНК человеческого CDX2. Мы также генерироваться поликлональной популяции SW480 (рак толстой кишки клеточной линии) клетки, экспрессирующие высокие уровни CDX2 путем инфицирования клеток с дефектом репликации ретровирусов, несущих полноразмерную кДНК человеческого CDX2. Как показано на рис. 1B, индукция экспрессии Reg IV была обнаружена в клетках SW480, инфицированных ретровирусов, несущих полноразмерную кДНК человеческого CDX2. Эти результаты свидетельствуют о том, что выражение Reg IV может быть вызвано CDX2 в клеточных линий, полученных от рака толстой кишки. Потому что в кишечной метаплазии желудка, CDX2 и выражения Reg IV хорошо коррелируют [11], использование линии клеток рака толстой кишки может быть пригодным для модели кишечной метаплазии.
<Р> Для того, чтобы лучше оценить взаимосвязь между CDX2 и выражение Рег IV, мы изучали экспрессию Reg IV в HT-29-производной линии с жестко регулируется CDX2 активностью. Мы использовали поликлональные клеточную линию НТ-29, которые были трансдуцированных вектором pCDX2-ER. Вектор pCDX2-ER кодирует химерный белок, в котором последовательности CDX2 полнометражных конденсированы перед мутировавший рецептора эстрогена (ER) лиганд-связывающий домен. не Мутантный ER лиганд-связывающий домен больше не связывает эстроген, но сохраняет способность связывать тамоксифен. Лечение HT-29 клеточной линии /CDX2-ER с 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) привело к сильной индукции экспрессии белка Reg IV в течение 48 часов (рис. 1в). Эти результаты указывают на то, что Reg IV является прямым или первичный ген-мишень регулируется CDX2. Тем не менее, в одиночку CDX2 не является достаточным для активации экспрессии Reg IV.
Подавление CDX2 с помощью РНК-интерференции (RNAi) Результаты в понижающую регуляцию Reg IV в GC клетки
<р> Для того, чтобы определить, является ли CDX2 необходим для экспрессии Reg IV в дс клетках, мы проанализировали эффект ингибирования экспрессии CDX2 путем RNAi в уровне экспрессии Reg IV в клеточной линии ГСК-39, так как высокий эндогенный CDX2 и выражение Рег IV был обнаружен в клеточной линии ГСК-39. CDX2 специфические малые интерферирующие РНК (киРНК) значительно подавлена экспрессия белка CDX2 через 3 дня после трансфекции и экспрессии Reg IV транскрипта подавлялась приблизительно 50% от CDX2 киРНК в ГСК-39 по сравнению с его уровнем в контрольных киРНК-обработанных клетках ( рис. 1D). Эти результаты указывают на то, что CDX2 участвует в поддержании экспрессии гена Reg IV.
функциональная характеристика 5'-фланкирующей области REG4
генов с помощью анализа люциферазы
<р> Для того, чтобы определить потенциальную CDX2 -связывающим сайтов в хвостового REG4
промоторной области, поиск геномных последовательностей немедленно 5 'предположительного сайта инициации транскрипции проводили с использованием консенсуса элемент привязки для цыпленка CDXA
гомолог (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 ') [26] и описано выше алгоритм поиска [27]. Мы нашли четыре предполагаемых CDX2-связывающих сайтов в 2 килобаз (КБ) 5'-фланкирующей области гена REG4
(рис. 2А). К ним относятся: сайт А (5'-AATAATA-3 ', от -1828 до -1834), сайт B (5'-CTTTACAG-3', от -901 до -908), сайт C (5'-TTTTATGG-3 ', от -114 до -121), сайт D (5'- AATAATA -3', от -90 до -96). Для того, чтобы оценить роль этих предполагаемых CDX2-связывающих сайтов в регуляции REG4
транскрипции, были получены различные генные конструкции репортер. Как показано на рис. 2В, генные конструкции, содержащие репортер 2.1, 1.2, или 0,6 кб 5'-фланкирующей последовательности из ген REG4
показал сильную активность в клетках ГСК-39, которые демонстрируют сильную эндогенную экспрессию REG4
транскриптов и белка. Для сравнения, клетки MKN-1 имеют мало эндогенный REG4
Исследование с участием близнецов показывает, что симптомы COVID-19 имеют генетический вклад
Бактерии в родовых путях снижают риск рака яичников
Пересадка вагинальной жидкости может помочь в лечении рецидивирующего бактериального вагиноза
Болезнь Крона
Иммунные клетки восстанавливают поврежденный кишечник у детей с ВЗК
Алкоголь повреждает микробиом во рту
Метформин может помочь при повышенной кишечной проницаемости
Команда исследователей из Калифорнийского университета, Сан Диего, успешно использовали органоиды кишечника в своей лаборатории, чтобы продемонстрировать действие лекарств для лечения таких состояний,
Пищевые реакции регулируются микробиомом кишечника,
находит новое исследование Исследование, опубликованное на этой неделе, показывает, что взаимодействие бактерий в нашем кишечнике (микробиом кишечника) с пищей, которую мы едим, заметно различается ме
Как массовые обследования помогли выявить больше случаев глютеновой болезни у детей
Новая программа массового обследования детей школьного возраста в Италии показала, что общая распространенность целиакии почти удвоилась за последние 25 лет. Инфографика целиакии. Кредит