Stomach Health > Желудок Здоровье >  > Gastric Cancer > Рак желудка

PLoS ONE: Противоопухолевые Эффекты Sirtuin ингибатора, Tenovin-6, против клеток рака желудка через смерть рецептору 5 повышающая регуляция

Абстрактный
<р> До регулируемых Sirtuin 1 (SIRT1), NAD + - зависимый класс III гистондеацетилазы, деацетилирует P53 и подавляет его транскрипционную активность, что приводит к клеточной выживаемости. SIRT1, избыточная экспрессия сообщается предсказать плохое выживание в некоторых злокачественных опухолей, включая рак желудка. Тем не менее, противоопухолевый эффект ингибирования SIRT1 остается недостижимым в раке желудка. Здесь мы исследовали противоопухолевые механизмы ингибитора Sirtuin, tenovin-6, в семи желудочных линий раковых клеток человека (четыре клеточные линии дикого типа TP53
, два с мутантным типа TP53 <бр>, и один с нулевым TP53
). Интересно, что tenovin-6 индуцируется апоптоз во всех клеточных линиях, а не только те, с диким типом TP53,
но и мутант-типа и нулевые версии, сопровождаемые регуляцию смерти рецептора 5 (DR5). В строке KatoIII клеток ( ТР53
-null), DR5, шумопоглотительные заметно ослабляется tenovin-6-индуцированный апоптоз, предполагая, что поворотный механизм, вызывающий его противоопухолевое действие основано на активации сигнального пути рецептора смерти. Хотя эндоплазматический ретикулум стресс, вызванный Sirtuin ингибиторов сообщалось, чтобы побудить DR5 повышающей регуляции в других клеточных линий рака, мы не смогли найти заметную активизацию своих родственных молекул, таких как ATF6, PERK и Чоп, в желудочном раковых клетках, обработанных tenovin- 6. Tenovin-6 в сочетании с доцетакселом или SN-38 оказывали незначительное до умеренного синергетический цитотоксичность против клеток рака желудка. В заключение tenovin-6 обладает мощной противоопухолевой активностью в отношении клеток рака желудка человека путем DR5 повышающей регуляции. Наши результаты должны быть полезными для будущего клинического развития Sirtuin ингибиторов
<р> Образец цитирования:. Хираи S, Эндо S, Сайто R, Hirose M, Уэно T, H Suzuki и др. (2014) Противоопухолевые Эффекты Sirtuin ингибатора, Tenovin-6, против клеток рака желудка через смерть рецептору 5 повышающую регуляцию. PLoS ONE 9 (7): e102831. DOI: 10.1371 /journal.pone.0102831
<р> Редактор: Андрей Л. Gartel, Университет штата Иллинойс в Чикаго, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 28 октября 2013; Принято: 23 июня, 2014 года; Опубликовано: 17 июля 2014
<р> Copyright: © 2014 Hirai и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами-в-помощь от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии (до IH). Никакого дополнительного внешнего финансирования не было получено для данного исследования. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одной из основных причин смерти от рака во всем мире [1], [2]. Хотя различные химиотерапевтические препараты для поздних стадий рака желудка, были разработаны, прогноз по-прежнему бедные и новые противоопухолевые препараты для рака желудка необходимы. Рак желудка является биологически и генетически разнородны рака с участием многочисленных генетических мутаций и эпигенетических чередований [3]. Среди них аномалии TP53
ген-супрессор опухоли играют важную роль в онкогенеза [4], [5]. Примерно у 30% больных раком желудка у TP53
мутация [6]. Даже в раковых клетках дикого типа (WT) ТР53
, сообщалось о том, что функция ТР53
подавляется негативной регуляции, включая убиквитинирование, метилирование и деацетилирования [7], [8]. В этом контексте было бы перспективной стратегией предположить, что ингибирование этих отрицательных результатов регуляторов в усиления противоопухолевых эффектов через активацию р53 в вес TP53
рака. Мышиные двойной минуты 2 (MDM2) является главным физиологическим антагонистом р53 [7]. Ранее мы сообщали, что ингибитор MDM2, nutlin-3, продемонстрировали сильное воздействие противоопухолевых против клеток рака желудка путем активации р53 пути [9]
<р> Sirtuin 1 (SIRT1), NAD + -. Зависимый гистондеацетилазы (HDAC), имеет целый ряд функций, участвующих в хроматина глушителей, долговечности и стабильности генома. Он находится в ядре и действует как датчик клеточного метаболического статуса выживаемости и старении под генотоксичного и окислительного стресса [10], [11]. К тому же гистона дезацетилирования, эти функции частично зависят от дезацетилирования различных негистоновых белков, которые включают транскрипционные факторы: p53, Forkhead коробка (FOXO) белков семейства, фактор кВ ядерный, с-Мус, N-Myc, E2F1 и гипоксией-индуцируемый факторы транскрипции (HIF) 1α /2α; хроматина, связанные ферменты: гистонацетилтрансфераза, P300, ДНК-зависимой киназы субъединица Ku80 и Tip60; репарации ДНК элементы: Ku70, RAD51 и NBS1; и клеточных сигнальных факторов: STAT3, β-катенин и Smad7 [11] - [13]. SIRT1 физиологически взаимодействует с P53 и затухает свои функции через дезацетилирования на своем С-концевого остатка Lys382 [12]. Избыточная экспрессия SIRT1 был обнаружен во многих видов рака, таких как желудка и толстой кишки [10], [14], и сообщается, чтобы функционировать в качестве промотора опухоли. SIRT2 является одним из цитоплазматической NAD + - зависимых гистондезацетилаз и деацетилирует гистона H3 лизин 56 (H3K56) и альфа-тубулина. Он также разделяет негистоновых субстраты foxo1, FOXO3 и p53 с SIRT1 [11]. Тем не менее, точная роль SIRT2 остается неуловимым в биологии рака.
<Р> На этом фоне, мы исследовали, может ли tenovin-6, соединение малой молекулой, которая ингибирует SIRT1 и SIRT2 функции [15], [16], оказываемое противоопухолевые эффекты посредством активации пути p53 в раковых клетках желудка. Недавно сообщалось, что ингибиторы СИРТ повышающей регуляции смертный рецептор 5 (DR5), член семейства рецепторов фактора некроза опухоли, в некоторых видов рака [17], [18]. Мы дополнительно исследовали участие этого рецептора в противоопухолевой активности tenovin-6 для рака желудка. Кроме того, мы исследовали синергизм tenovin-6 с обычными цитостатическими препаратами для будущего клинического развития рака желудка.

Материалы и методы

Клеточные линии
<р> Семь клетку рака желудка были использованы линии: четыре клеточные линии с вес TP53
(MKN-45, NUGC-4, STKM-2, СНУ-1), две клеточные линии с мутантной типа (MT) TP53 <бр> (NUGC-3, STKM-1), и одна линия клеток с нулевым TP53
(KatoIII) [19] - [21]. Клеточные линии с масс TP53
(MCF-7 рака молочной железы, HEK293 эмбриональные клетки почки человека) и MRC-5 нормальные фибробласты человека были включены в качестве контроля в данном исследовании. MKN-45, NUGC-4, KatoIII и MRC-5, клеточные линии были получены из RIKEN БРС Cell Bank (Цукуба, Япония). SNU-1 и MCF-7 клеточные линии были приобретены из Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD). клеточные линии NUGC-3 и HEK293 были получены из Медицинского научного исследования Ресурсы банка (Осака, Япония). STKM-1 и STKM-2 клеточные линии были любезно предоставлены доктором Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, Школа Медицины, Япония).

Химические вещества
<р> Tenovin-6 был приобретен у Cayman Chemical Компания (Ann Arbor, MI). Доцетаксел, SN-38, цисплатин, 5-фторурацил (5-ФУ), доксорубицин и тапсигаргин получали из Wako (Осака, Япония). Они растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при концентрации 20 мМ, и аликвоты хранили при -20 ° С. Маточные растворы разводили до желаемой конечной концентрации с ростовой среды непосредственно перед использованием.

Антитела и Вестерн-блот-анализ
<р> SDS-электрофорез polyaclylamidegel и Вестерн-блоттинга были выполнены, как описано ранее [22]. Первичные и вторичные антитела были использованы следующим образом. Кроличьи поликлональные антитела против SIRT1 (D739), ацетилированный (Ac) -p53 (Lys382), фосфорилируется (фосфо) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-тубулина (Lys40), смерть рецептора 5 (DR5), Fas -associated домен смерти (FADD), расщепляется поли (АДФ) -ribose полимеразы (PARP) (Asp214), и мышиные моноклональные антитела против р21 Waf /Cip1
(DCS60), гистона H3 (96C10) , р-актина (8H10D10), α -tubulin (DM1A) и C /EBP гомолог белка (Чоп) (L63F7) и кролик моноклональные антитела против TRAIL (C92B9), каспазы-3 (8G10), инозит требующих фермента (IRE ) 1α (14C10) и фосфорно-РНК-зависимой протеинкиназы типа эндоплазматической сети киназы (PERK) (16F8) были получены от Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Мышиные моноклональные антитела к p53 (BP53-12) был приобретен у фирмы Cell Science (Canton, MA), анти-SIRT2 (4B11) моноклональные антитела от Sigma-Aldrich. (Сент-Луис, штат Миссури), и анти-активирующий фактор транскрипции 6 (ATF6) моноклональное антитело (70B1413.1) был от Энцо Life Science (Farmingdale, Нью-Йорк). Кроличьи поликлональные антитела к Ac-гистона H3 (Lys18) был от Merck Millipore (Billerica, MA). Оба с пероксидазой хрена (HRP) антитела против мышиных IgG овцы и анти-кроличий IgG осла Сыворотки от компании GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Связывание антител определяли с использованием системы ECL Вестерн-блоттинга Prime Detection (GE Healthcare), в соответствии с протоколом производителя. Интенсивность сигнала количественно с использованием Ez захвата II системы визуализации хемилюминесценции (ATTO, Токио, Япония).

в режиме реального времени количественный ПЦР для анализа SIRT1
и SIRT2
экспрессия гена
<р> образцы РНК экстрагировали из клеточного лизата с использованием высокочистых набора Выделение РНК (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия), в соответствии с инструкциями изготовителя. После того, как геномную ДНК удаляли ДНКазы, кДНК получали с использованием большой емкости РНК-к-кДНК набор (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). В режиме реального времени количественный ПЦР проводили с использованием Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Праймеры и TaqMan зонд для SIRT1
и SIRT2
были получены от Applied Biosystems (пробирной ID: Hs01009005 и Hs00247263, соответственно), а также тех, для 18S рибосомной РНК (18S рРНК)
разработаны и синтезированы Sigma-Aldrich были следующими: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (прямой праймер), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (обратный праймер), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (зонд). Реакции проводили в трех экземплярах в стандартных условиях термоциклирования с использованием 30 нг кДНК, 900 нМ праймеров, 250 нм зондов, и Expression Taqman Gene Master Mix (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя.
<Р> РНК экстрагировали из клетки были проанализированы для относительных количеств гена-мишени ( SIRT1, SIRT2
) и ссылка гена ( 18S рРНК
) с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

WST-8 жизнеспособности клеток анализы
<р> WST-8 колориметрические анализы проводили с использованием Cell счетная Kit-8 (Dojin Laboratories, Кумамото, Япония), в соответствии с протоколом производителя. Клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 5 × 10 3 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды в течение 24 ч, обрабатывали tenovin-6 в течение 72 ч, инкубированные в присутствии WST-8, а затем анализируют с помощью микропланшет-считывателем ИМАРК (Bio-Rad, Hercules, CA).

Анализ апоптоза с помощью проточной цитометрии
<р> Клетки высевали в 60-мм чашках при плотности 5 × 10 5 на чашку. После инкубации с tenovin-6 (10 мкМ) или эквивалентное количество ДМСО в течение 72 ч, клетки осторожно приподнимают Accutase (США биотехнологиям, Паркер Форд, PA) при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем клетки промывали один раз фосфатным буферным солевым раствором. Апоптотических клеток были обнаружены двойным окрашиванием пропидийиодидом (PI) и изотиоцианат флуоресцеина (FITC) меченных аннексина V с использованием аннексина V-FITC апоптозом Detection Kit (Beckman Coulter, Brea, CA) в соответствии с протоколом производителя. Анализ проточной цитометрии Затем был проведен с потоком FACS Calibur цитометра (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) и CellQuest программного обеспечения (BD Biosciences).

миРНК таргетинг DR5

<р> миРНК ориентации DR5 был разработан с использованием программного обеспечения siDirect (http://sidirect2.rnai.jp/), как сообщалось ранее [22]. миРНК трансфекции проводили с использованием Липофектамин RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Контроль миРНК была искусственная последовательность разработан, чтобы иметь наименьшее гомологии с генами человека и мыши. Смысловой и антисмысловой нити миРНК, используемые в этом исследовании, были следующими: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(смысловой), 5'-UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3' (антисмысловой); контроль миРНК, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(смысловой), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (антисмысловой).
<р> Для анализа воздействия миРНК на рост клеток и жизнеспособность клетки высевают при низкой плотность (1 × 10 3 клеток на лунку) в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл среды RPMI1640 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Sigma-Aldrich). Жизнеспособность трансфецированных клеток оценивали 72 и 120 ч после трансфекции с помощью WST-8 анализа.

Индекс Комбинация
<р> Чтобы определить, является ли tenovin-6 может усилить противоопухолевый эффект обычных химиотерапевтических препаратов, мы используется индекс комбинации (CI) и изоболограммы, рассчитанное с использованием программного обеспечения CalcuSyn (Кембридж, Великобритания), в соответствии с принципом медиана эффекта Chou и Талалай [23]. В этом анализе, CI > 1,3 указывает на антагонизм; CI = 1,1-1,3 умеренный антагонизм; CI = 0,9-1,1 аддитивный эффект; CI = 0,8-0,9 небольшие синергизм; CI = 0,6-0,8 умеренный синергизм; CI = 0,4-0,6 синергизм; и CI = 0,2-0,4 сильный синергизм.

Статистический анализ
<р> Все эксперименты проводились в трех экземплярах и повторяли по крайней мере, три раза. Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Достоверность различий определяли с помощью Т-критерия Стьюдента и тест Дуннетта. р
-значения &л; 0,05 считались значимыми

Результаты

Выражение SIRT1, SIRT2, и ацетилированный (Ac) -p53 в желудочном линиях раковых клеток
. <р> во-первых, мы исследовали уровни экспрессии SIRT1, SIRT2, и Ас-p53 в семи желудочных линиях раковых клеток. Мы использовали НЕК293 для положительного контроля SIRT1 /2, и MCF-7 клетках, обработанных с доксорубицином для положительного контроля Ас-p53 [24]. Все желудочные клеточные линии рака для NUGC-4 и клеток STKM-1, за исключением экспрессируют высокие уровни белка SIRT1, и уровни экспрессии SIRT2 были низкими во всех клеточных линиях для клеток MKN-45 (рис 1А), за исключением. Уровни экспрессии Ac-p53 были очень низкими во всех желудочных линиях раковых клеток с вес TP53
.
<р> Мы проанализировали экспрессию генов SIRT1
и SIRT2 <бр> по реальном времени количественной ПЦР. MKN-45 клетки выставлены Sirt1
экспрессии гена, который был приблизительно в 2,5 раза выше, чем в фибробластах, но другие желудочно-кишечные клеточные линии рака предстательной не (Фигура 1В). В клетках NUGC-4, уровень экспрессии гена SIRT1
был низким, как это было SIRT1 белка. MKN-45 клеток показали слегка высокий SIRT2
экспрессии генов, в то время как другие клеточные линии показали довольно низкие уровни экспрессии.

Tenovin-6 ингибирует рост клеток рака желудка
<р> Для того, для подтверждения tenovin-6 активности, мы изучали, влияет ли tenovin-6 ацетилирование гистона H3 и альфа-тубулина. Tenovin-6 увеличил ацетилирование гистона в трех (MKN-45, NUGC-4, и KatoIII) четырех желудочных линий раковых клеток тестируемых, что указывает на ингибирование деацетилирования активности SIRT1 (фиг.2А). Ас-α-тубулина увеличилась только в одной клеточной линии (MKN-45) обрабатывают tenovin-6, следовательно, ингибирование деацетилирования активности SIRT2 не может быть определенно показано клеток рака желудка.
<Р> Далее, мы оценили потенциал противоопухолевое действие tenovin-6 против клеток рака желудка. Каждая желудочный линия клеток рака культивировали в присутствии tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20 и 50 мкМ) в течение трех дней. Дозозависимое ингибирование роста наблюдалось во всех клеточных линиях, а не только те, с TP53 вес
но т и нулевые версии (рис 2б). Их IC <суб> 50 значений в диапазоне от 2,34 до 4,28 мкМ. Кроме того, WST-8 Анализ проводили в человеческой клеточной линии фибробластов, MRC-5 (IC <суб> 50: 6,09 мкМ), чтобы сравнить токсичность tenovin-6 к действию желудочного линий раковых клеток. Жизнеспособность клеток NUGC-4 обработанных tenovin-6 был значительно ниже, чем у MRC-5 клеток, как показано на фиг.2С.

Tenovin-6 индуцированный апоптоз клеток в раковых клетках желудка
<р> Как показано на фигуре 3А и S1, tenovin-6 обработка повышает экспрессию p53 и p21 в мас TP53
клетки (MKN45 и NUGC-4). Повышающая регуляция Ac-p53 было показано в клетках MKN-45, но не в клетках NUGC-4. Повышенная экспрессия р21 наблюдалась также в мт TP53
клетки (NUGC-3). В противоположность этому, экспрессия Bcl-2 не изменялась почти во всех четырех желудочных клеточные линии рака предстательной. наблюдались Повышения DR5 и расщепленной PARP экспрессии во всех клеточных линиях. Уровни экспрессии TRAIL, которые функционируют в качестве лиганда в передаче сигналов смерти связи, была слегка увеличена во всех клеточных линиях, хотя экспрессия FADD, важного адаптера, не была затронута tenovin-6.
<Р> Мы исследовали уменьшилось ли tenovin-6 жизнеспособность клеток рака желудка путем индукции апоптотической гибели клеток. Раковые клетки подвергали воздействию него при концентрации 10 мкМ или эквивалентное количество управления транспортным средством (ДМСО) в течение 72 ч, а затем окрашивали ФИТЦ-аннексина V и PI. Они были проанализированы с помощью проточной цитометрии: клетки негативной для обоих аннексина V и PI были признаны не-апоптическая клетки положительные для аннексина V только были сочтены ранней апоптическая, а клетки положительным для обоих аннексина V и PI считались поздно апоптическая или некротической. Воздействие клеток MKN-45 до tenovin-6 увеличила доли ранних и поздних стадиях апоптоза с 2,8% до 52,1% и с 1,8% до 18,5%, соответственно (рис 3B). Аналогичный рост населения в ранних и поздних стадиях апоптоза наблюдались в других клеточных линиях (NUGC-4, NUGC-3, и KatoIII). Tenovin-6 индуцируется апоптоз во всех клеточных линиях, независимо от TP53
статус.

Эффект DR5
нокдаун на tenovin-6-индуцированного апоптоза
<р> Далее, чтобы проверить, является ли <ЕМ> DR5
глушителей пострадавших tenovin-6-индуцированный апоптоз, жизнеспособность клеток и апоптотической скорость анализировали с помощью WST-8 анализа и проточной цитометрии, соответственно, в ТР53
-null KatoIII клетки. Подавление экспрессии DR5 по специфическим миРНК (рис 4A) значительно снижается tenovin-6-индуцированной гибели клеток и апоптоз в клетках KatoIII (рис 4В и 4С). Мы использовали три различных миРНК в нашем предварительном эксперименте, и мы получили аналогичные результаты с любыми миРНК.
<Р> Мы исследовали активацию эндоплазматический ретикулум (ER) стресс пути, который связан с DR5 до регулирования, как и раньше сообщили [17]. ЧОП является одним из наиболее мощным индуктором DR5 и выше по потоку от апоптоза, и часто выделяется при ER стресса. Как показано на рисунке 5А и 5В, хотя СНОР была незначительно повышающей регуляции обработкой tenovin-6 во всех четырех желудочных линий раковых клеток, повышенные уровни были значительно ниже, чем в контрольных клетках, обработанных тапсигаргин, который является селективным ингибитором саркоплазматического /эндоплазматический ретикулум Са 2 + - АТФазы и широко используется в качестве клеточного стрессора ER [25], [26]. С другой руки, IRE1, который представляет собой датчик напряжений ER и расположенный на входе CHOP, был слегка повышающей регуляции обработкой tenovin-6 во всех клеточных линиях, но не фосфорилированный Perk и ATF6. [27], [28]. Казалось маловероятным, что tenovin-6 вызвало ER стресс, ведущий к DR5 индукции в наших клеток рака желудка.

Противоопухолевое действие tenovin-6 в сочетании с химиотерапевтическими агентами
<р> Наконец, мы исследовали, является ли tenovin- 6 усиливается противоопухолевый эффект химиотерапевтических агентов, включая доцетаксел, SN-38, цисплатин и 5-FU, в желудочном линиях раковых клеток. Четыре клеточные линии с вес TP53
(MKN-45, NUGC-4), т TP53
(NUGC-3), и нуль TP53
(KatoIII) обрабатывали с отдельно или в сочетании с двумя дозами (2 и 5 мкМ) tenovin-6 этих агентов. Концентрации 0,25 нМ доцетаксела, 1 нМ СН-38, 0,5 или 1 мкМ цисплатина, и 0,25 мкМ 5-ФУ. Как показано в таблице 1 (и рис S2), доцетаксел и SN-38 показали небольшое, чтобы смягчить синергический эффект на лечение tenovin-6 в трех клеточных линий, и цисплатина с tenovin-6 показали умеренное синергический эффект в двух клеточных линий, в то время как 5-ФУ в комбинации с tenovin-6 показали более низкий эффект, чем другие агенты. Мы исследовали выражения DR5 после введения tenovin-6 с химиотерапевтическими агентами. DR5, повышающая регуляция по tenovin-6 была повышена с комбинацией доцетаксела в MKN-45 клеток (рис S3).

Обсуждение
<р> Мы показали, что tenovin-6 показали, обладающие значительной противоопухолевой активностью в сопровождении апоптотической гибели клеток в раковых клетках желудка человека с вес TP53
, а также те, с т TP53
. Несколько специфических ингибиторов сиртуинов, такие как sirtinol, сурамином, salermide и thiobarbiturates, как сообщалось, ингибируют рост клеток при различных видах рака [29]. Большинство исследователей описал противоопухолевый эффект Sirtuin ингибиторов в клеточных линиях с вес TP53
[15], [29] - [31], и отнести их к активации апоптоза через ацетилирования р53. В то же время, несколько докладов были опубликованы в последние годы, которые показали противоопухолевую деятельность Sirtuin ингибиторов в клеточных линиях с т TP53
через р53-независимых путей [17], [18]. Мы показали, что DR5 нокдаун ослабляется противоопухолевый эффект tenovin-6 в TP53
-null клеток рака желудка. Активация сигнального пути рецептора гибели посредством повышающей регуляции DR5 играет ключевую роль в tenovin-6-индуцированной гибели клеток, как уже упоминалось в других докладах о Sirtuin ингибиторов.
<Р> Было сообщено, что salermide усиленная экспрессия DR5 и индуцирует апоптоз в раковых легких немелкоклеточного клеток клеток человека проведения мт TP53
[17]. В этом докладе, одновременное глушение SIRT1
и SIRT2
а также salermide до регулируемых DR5, сопровождается регуляцию ЭР, связанных со стрессом белков, таких как ATF4 и измельчить. Эти результаты свидетельствуют о том, что ER стресс был вовлечен в этой индукции DR5. Мы предположили, что tenovin-6 также привело к увеличению экспрессии DR5 через активацию ER стресса, опосредованного PERK, IRE1, ATF6 и ЧОП. Однако, вопреки ожиданиям, не был явно обнаружен сигнал пути ЭР стресса, активированного tenovin-6. Тем не менее, не было четких доказательств, что DR5 индуцировали tenovin-6. Существуют и другие пути, СНОР-опосредованной DR5, повышающая регуляция: активные формы кислорода (ROS), с-июнь NH <суб> 2-концевая киназа (JNK) пути, р38 митоген-активируемой протеинкиназы пути, и так далее [ ,,,0],32] - [38]. Тем не менее, мы не рассматривали эти пути здесь, потому что мы не могли определить активацию CHOP в нашем исследовании. Наши результаты свидетельствуют о том, что другие p53- и СНОР-независимых путей участвуют в экспрессии DR5 tenovin-6-индуцированного в клеток рака желудка.
<Р> Мы показали, что tenovin-6 индуцированный апоптоз клеток путем активации пути DR5. Тем не менее, P53 и CHOP пути, казалось, вряд ли будет участвовать в этой индукции DR5, и механизм DR5 повышающей регуляции остается неясным. Мы, в последнее время, исследовали противоопухолевые эффекты tenovin-6 в нескольких линиях клеток рака толстой кишки, и нашел его мощной противоопухолевой активностью в отношении большинства из них до регуляции DR5, а также [39]. Однако в CaCo2 клетках рака толстой кишки (MT TP53
), апоптотической гибели клеток под действием tenovin-6 была менее очевидна и экспрессия DR5 не сильно повышающей регуляции. CaCo2 ячейки были зарегистрированы, чтобы выразить высокий уровень белков теплового шока, известных как подавитель DR5 [40] - [43]. Это соотношение должно быть изучено далее в будущем. SIRT1 может deacetylate гистона Н4 лизин 16 (H4K16), а также H3K9, H3K14 и H1K26, которые тесно связаны с молчанием генов [11]. Кроме того, она имеет множество соответствующих НЕГИСТОНОВЫХ субстратов: транскрипционные факторы, элементы техники репарации ДНК, ядерные рецепторы, гистон-модифицирующие энзимы и клеточные сигнальные молекулы, как описано в [11] - [13]. Эти многочисленные и сложные ассоциации SIRT1 деятельности участвуют в различных биологических функциях, таких как регуляция экспрессии генов и репарации повреждений ДНК. Раковые клетки, как правило, требуют эти функции SIRT1 для того, чтобы выжить, пролиферировать и ремонт катастрофического геномную повреждения. Недавние исследования выявили способность tenovin-6 индуцировать дифференцировку и ингибировать аутофагию в рамках своих противоопухолевых эффектов в лейкозных клетках [44], [45]. Это может зависеть от поведения клеток рака как tenovin-6 влияет на опухолевый активность. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы уточнить связь между tenovin-6-опосредованной смерти пути и сложные роли SIRT1.
<Р> Мы исследовали эффекты сочетания доцетаксел, SN-38, цисплатин и 5-FU с tenovin -6, потому что они широко используются для лечения пациентов с раком желудка [46], [47]. Незначительное до умеренного синергетические эффекты доцетаксела и SN-38 с tenovin-6 в желудочном линий раковых клеток, независимо от TP53
статус, были найдены.
<Р> Хотя лечение с участием комбинации доцетаксела и сиртуина ингибиторы не сообщалось, комбинации доцетаксел и другие ингибиторы HDAC, такие как трихостатин а и субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA), как сообщается, имеют синергетические эффекты, связанные с активацией каспазы или тубулина ацетилирования в нескольких раковых клеточных линий [48] - [50] , В нашем исследовании, остается неясным, если тубулина ацетилирования по tenovin-6 всегда влияет на противоопухолевый эффект, так как тубулина ацетилирование было показано только в одной клеточной линии. SN-38 (активная форма иринотекана) представляет собой ДНК-топоизомеразы I ингибитор, который действует только в фазе S и препятствует репликации ДНК и деление клеток [51], [52]. ингибиторы HDAC индуцируют ацетилирование гистонов и ослабить структуру хроматина, в результате чего ингибитор топоизомеразы может более легко получить доступ к ДНК, способствуя повреждение ДНК [51], [53]. Кроме того, значительное увеличение генерации активных форм кислорода было сообщено в мелкоклеточных клеток рака легких при одновременном воздействии SAHA и топотекан (производное камптотецина) [51]. Повышенная активность лечения сочетания tenovin-6 и SN-38 могут быть связаны с кооперативной регуляции реакции повреждения ДНК.
<Р> Преимущество комбинированной терапии с tenovin-6 и цисплатин или 5-ФУ была меньше, чем с другими агентами в клетках рака желудка, хотя и несколько отчетов продемонстрировали усиление апоптоза комбинированной терапии с цисплатином или 5-ФУ и других ингибиторов HDAC в других опухолей [54] - [57].
<р> Что касается оценка токсичности tenovin-6, мы использовали линию клеток фибробластов в качестве альтернативных, не онкогенных клеток для прогнозирования токсичности в отношении нормальных клеток со ссылкой на предыдущие доклады [15], [18]. Трудно было найти соответствующее нормальное управление для сравнительных исследований, и поэтому окончательно необходимо изучить токсичность tenovin-6 (в сочетании с препаратами против рака) В естественных условиях
, с использованием моделей животных ксенотрансплантатов.

В заключение, ингибитор Sirtuin, tenovin-6, показали надежную противоопухолевый эффект против клеток рака желудка человека. Это не зависит от TP53
статус и индуцировали с помощью повышающей регуляции DR5. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы уточнить механизм, с помощью которого tenovin-6 регулирует экспрессию DR5. Tenovin-6 в сочетании с доцетакселом и SN-38 имели небольшое преимущество для ингибирования пролиферации клеток рака желудка, которая могла бы обеспечить новую стратегию для лечения поздних стадий рака желудка.

Поддержка Информация рис S1
.
Относительная интенсивность экспрессии белков, 'показано на фигуре 3А. Semi-Количественное Западной блоттинга денситометрии участвующих нормализации к бета-актина уровни
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0102831.s001
(TIF) Рисунок S2
.
цитотоксическое действие химиотерапевтических препаратов в сочетании с tenovin-6. Цитотоксическое действие химиотерапевтических препаратов, включая доцетаксел, SN-38, цисплатин и 5-ФУ, а также их усиление эффектов tenovin-6 клеток рака желудка с желудочным раковых клеток. Клетки культивировали в течение 72 ч с указанными концентрациями tenovin-6 и химиотерапевтическими лекарственными средствами. A: доцетаксел (0,25 нМ), В: SN-38 (1 нМ), C: цисплатин (1 или 0,5 мкМ; NUGC-3 обрабатывали 0,5 мкМ цисплатином), и D: 5-ФУ (0,25 мкМ), получали в сочетании с tenovin-6. Статистическая значимость различий между группами оценивали с помощью теста Даннетта. * р
&л; 0,01; ** р
&л; 0,05. DOC: доцетаксел, CDDP:. Цисплатин
DOI: 10.1371 /journal.pone.0102831.s002
(TIF) Рисунок S3
.
DR5 выражения после введения tenovin-6 с доцетакселом или SN-38 в клетках рака желудка (MKN-45 и KatoIII). Доцетаксел, SN-38 и tenovin-6 вводили в концентрации 0,25 нМ, 1 нМ и 2 мкМ. Semi-Количественное Западной блоттинга денситометрии участвующих нормализации к бета-актина уровней. DOC:. Доцетаксел
DOI: 10.1371 /journal.pone.0102831.s003
(TIF)

Рак желудка

Other Languages