PLoS ONE: Роман Функциональный TagSNP Rs7560488 в DNMT3A1 Promoter связан с предрасположенностью к рака желудка путем модулирования Обр Activity

Абстрактный
<р> ДНК-метилтрансферазы (DNMT) -3A, который содержит DNMT3A1
и DNMT3A2
изоформы было предложено сыграть решающую роль в канцерогенезе и показал аномальным выражение в большинстве раковых образований. Накопленные свидетельства также указывается, что одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) в генах DNMT были связаны с восприимчивостью к различным опухолям. Мы предположили, что генетические варианты в DNMT3A1
промоторной области связаны с риском развития рака желудка. Мы выбрали tagSNPs из базы данных HapMap для китайцев и генотипирование в исследовании случай-контроль, чтобы оценить связь с раком желудка (GC) в китайской популяции. Мы определили, что функциональные tagSNP rs7560488 T &° С связано со значительно повышенным риском GC. В пробирке
функциональный анализ с помощью анализа люциферазы и EMSA показал, что tagSNP rs7560488 T &° С существенно изменили транскрипционную активность DNMT3A1
гена с помощью влияния на связывание некоторых транскрипционных факторов, хотя определенный транскрипционном фактор еще предстоит установить. По сравнению с ТТ гомозигот, пациентов, которые были TC гетерозиготы и гомозиготы CC экспонируемых пониженную экспрессию DNMT3A1
. Кроме того, расслаиваются анализ показал, что люди, которые укрывают TC или CC генотипы менее чем за 60 лет были более восприимчивы к GC. Наши результаты свидетельствуют о том, что генетические вариации в <ЕМ> DNMT3A1
промоутер внести свой вклад в восприимчивость к GC, а также дают представление о том, что tagSNP rs7560488 Т &° С может быть перспективным биомаркером для прогнозирования GC генетической предрасположенности и ценную информацию в GC патогенез
<р> Образец цитирования:. Wu H, K Чжан, Гонг P, Цяо F, Ван L, H Кюи и др. (2014) Роман Функциональный TagSNP Rs7560488 в DNMT3A1 Promoter ассоциируется с восприимчивостью к рака желудка путем модулирования активности промотора. PLoS ONE 9 (3): e92911. DOI: 10.1371 /journal.pone.0092911
<р> Редактор: Синь Юань Гуан, Университет Гонконга, Китай
<р> Поступило: 22 декабря 2013 года; Принято: 27 февраля 2014; Опубликовано: 25 марта 2014
<р> Copyright: © 2014 Wu и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант № 81171915 и № 91229107) и научных исследований и инноваций план для выпускников колледжей провинции Цзянсу, Китай (грант № CXZZ13_0082). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей в Китае, особенно в провинции Цзянсу с высоким уровнем заболеваемости и смертности [1], [2]. Он может распространиться по всему животу и других органов, в том числе пищевода, легких, лимфатических узлов или печени. Таким образом, рак желудка является второй ведущей причиной рака, связанных смерти в [3] мире. С учетом терапевтической эффективности, хирургическая резекция может быть первичным лечебным средством для лечения ранней стадии у пациентов GC [4]. К сожалению, большинство больных раком желудка обнаружены в продвинутой стадии, в течение которого опухоль являются неоперабельным больше. Кроме того, рецидив после операции еще одно страшное событие для бедных выживаемости 5 лет. Принимая во внимание пациентов с прогрессирующим или рецидивирующим раком желудка, нет сомнений в том, что открытие биомаркеров и их применение в сопровождении с традиционным диагнозом может быть ценным показателем и обширная помощь в разработке стратегии профилактики и лечения. Тем не менее, до сих пор, мало поддающихся биомаркеры для прогнозирования рецидива GC были идентифицированы.
<Р> онкогенеза, как известно, многоступенчатый процесс, который является результатом не только генетических изменений, но и эпигенетические изменения [5]. Метилирование ДНК является одной из основных форм эпигенетической модификации и играет существенную роль в развитии, дифференциации, стабильности генома, X-инактивация и импринтинга специфическими регуляции экспрессии генов. Наиболее часто изучали эпигенетические явление метилирование ДНК, важнейшим регулятором транскрипции и структуры хроматина. Аберрантных паттерны метилирования ДНК в генетически предрасположенных фоне может быть связано с повышенным риском развития ряда заболеваний у человека [6], [7], в том числе GC [8]. Dnmt3a
которая содержит DNMT3A1
и DNMT3A2
два De Novo
ДНК метилтрансферазы играет решающую роль в эмбриональном развитии и аберрантных метилирования ДНК в канцерогенезе. Некоторые полиморфизм Dnmt3a гена
может регулировать экспрессию генов, влияют на его ферментативную активность и может способствовать восприимчивости к раку. Накопленные доказательства в области молекулярной генетики показывают, что SNP в DNMT
генов связаны с предрасположенностью к раку [9], [10]. Недавние успехи в исследовании генома ассоциации (GWAS) также были выявлены новые восприимчивости ОНП для GC, что полезно понять основной механизм генетических вариаций в развитии GC [11] - [14]. Наше предыдущее исследование показало, функционал rs1550117 SNP в Dnmt3a
промотор, который может увеличить свою транскрипционную активность и внести свой вклад в генетическую предрасположенность к раку желудка в китайской популяции [15], [16].
<Р> GWAS принесло многочисленные SNPs, связанные со многими видами рака. В некоторых случаях десятки ОНП, называемые tagSNPs, которые представляют собой ОНП в области генома с высокой неравновесия по сцеплению может идентифицировать генетические вариации без генотипирования каждые ОНП в хромосомной области, поэтому tagSNPs полезны в целом-генома исследований SNP ассоциации, такие как простаты, молочной железы, яичников, ободочной и прямой кишки и рака мозга [17] - [19]. В настоящем исследовании мы выбрали tagSNP rs7560488 из базы данных HapMap для китайских субъектов оценить ассоциации между генетическими вариантами в DNMT3A1
промоутер и риск развития рака желудка в китайской популяции. Мы определили риск-ассоциированный rs7560488 T &Гт. C полиморфизм в DNMT3A1
промоутер, и наша дальнейшая работа предположил, что этот вариант может привести к изменению активности промотора и разрушить связывающую способность транскрипционных факторов

материалы и методы

Учебные предметы
<р> в общей сложности 405 пациентов с гистологически подтвержденным раком желудка и 408 без рака управления были приняты на работу в этом исследование случай-контроль, а также характеристики случаев и контроля подробно описаны в таблице 1. Случаи и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и были отобраны из первой филиал больницы Нанкин медицинского университета. Все образцы были получены с письменного согласия и проанализированы анонимно. Это исследование было проведено с одобрения медицинского Этического комитета Медицинской школы Юго-Западного Университета в.

TagSNP Выбор и TF Binding Site Prediction

Основная гипотеза, лежащая в основе этого эксперимента было то, что есть один или более ОНП в DNMT3A1
промоторных областей, которые связаны с риском развития рака желудка. В зависимости от неравновесия по сцеплению (LD) структуры в конкретном локусе, tagSNPs может быть суррогаты для многих тысяч других ОНП. Мы постулировать, что такие tagSNPs также могут пометить любые доселе идентифицированных ОНП в DNMT3A1
промоутер. Таким образом, мы выбрали ОНП в DNMT3A1
промоторной области с малой частотой аллеля (МАФ) в &ГТ; 5% от обеих баз данных HapMap и dbSNPs. Для реализации потенциально функциональный выбор tagSNP, мы используем данные Международного HapMap и свободно веб-инструментов выбора tagSNP для выбора tagSNPs, а также использовать TF-алгоритм поиска (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH~~HEAD=dobj .html) для прогнозирования rs7560488 фактор транскрипции (TF) сайт связывания.

ДНК Добыча и HRM генотипирование
<р> для изучения DNMT3A1
промотор tagSNP rs7560488, геномную ДНК выделяли из 1 мл периферической крови больных и здоровых людей, и выделяли из белых кровяных клеток в течение недели после взятия пробы с помощью протеиназы к пищеварения, как описано ранее [20]. TagSNP rs7560488 был генотипирование с использованием дц краситель LC Зеленый в сочетании с высокой разрешающей способностью плавления (HRM) анализа. Более подробно, ПЦР-праймеры были разработаны конструкторским праймер программного обеспечения LightScanner (Айдахо Technology) (прямой праймер: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 '; обратный праймер: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), который продукт один фрагмент 208 пар оснований. Каждую реакцию ПЦР первоначально осуществляли в конечном объеме реакционной смеси 10 мкл, с использованием 25 нг геномной ДНК, 0,2 пмоль каждого праймера, 0,8 мкл 2,5 мМ дНТФ, 1 мкл 25 мМ MgCl <суб> 2, 1 мкл 10 × Taq буфер с (NH4) <суб> 2SO <суб> 4, 0,4 U Taq ДНК-полимеразы (Ферментас), 1 мкл 1X LC-зеленый плюс (Айдахо Technology), и 0,4 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Реакционную смесь инкубировали при 95 ° С в течение 5 мин и затем подвергали 40 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 57 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 30 сек, затем 72 ° С в течение 7 мин с использованием амплификатор ПТК-200 (Bio-Rad). Реакции ПЦР переносили в 96-луночные планшеты (Bio-Rad) и анализировали на Light Scanner (Idaho Technology). Данные флюоресценции были собраны в интервале температур от 70-97 ° С, и анализ кривой плавления проводили в соответствии с программным обеспечением производителя. HRM может непосредственно различить гетерозиготы (ТС) и гомозиготы (CC или TT) генотипов tagSNP rs7560488 T &° С с помощью сканирования расплава. После смешивания гомозиготной ДНК с равным количеством известных продуктов ПЦР (например, CC), он далее проводит различие между ЦК и ТТ генотипами. Для дальнейшего подтверждения, 5% проб из каждой группы, обнаруженной HRM были выбраны случайным образом и подвергали секвенирования ДНК для обеспечения надежности и воспроизводимости.

Строительство люциферазы плазмидной
<р> Для построения DNMT3A1 tagSNP rs7560488 репортерной плазмидой, мы амплифицировали фрагмент в 948 пар оснований из 25422345 до 25422345 из DNMT3A1
область промотора, который содержит Т и с аллеля SNP с помощью ПЦР из геномной ДНК. Праймеры, используемые для ПЦР-амплификации были: (вперед: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', обратный 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). Продукты ПЦР субклонируют в сайтах рестрикции NheI и HindIII в pGL3-основной вектор (Promega, Madison, WI). Мы проверили все рекомбинантных клонов путем секвенирования ДНК.

Трансфекция и Переходный Dual люциферазы пробирного

желудка человека AGS рака и КУП-823 клетки (АТСС) выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), и 1% раствор пенициллина /стрептомицина (10 000 Ед /мл и 10 мг /мл, соответственно). АГС и клетки КУП-823 (1 × 10 ^{5), высевали в 24-луночные культуральные планшеты. После 24 часов культивирования клетки АГС, КУП-823 были трансфицированы Липофектамином 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с 0,8 мг каждого построенного вектора, либо с аллеля Т или С-аллеля. Одновременно, 10 нг плазмиды PRL-TK (Promega) на лунку также трансфицировали в качестве внутреннего контроля для коррекции эффективности трансфекции. Перед этим, клетки высевали на 24-луночные планшеты в течение ночи, чтобы обеспечить 90% -95% сплошности во время трансфекции. Через двадцать четыре часа после трансфекции, активность люциферазы измеряли с помощью двойного люциферазы репортерной системы анализа (Promega, Madison, WI, USA) и выражается как отношение люциферазы светлячка к рениллы люциферазы деятельности. Все клетки были сделаны в трех экземплярах с тех же самых условиях. Трех независимых экспериментов с трансфекцией были выполнены, и каждый люциферазы анализ проводили в трех повторностях.}

электрофоретической подвижности сдвига Анализ (EMSA)
<р> 5'-биотинилированных олигонуклеотидов 25 пар оснований в длину, были получены из Пекин Genomics Institute (BGI). Oligo последовательности были rs7560488 [T] Форвард: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] Реверс: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Форвард: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] Reverse: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Для отжига, концентрированные комплементарных олигонуклеотида смешивали при массовом соотношении 1:01 молярном и инкубировали при 95 ° С в течение 5 мин, а затем постепенно уменьшается в течение часа, пока олигонуклеотиды не достигнет комнатной температуры. Отожженного олиго разводили до конечной концентрации 10 фмоль. Ядерные белки были выделены из клеток BGC-823 с использованием NE-PERTM ядра и цитоплазмы Extraction Реагенты (Pierce, Rock-брод, Иллинойс, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. LightShift Хемилюминесцентный EMSA комплект (Pierce /Thermo Fisher Scientific) использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. Если коротко, то реакции связывания проводили следующим образом: Ядерные экстракты (8 мкг белка) и буфера для связывания 1 × с 2,5% глицерина, 5 мМ MgCl2, 50 нг /мкл поли (ди-ПСТ), 0,05% NP-40, и 60 фмоль меченных биотином rs7560488 Т /rs7560488 C зонды инкубировали на льду в течение 30 мин в объеме 20 мкл. Для получения конкурентных исследований, ядерные экстракты инкубировали с немеченого олигонуклеотида в течение 30 мин перед добавлением меченого олигонуклеотида. Для supershift, AP-1-антитело добавляли (BOSTER, Китай). Комплексы были разделены с помощью электрофореза на родном 6% ПААГ в 0,5 × буфера TBE при 110 В. Гели были переданы Biodyne B предварительно нарезанных модифицированных нейлоновые мембраны (Pierce /Thermo Fisher Scientific) с использованием полусухого переноса ячейки Транс-блот SD ( Bio-Rad Laboratories). Мембраны сшитые (UVC-508 УФ-кросс-линкер, Ультра LUM) и сигнал был обнаружен с помощью хемилюминесцентной системы обнаружения (Pierce /Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Обнаружение DNMT3A1 Стенограммы количественными оТ-ПЦР (Q-PCR)
<р> для дальнейшего обнаружения корреляции между DNMT3A1 мРНК уровнями и rs7560488 полиморфизма, то 44 желудочные раковые ткани с различными генотипами были подвергнуты экстракции суммарной РНК с использованием тризола реагента ( Invitrogen, Inc.). Уровень DNMT3A1 мРНК измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени после обратной транскрипции на Prism 7900 Real-Time PCR машины (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-актин был использован в качестве внутреннего количественного контроля для каждого образца. Праймеры, используемые для амплификации DNMT3A1 были F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'и R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; праймеры для бета-актина были F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'и R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Относительное количественное определение мРНК DNMT3A1 рассчитывали с помощью метода 2-ΔΔCT, и каждый анализ был осуществлен в трех экземплярах.

Статистический анализ
<р> Все данные были проанализированы с помощью SPSS версия
13.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Пациенты и контроль сравнивали с использованием Стьюдента т
-test для непрерывных переменных и хи-квадрат (c2) тест для категориальных переменных. Частот аллелей и генотипов между контрольной и ГХ испытуемых были получены с использованием критерия хи-квадрат, и стандарт доброкачественность-оф-пригодный тест был использован для проверки равновесия Харди-Вайнберга. A значение менее 0,05 P
считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристики субъектов исследования
<р> Распределения частота случаев и контролей представлены в таблице 1, не было никаких существенных различий в распределении частот между случаями и контролем (р = 0,243 для возраста и р = 0,355 для секса). Среднее пациентов контрольной группы был 59,8 года (диапазон 20~93 лет) и 60,6 года (диапазон 25~90 лет), соответственно. Никаких существенных различий не было обнаружено в среднем возраст и пол, предполагая, что согласование на основе этих двух переменных была адекватной.

Кандидат tagSNP Выбор и генотипирование
<р> Среди кандидатов полиморфизмов в DNMT3A1 <бр>, мы сосредоточились на tagSNPs в промоторе DNMT3A1
и предсказал их потенциальную функцию связывания факторов транскрипции, которые влияют на качественное и количественное выражение DNMT3A1
. Мы применили LD на основе алгоритма выбора tagSNP (г 2≥0.80, MAF≥5%), в котором были определены два tagSNPs представляющих общую генетическую изменчивость в популяции ХГВ, в том числе кандидата tagSNPsrs7560488 и rs1550117, который является функциональным полиморфизмом, который изменяет восприимчивость к раку желудка мы подтвердили ранее [15], [16]. TFSEARCH алгоритм предсказал, что rs7560488 T создает сайт связывания для AP-1 (рис 1). Образцы для генотипирования по HRM и секвенирования по ABI 3730 автоматизированы секвенсор соответственно (рисунок 2)

TagSNP rs7560488 Вариант T >. C в DNMT3A1 Promoter Значительно увеличивает риск GC

распределений генотипов и аллеля rs7560488 частоты представлены в таблице 2. частоты генотипов в контроле были в согласии с моделью Харди-Вайнберга (P = 0,274). Как показано в таблице 2, частоты генотипов rs7560488 были 68,9%, 27,4% и 3,7% для TT, TC и CC генотипов среди случаев и 79,9%, 18,4% и 1,7% среди контрольной, соответственно, разница между случаями и контролем было статистически значимым (P ≪ 0,05). Кроме того, частота аллеля Т была значительно ниже среди случаев чем в контрольной группе (82,6% против 89,2%, p = 0,000). Кроме того, комбинированный частота генотипа ТС /СС была выше среди случаев, чем в контрольной (31,1% против 20,1%, p = 0,002). При приеме ТТ генотип и аллель Т в качестве эталона, мы обнаружили, что вариант генотипы (TC и CC) были связаны с повышенным риском GC (OR = 1.653, 95% CI = 1.194-2.287; P = 0,002). Кроме того, мы также наблюдали, что частоты аллеля C была статистически значимо выше, чем в контрольной группе (OR = 1.744, 95% CI = 1.310-2.321; P = 0,000). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что ТС и CC генотипы были связаны с генетической предрасположенностью к GC; кнопку Dnmt3a
1 rs7560488 T аллель может быть предполагаемый защитный аллель. Там не было никаких существенных различных частот rs7560488 в GC в возрасте > 60 лет в сравнении с ≤60 лет (P = 0,756), а мужчина по сравнению с женщиной (P = 0,459) (таблица 3)

Физические лица Меньше. 60 лет были более восприимчивыми к рака желудка с tagSNP rs7560488 Вариант T &° с
<р> Возраст и пол являются важными факторами в опухоли канцерогенеза, включая рак желудка. Когда анализы были стратифицированы по возрасту и полу пациентов, мы обнаружили, что значимая связь наблюдалась, люди, несущие TC /CC генотипы были связаны с генетической предрасположенности к GC как в мужской и женской группе. Таким образом, rs7560488 C аллеля была значительно увеличена фактором риска по сравнению с Т-аллель (таблица 4). Дальнейшее расслоение оценивали ассоциацию rs7560488 T &° С с раком желудка в разных возрастов. TC /CC генотипы были связаны с генетической предрасположенности к GC в возрасте ≤60 лет (OR = 1,794, 95% CI = 1.118-2.877; P = 0,015), кроме старше 60 лет, так же, мы также отметили, что в C частота аллели была статистически значимо выше, чем у контрольных (OR = 1.720, 95% CI = 1.127-2.622; P = 0,011). Эти результаты свидетельствуют о том, что ТС и CC генотипы были связаны с генетической предрасположенностью к GC, особенно у лиц, не более 60 лет (таблица 4)

The rs7560488 T > C. Вариант ЗАТРАГИВАЕТ DNMT3A1 транскрипционной активности
<р> Для того, чтобы оценить биологическую функциональную влияние rs7560488 полиморфизма на DNMT3A1 транскрипции, мы сконструировали репортер векторов люциферазы (pGL3), охватывающий базу в 4389823 до 4390770 от DNMT3A1
промотор, либо с дикого типа (аллеля Т) или мутантный тип (С аллель) и трансфицировали их в КУП-823, AGS клетки (рис 3А). Как показано на рис. 3B, мы обнаружили, что активность транскрипции аллеля Т была выше, чем C аллеля с примерно 2 раза в выше двух клеточных линий, предполагая, что rs7560488 аллеля Т работал в качестве защитника по поводу рака желудка за счет увеличения транскрипции DNMT3A1

The rs7560488 T >. C Вариант Аттенюирует фактора транскрипции Affinity
<р> с учетом tagSNP rs7560488 расположена в DNMT3A1
промоторной области; мы предположили, что это может изменить связывание фактора транскрипции (TF). Действительно, используя TF-алгоритм поиска (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html~~HEAD=dobj), мы прогнозировали, что rs7560488 T создает сайт связывания TF для AP-1. Для того, чтобы определить, имеет ли этот полиморфизм влияет на способность связывания фактора транскрипции, мы проводили электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) для анализа связывания олиго зондов, содержащих либо T или C аллель ядерных белков, выделенных из клетки AGS. Как показано на рис. 4A, специфическая сдвинуты ДНК /комплекс полоса ядерный белок был сгенерирован как С, так и Т-аллель зондов (рис. 4 A полосы 2, 5). Тем не менее, T аллель до сих пор не были полностью конкурентно ингибируется (рис. 4А полоса 4), хотя и смещенная полоса была отменена 50-кратных немеченых зондов С (рис. 4А дорожка 1), предполагая, что связывающая активность последовательности, содержащей rs7560488 T аллель был сильнее по сравнению с C аллеля и фактора транскрипции может предпочтительно связываться с аллеля Т, а не C аллеля. Кроме того, супер-EMSA с помощью AP-1 антитела не вызвало supershift биотина-меченным зондом /ядерный белок (рис. 4 Б полоса 2, 5), что указывает, что АР-1 может не фактор транскрипции, который связывается с областью промотора содержащий T или C аллель. Эти результаты показали, что rs7560488 C аллеля может уменьшить ядерный белок связывающей активности хотя воздействие не зависит от фактора транскрипции AP-1.

Ассоциация между DNMT3A1rs7560488 полиморфизма и выражение уровней DNMT3A1
мРНК
<р> Сорок четыре желудка раковые ткани с различными генотипами DNMT3A1 rs7560488 были доступны в нашем настоящем исследовании. Из-за низкой частоты генотипа СС, мы добавили его в образцах с ТС генотипа для анализа. Как показано на рис. 5, уровни экспрессии мРНК DNMT3A1 была ниже у пациентов с ТС или генотипа СС, чем у пациентов с генотипом TT (P &л; 0,05)

Обсуждение
<р> Генома гипометилирование и промотор гиперметилирование являются. отличительными чертами самых разнообразных видов рака, способствующих онкогенеза и метилирование ДНК играет ключевую роль в регуляции экспрессии генов и поддержание стабильности генома [21], [22]. метилирование ДНК осуществляется метилтрансферазам ДНК (ДНК-метилтрансфераз) DNMT1
, DNMT3b
и Dnmt3a
[23], [24]. De Novo
метилтрансферазами Dnmt3a
высоко экспрессируется во время раннего эмбрионального развития и понижающей регуляции в наиболее дифференцированных соматических клеток [25]. Роль Dnmt3a
в раковых заболеваний человека была подчеркнута сообщениями о Dnmt3a
мутаций приблизительно 20% пациентов с острой миелоидной лейкемии [26], [27]. Возникновение этих мутаций коррелировало с пониженной ферментативной активностью и геномных областей с пониженной метилирование. Dnmt3a
мутации были также выявлены у 8% пациентов с МДС [28]. Dnmt3a
также играет важную роль в эпигенетических глушителей гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) регуляторных генов и обеспечивая эффективную дифференциацию [29].
<Р> Dnmt3a
геномного локуса производит два транскриптов, порождающие двух белков, тем дольше DNMT3A1
и тем короче DNMT3A2
, которые отличаются тем, что 219-амино-кислоты амино (N) терминальный хвост присутствует только в DNMT3A1
[30], [31]. N-концевой домен DNMT3A1
называется "регулирующий" домен, поскольку он не обладает ферментативной активностью ДНК метилтрансферазы. Этот домен не разделяет значительной гомологии с любым другим известным белком. DNMT3A1
сосредоточена в гетерохроматина, который считается транскрипционно молчащий, и функционирует в первую очередь как транскрипционный репрессии [30]. Но другие исследования показали, что DNMT3A1
был эффективно набраны к глушителем Oct3 /4 и активированного витронектина (ВТН) промоторы генов посредством своего уникального N-концевого домена [32].
<Р> Сообщалось что генетические вариации в Dnmt3a
гена способствуют канцерогенеза, особенно связанного с GC [15], [33] - [36]. Затем предлагается дальнейшее изучение взаимосвязи между ОНП и трансляционной регуляции своих генов-мишеней. Но, констатируя биологическую функцию для каждого SNP часто требует много времени, эксперименты молекулярной биологии. Таким образом, анализируя большое количество ОНП, связанных с какой-либо конкретной локуса на практике требует систематической оценки биоинформатики и приоритизации, чтобы сузить множество возможных вариантов функциональных кандидатов. Поскольку большая часть ОНП в LD, гаплотип на основе исследования ассоциации считаются более мощным, чем одного анализа SNP для выявления причинно-следственных генетических вариантов, лежащих в основе этиологии сложных заболеваний, таких как рак [37], кроме того, использование tagSNPs, что захват большая часть гаплотипического разнообразия в исследованиях ассоциации было предложено [38]. Хотя GWAS принесло многочисленные SNPs или tagSNPs в значительной степени связано с раком, большинство tagSNPs найдены в небелковых кодирующих областей (межгенная и интронов области), определение их функциональных и /или причинные варианты имеет важное ограничение интерпретации данных GWAS несмотря на назначая предполагаемую функциональность многих других GWAS tagSNPs только был успешным, когда прекрасное отображение вокруг известной области риска была выполнена [39] - [41].
<р> В настоящем исследовании мы выбрали предположительные функциональные rs7560488 tagSNP которые могут представляют собой ОНП из самых DNMT3A1
промотор с высокой неравновесия по сцеплению, можно определить генетические вариации без генотипирования каждый SNP в DNMT3A1
промоторной области и повышения эффективности объединения. Мы наблюдали, что субъекты, несущие tagSNP rs7560488 ТТ генотипы выставлялись значительно снижается риск развития рака желудка по сравнению с лицами с ТС или CC генотипа, указывая, что аллель Т представляет собой защитный эффект потенциально выставлены этим tagSNP. Кроме того, анализы, проведенные нами предоставили дополнительные свидетельства, показывающие, что TC и CC генотип, связанный со снижением уровня экспрессии DNMT3A1
мРНК в желудочном раковых тканей, результаты позволяют предположить, что DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T > с полиморфизм может регулировать экспрессию DNMT3A1
и тем самым способствовать GC восприимчивости. Эти данные также показали, что DNMT3A1 могут играть определенную роль в прогрессировании рака желудка, но этот вывод должен быть подтвержден более крупном исследовании населения. Насколько нам известно, это первый отчет и показывает, что DNMT3A1
транскрипции напрямую зависит от функциональных tagSNP rs7560488 из DNMT3A1
область промотора и tagSNP rs7560488T &° С был связан со значительным увеличением риск GC. Далее мы провели эксперимент EMSA для анализа биологических последствий tagSNP rs7560488 полиморфизма в клетках BGC-823. Оба аллеля Т и аллели зонды C показал два гель-сдвиг полосы, но эксперименты показали, конкуренция аффинности связывания с ядерными белками по варианту аллель зонда T был больше, чем наблюдаемое с С аллелем зондом аналог. Таким образом, расширение ДНК-белок, способность аллеля Т связывания могут быть ответственны за увеличение DNMT3A1
промоторной активности, который мы наблюдали в наших промоторных анализах. Супер-EMSA эксперименте использовали AP-1 антитела не получили супер-гель сдвиг показали, что транскрипционные факторы AP-1 не может включать в формировании транскрипционных комплексов на rs7560488 сайте tagSNP. Другим новым результатом исходит от ассоциации между возрастом и rs7560488 T &° С полиморфизма в стратифицированной анализе подразумевалось, что менее чем за 60 лет были более восприимчивы к раку желудка с tagSNP rs7560488 T &° С. Вполне вероятно, что DNMT3A1
влияет на транскрипцию специфических генов, в особенности и изменения в некоторых генах увеличивают риск GC. Эти результаты также показывают, что более сильный фактор риска для GC является tagSNP rs7560488 T &° С, особенно в молодом возрасте
<р> Взятые вместе, это исследование дает первое механистической понимание того, как это новые функциональные tagSNP rs7560488 T &Гт. Вариант С в значительной степени связан с риском развития рака желудка в китайской популяции. Мы обнаружили, что T для изменения C существенно изменили транскрипционной активности DNMT3A1
гена с помощью влияния на связывание некоторых транскрипционных факторов и так, чтобы изменить уровень экспрессии DNMT3A1, хотя определенная транскрипционных факторов, еще предстоит установить. Наши результаты дают представление о том, что DNMT3A1
промотор rs7560488 T >. Вариации C является перспективным биомаркером для оценки населения восприимчивы к GC и предоставить ценную информацию к будущим исследованиям в желудочном патогенезе рака

Выражение признательности

Мы благодарим профессора Yaping Ван, доктор Zhenming Cai, Lili Цао (Нанкинский университет, Нанкин, Китай) и Zhenghao Чжан (юго-восток университет, Нанкин, Китай) для HRM генотипирования.

• PLoS ONE: Co-Поставка доксорубицина и SATB1 shRNA от термочувствительного магнитной катионных липосом для рака желудка…
• PLoS ONE: Клиническое и прогностическое значение HIF-1, PTEN, CD44v6 и сурвивина для рака желудка: мета-анализ