Абстрактный
<р> Gene регулируется на уровне транскрипции и трансляции; Таким образом, обе факторы транскрипции (TFS) и микроРНК (микроРНК) играют роль в регуляции экспрессии генов. Это исследование профилированного дифференцированно выраженных мРНК и миРНК в раковых тканях желудка построить TF и микроРНК совместного регулирования сети с целью выявления видоизмененные гены в прогрессии рака желудка. В общей сложности 70 случаев рака желудка и спаренные соседние нормальные ткани были подвергнуты кДНК и микроРНК микрочипов анализа. Мы получили 887 до регулируемого и 93 вниз регулируемых генов и 41 вниз регулируется и 4 повышающей регуляции миРНК в раковых тканях желудка. Использование базы данных транскрипционный регуляторный элемент, мы получили 105 генов, которые регулируются с помощью E2F семейства генов и с использованием TargetScan, Miranda, miRDB и miRWalk инструментов, мы предсказали потенциальные таргетингом гены этих 45 микроРНК. Затем мы застроили E2F связанную TF и микроРНК совместного регулирования генной сети и выявили 9 HUB-генов. Кроме того, мы обнаружили, что уровни E2F1, 2, 3, 4, 5 и 7, связанные с мРНК желудочного потенциала инвазии раковых клеток, и имеет связанные с дифференциацией опухоли. Эти данные показали, что сверхэкспрессия E2F мРНК, связанных с развитием рака желудка
<р> Образец цитирования:. Чжан X, Ni Z, Z Дуань, Xin Z, Ван H, Tan J, и др. (2015) Гиперэкспрессия E2F мРНК, связанных с прогрессированием рака желудка, идентифицируемый транскрипционный фактор и микроРНК совместного регулирования сетевого анализа. PLoS ONE 10 (2): e0116979. DOI: 10.1371 /journal.pone.0116979
<р> Поступило: 30 сентября 2014 года; Принято: 17 декабря, 2014 года; Опубликовано: 3 февраля 2015
<р> Copyright: © 2015 Чжан и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в его сопутствующую информацию, файлы и бумаги. Данные были сданы на хранение в базу данных GEO, под номером GSE63089
<р> Финансирование:. Эта работа была частично поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая (̭20108025 и № 81472662), Фонд провинции Цзилинь Департамент науки и технологии (É30522013JH иÉ40414048GH) и Бетьюн Программа Norman Цзилинь университета (É2219). Авторы также поблагодарить Medjaden Bioscience Limited (Гонконг, Китай) для редактирования и корректуры эту рукопись. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка остается одним из наиболее значимых проблем здравоохранения в развивающихся странах, как и в Китае, хотя его частота постепенно снижается в западных странах. В целом, рак желудка приходится на четверти случаев, а второй уровень смертности среди всех раковых заболеваний в мире [1-3]. Желудочный факторы риска рака включают инфекцию Helicobacter Pylori, частое употребление копченостей, соленой рыбы и мяса, а также маринованные овощи, табачный дым, ожирение, или хронический гастрит. Эти факторы риска могли бы координировать манипулировать экспрессии генов или мутации или эпигенетические изменения и в конечном итоге привести к развитию рака желудка. На сегодняшний день большая совокупность знаний накопилось относительно молекулярных изменений, связанных с раком желудка, таких как ARID1A, TP53 [4], PTGER4, PRKAA1, ZBTB20 [5] и PLCE1 [6]. Тем не менее, основной механизм для различных генов-опосредованного канцерогенеза желудка еще предстоит определить. Таким образом, крайне важно для дальнейшего изучения молекулярного патогенеза рака желудка с использованием систематическую биологии подход, например, как строительство дифференциально экспрессированных генов-регуляторные сети, чтобы идентифицировать важный ген пути или сигнализации во время развития рака желудка или прогрессии.
<Р> экспрессии генов регулируется на уровне транскрипции и трансляции. На уровне транскрипции генов факторов транскрипции (TFS) играют важную роль в регуляции экспрессии генов человека, в то время как микроРНК мог в уровне после транскрипции мРНК регулирует перевод и период полураспада. В частности, ТФ представляют собой белки, которые связываются с конкретными последовательностями ДНК, и таким образом, контролировать транскрипцию гена. МикроРНК является классом естественных малых некодирующих РНК с 18 до 22 нуклеотидов в длину и функционально, микроРНК может посттранскрипционно выражение молчания белка путем связывания с комплементарными транскриптов гена-мишени, тем самым ухудшая эти матричными РНК или ингибирования их от перевода в белки. Таким образом, как ТФ и микроРНК могут регулировать гены на различных стадиях экспрессии генов и могут образовывать петлю обратной связи и сложную регуляторную сеть жестко контролировать экспрессию генов. В связи с этим, изучение этого генной сети может помочь нам понять, клеточный гомеостаз и физиологический процесс, биологической функции, а также механизм заболеваний. На сегодняшний день ряд исследований показали генной регуляции ТФ и микроРНК при раке желудка, таких как ядерный фактор каппа В [7], FoxM1 [8], гипоксия-индуцируемый фактор 1 [9], и микроРНК-7 [10] , микроРНК-375 [11], микроРНК-125b, микроРНК-199a, микроРНК-100 [12]. Действительно, аберрантных микроРНК или выражение ТФ способствует человеческому канцерогенеза [13]. Поэтому в данном исследовании мы исследовали роль комбинированных микроРНК и транскрипционных факторов в регуляции экспрессии генов при раке желудка для ассоциации с прогрессированием рака желудка. Мы впервые обнаружен дифференциальную экспрессию генов и микроРНК в желудочном образцах ткани рака и анализировали их bioinformatically, чтобы сформировать нормативную сеть TF-микроРНК связать экспрессию семьи мРНК E2F при раке желудка. Затем мы подтвердили E2F выражение для связи с прогрессированием рака желудка.
Пациенты и образцы ткани
<р> Это исследование было одобрено Комитетом по этике школы базового медицинского по наук, университета Цзилинь и каждый пациент был согласие в письменной форме с информированного согласия. После этого, мы зачислены 70 больных раком желудка из университета Цзилинь (Чанчунь, Китай) в период с апреля 2012 по октябрь 2014 г. Все пациенты действительно получали какое-либо лечение перед операцией, как химио- или лучевой терапии. Обе опухоли и отдаленные нормальные ткани были получены из эксплуатации помещения и хранили в жидком азоте в течение 10 мин.
Общую клеточную РНК выделяли из образцов ткани с использованием реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), а затем дополнительно очищали с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Дюссельдорф, Германия). Концентрация РНК затем определяли с использованием Epoch многотомной спектрофотометра системы (BioTek, Вермонт, США). После этого, микроРНК была выделена из этих образцов РНК с использованием изоляции Kit Mirvana микроРНК (Остин, штат Техас, США Ambion).
После того, как анализ микрочипов данных, мы получили ТФ и скрытые гены-мишени, которые регулируются семьи E2F путем поиска транскрипционных регуляторный элемент базы данных (TRED). Кроме того, микроРНК таргетингом E2F семьи определяли базы прогнозирования допрашивали четыре целевые, базы данных, т.е., TargetScan, Miranda, miRDB и miRWalk [16-18]. Затем мы объединили эти дифференциальные выражали гены и микроРНК построить этот TF-микроРНК совместного регулирования сети, связанной с семьей E2F с использованием программного обеспечения Cytoscape. В со-регулирующей сети TF-микроРНК, мы определили узел как ген концентратора или микроРНК, когда он непосредственно связан с более двух общих узлов в сети.
Результаты
Обнаружение дифференциально выраженных генов и микроРНК между раком желудка и соответствующие им нормальные ткани
<р> Сначала выполняется. анализ Affymatrix Экзон Массивы для обнаружения дифференциально выраженных генов между раком желудка и парного прилегающей нормальной ткани у 45 больных (данные пациентов приведены в таблице S1). GEO датасеты NCBI инвентарный номер данного исследования было GSE63089. Использование > В 1,5 раза изменяется по мере светотеневой стоимости, мы определили 887 до регулируемых и 93 вниз регулируемых генов (S2 Table). Функциональный анализ показал, что эти дифференциальные гены в основном формируются пути генов, таких как контроль клеточного цикла, сигнального пути p53, пути взаимодействия раковых заболеваний, внеклеточный матрикс-рецептора, клеточной адгезии, гликолиза /глюконеогенеза и взаимодействия рецепторов цитокинов (рис. 1). Члены семьи E2F играют главную роль в G1 клеточного цикла /S перехода в клетках и экспрессию гена E2F1, 2, 3, 4, 5, и 7 были признаны суперэкспрессия (р &л; 0,01) при раке желудка в этом исследование.
<р> Далее, мы также провели анализ массива Affymatrix Gene Chip микроРНК в 15 случаях рака желудка и парными соседних нормальных тканей (данные пациентов приведены в таблице S1). GEO датасеты NCBI инвентарный номер данного исследования было GSE63121. Мы нашли 41 вниз регулируется и 4 до регулируемых микроРНК (S3 Table). Инжир. 2 иллюстрируется кластерный анализ би-кластеров этих 45 дифференциальных микроРНК в рак желудка против нормальных тканей. Функционально эти дифференцированно выраженные микроРНК могут регулировать различные пути генов, таких как активатора транскрипции активности, связывания ДНК, активность фактора транскрипции, пост транскрипционной регуляции экспрессии генов и G1 /S перехода митотического клеточного цикла.
для того, чтобы отобразить E2F семьи, связанной TF-микроРНК совместно регуляторную сеть, мы использовали TRED, чтобы узнать гены TF и латентной целевые регулируемые от E2F семьи, а затем выбран дифференциально экспрессируются ТФ и латентные гены-мишени в раковых тканях желудка. Мы нашли в общей сложности 105 ТФ и скрытых генов-мишеней, которые могут быть потенциально регулируется E2F семьи при раке желудка (5 вниз регулируется и 100 до-регулируемых генов, см S4 таблицу), которые могут образовывать сеть с 105 генов после би- анализ кластеров кластера (рис. 3) анализ DAVID показал эти 105 генов являются большинство клеточных генов, связанных с циклом (рис. 4).
<р> Далее, мы использовали инструменты онлайн TargetScan, Miranda, miRDB и база данных miRWalk предсказать потенциальные таргетингом гены этих 45 микроРНК, а затем объединены эти гены с таргетингом этих 105 генов, дифференциально экспрессирующихся. Мы нашли 7 вниз регулируется и 2 до регулируемых микроРНК (S3 Table). После этого, мы создали в E2F связанную TF-микроРНК регуляторную сеть (рис. 5).
<Р> После этого, мы проанализировали эту E2F связанную регуляторную сеть TF-микроРНК и обнаружили, что E2F1, E2F2 и E2F4 в семьи E2F играют важную роль в этом TF и микроРНК совместного регулирования сети. Три зарегулированными мРНК (E2F1, E2F2 и E2F4) из дифференциально экспрессирующихся мРНК были подтверждены с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Результаты показали, что E2F1, E2F2 и E2F4 были зарегулирован в желудочном образцах рака по сравнению с нормальными образцами. Результаты RT-PCR и данные микрочипов согласуются (р &л; 0,05, рис.6.). Кроме того, мы определили 9 ступица гены от E2F регулирующих органов, связанных сетью ТФ-микроРНК, которые могут быть совместно регулируемой ТФ (рис. 7). Анализ DAVID этих 9 генов и функции хаба показан в таблице 2.
Ассоциация уровней мРНК семьи E2F с клиникой патологических признаков от больных раком желудка
<р> Кроме того, мы анализировали экспрессию E2F мРНК и затем ассоциируют их с клиникой патологических признаков от больных раком желудка. Анализ ROC кривых показал, что E2F1, 2, 3, 4, 5, и 7 могут быть латентные мишени, чтобы отличить желудка ткани рака и нормальные (рис. 8). Сочетание нескольких E2F семьи могут мРНК дополнительно улучшить чувствительность и специфичность их различающейся между раком желудка и нормальных тканей после регрессии бинарной логистической анализа (рис. 8). Более того, мы обнаружили, уровень E2F1, 2, 3, 4, 5 и 7, мРНК, связанную с глубиной желудочной инвазии рака (рис. 9). Мы также обнаружили, что E2F выражение связано с дифференциацией опухоли (рис. 10).
Кроме того, регулирующий отношения между TF-генов и микроРНК-TF могут иметь синергетические эффекты. На основе нашего недавно созданного E2F-связанных TF-микроРНК совместного регулирования сети, мы определили 9 HUB-гены, которые в основном включают в клеточного цикла и организации хромосом (рис. 7). Взятые все данные вместе, наши нынешние исследования свидетельствуют о том, что развитие рака желудка и прогрессирование замешаны множественные гены и дальнейшие исследования будут сосредоточены на этих генов в качестве новых мишеней для контроля рака желудка.
<Р> Тем не менее, наше нынешнее исследование, только что предоставил предварительные данные и дальнейшее изучение подтверждения необходимо проверить наши данные в бывшем естественных условиях и в пробирке. Этот системный подход может помочь нам изучить патогенез рака и обеспечить теоретическую основу для поиска новой стратегии для лечения рака желудка в будущем.
Выражение признательности
<р> Мы благодарим Medjaden Bioscience Limited (Гонконг, Китай) для редактирования и корректуры эту рукопись.