Stomach Health > Желудок Здоровье >  > Gastric Cancer > Рак желудка

PLoS ONE: микроРНК 135a Подавляет лимфоузла Метастазы через понижающую регуляцию Rock1 в раннем Желудочный Cancer

Абстрактный

микроРНК (микроРНК) играют критическую роль в прогрессии рака желудка и метастазирование. В данном исследовании изучали роль микроРНК-135а в раннем раке желудка (РГВ), включая лимфатические узлы (LN) метастазирования. Мы исследовали корреляцию между экспрессией микроРНК-135а и клинические исходы у 59 пациентов, перенесших операцию по поводу ГКЦ. Использование желудочных клеточных линий рака, мы провели функциональный и ген-мишень анализа. выражение микроРНК-135а подавлялась в 33,9% больных. Эти пациенты показали значительно более продвинутой стадии (TNM stage≥IB, 35,0% против 12,8%, р = 0,045) и более высокую скорость LN метастазирования (30,0% против 5,1%, p = 0,014), чем те, с повышающим регулирования микроРНК-135а выражение. В многомерном анализе, понижающей регуляции микроРНК-135а был независимым фактором риска для LN метастазирования (скорректированное отношение шансов 8,04, 95% доверительный интервал, 1.08-59.81; р = 0,042). Функциональные анализы с использованием желудочных линий раковых клеток показали, что микроРНК-135а подавлено жизнеспособность клеток, эпителиально-мезенхимальных перехода, инвазию клеток и миграции. ROCK1 был мишенью микроРНК-135а и его экспрессия была обратно пропорциональна тому, что из микроРНК-135а. экспрессия ROCK1 была значительно увеличена у пациентов с ГКЦ LN метастаз, чем у пациентов без Л.Н. метастазирования. Наши результаты подтверждают роль опухолевой супрессии в микроРНК-135а, а также продемонстрировать свою роль в Л.Н. метастаза в ГКЦ. микроРНК-135а и его ген-мишень ROCK1
могут быть новые терапевтические и прогностические цели для ГКЦ
<р> Образец цитирования:. Шин JY, Ким Ю.И., чо SJ, Lee MK, Чудак MC, Lee JH, и другие. (2014) микроРНК 135a Подавляет лимфоузла Метастазы через понижающую регуляцию Rock1 в раннем раке желудка. PLoS ONE 9 (1): e85205. DOI: 10.1371 /journal.pone.0085205
<р> Редактор: Масару Като, Национальный центр рака, Япония
<р> Поступило: 28 октября 2013; Принято: 23 ноября 2013 года; Опубликовано: 21 января 2014
<р> Copyright: © 2014 Шин и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование финансировалось за счет гранта 1110532-3 из Национального онкологического центра, Кореи. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:. HA является членом совета директоров ONE редакционной PLoS и это не меняет приверженность авторов для всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> рак желудка по-прежнему остается второй наиболее распространенной причиной смертности от рака во всем мире, несмотря на уменьшение заболеваемости и смертности в развитых странах [1 ].
<р> В районах, включая Корею и Японию, где скрининг рака желудка выполняется широко, раннее выявление часто возможно. Поскольку увеличение скорости раннего выявления рака желудка может привести к улучшению прогноза, интересы в улучшении качества жизни пациентов и с использованием минимально инвазивных методов лечения увеличились. У пациентов с раком желудка, лимфатический узел (LN) метастазирование является одним из наиболее важных прогностических факторов, и общая частота метастаз LN в начале рака желудка (EGC) находится в диапазоне от 5 до 20% [2] - [4].
<р> Гастрэктомия с Л.Н. рассечение рассматривается в качестве стандартного лечения рака желудка; Тем не менее, от 80 до 95% пациентов с ГКЦ не требуют рассечение LN, если рак желудка полностью вырезают менее инвазивных процедур, таких как эндоскопической резекции [5] - [7] или минимально инвазивной хирургии ( например
, простой клиновидная резекция или сторожевого LN навигационная хирургия) [8] - [10]. Несмотря на то, были проведены исследования биологических прогностические и прогностических маркеров для LN метастаза в ГКЦ, никакие прогностические инструменты не существуют для узловой метастаз ГКЦ на самом деле.
<Р> Некоторые исследования показали, что глубина вторжения, размер опухоли, и лимфатической инвазии связанная с LN метастаза в ГКЦ [4], [11]. Тем не менее, большинство из этих факторов были определены после окончательного патологического обследования тканей резецированных, что не является полезным при определении стратегии лечения.
<Р> MicroRNAs (миРНК) представляют собой небольшие небелковые РНК, кодирующие. Исследования доказали, что изменения в экспрессии микроРНК способствует патогенезу рака, включая те, желудочно-кишечного тракта происхождения [12] - [15].
<Р> микроРНК было также показано, чтобы быть полезным в дифференциации раковых и нормальных тканей [ ,,,0],16], [17]. Кроме того, микроРНК экспрессируются дифференцированно на каждой стадии рака желудка рак [18]. микроРНК-27 [19] и семейство микроРНК-200 ZEB1 Регулируют [20] показали, связаны со стадией эпителиальной-мезенхимальных перехода (EMT) при раке желудка. Таким образом, микроРНК может быть связано с процессом Л.Н. метастаза в EGC. Среди микроРНК, микроРНК-135а было показано, что опухоль подавляющие микроРНК, и его экспрессия подавляется в нескольких видов рака, включая рак почки [21] и лимфомы [22]. В свою очередь, избыточная экспрессия или восстановление микроРНК-135а стимулирует апоптоз и подавляет пролиферацию опухолевых клеток через свои гены-мишени с-Мус [21] и JAK2 [22], соответственно. В пробирке
исследования в, микроРНК-135а подавлено миграционные и инвазивные деятельность клеток рака желудка [23]. Тем не менее, опухоль подавляющие роль микроРНК-135а при раке желудка остается неясной.
<Р> Целью данного исследования было изучение корреляции между экспрессией микроРНК-135а и клинические исходы у больных ГКЦ, включая Л.Н. метастазирования.

материалы и методы

образцы человеческих тканей и клинические данные
<р> Пятьдесят девять взрослых пациентов с диагнозом ГКЦ в Национальном онкологическом центре, Корея, с января 2011 года по апрель 2013 года были включены в перспективно эта учеба. Эти пациенты были обработаны с открытой или лапароскопии при содействии гастрэктомии с D1 + или более LN рассечение. Степень Л.Н. рассечения следовала рекомендациям японской Желудочный ассоциации рака [24]. Этап после операции оценивали в соответствии с 7 е издание американского Объединенного комитета по системе TNM стадий рака [25]. Человеческие ткани, включая как рак желудка и совпадающим нормальных тканей от каждого пациента были немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С. Из обзора медицинских карт, клиникопатологическими характеристики, включая возраст, пол, хеликобактерной
статус, характеристики опухоли, стадия, и статус Л.Н. метастазирования были получены и проанализированы. Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов, и исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Национального онкологического центра, Корея (NCCNCS-11-445).

Культура клеток и трансфекция
<р> нормальная желудочная линия эпителиальных клеток человеческой HFE145 [26], [27] был подарком от д-ра Хасана Ashktorab и Дуэйн Т. Смут (университет Говарда, Вашингтон, США) и коммерчески доступных желудочных линий раковых клеток AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 и SNU719 были получены из Кореи клеточной линии банка (KCLB, Сеул, Корея). Все клеточные линии поддерживали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Среди желудочных линий раковых клеток, клеточных линий MKN28 и SNU668 были выбраны потому, что они редко выражают микроРНК-135а, и клеточные линии ККМ и KATOIII были выбраны потому, что они имеют существенное базовое выражение микроРНК-135а (фиг.1А). Трансфекция с микроРНК-135а мимике (Mirvana ™ микроРНК мимика, Ambion, Остин, штат Техас, США), ингибитор микроРНК-135а (ингибитор Mirvana ™ микроРНК, Амбион, Остин, штат Техас, США), и ROCK1 миРНК (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Сеул, Корея) в SNU668, YCC2, MKN28 и линии KATOIII клеток проводили с использованием липофектамин RNAiMAX и липофектамин 2000 реагентов (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. MKN28, SNU668, YCC2, и KATOIII клеточные линии собирали через два дня после трансфекции, а также различные анализы были выполнены.

Выделение РНК и микроРНК Количественное
<р> Общую РНК выделяли из 13 клеточных линий и 59 ткани больных раком желудка ", соответственно, с использованием TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Использовали TaqMan универсальная ПЦР реагенты Master Mix Kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan). Амплификация и обнаружение осуществляли с использованием системы 7900HT последовательности обнаружения (Applied Biosystems, Токио, Япония) с 40 циклов денатурации при 95 ° C (15 секунд) и отжига /продления при 60 ° C (60 секунд). Этому предшествовали обратной транскрипции при 50 ° С в течение 30 минут и денатурации при 95 ° С в течение 10 минут. Для количественной оценки зрелых микроРНК, TaqMan микроРНК Assays комплекты (Applied Biosystems, Токио, Япония) были использованы для обнаружения микроРНК-135а и управления микроРНК (RNU6B).

Вестерн-блот анализ
<р> белок экстрагируют из 13 клеточных линий и 59 образцов ткани пациентов ГКЦ "с помощью Рипа буфера (Biosesang, Сеул, Корея), включающий в себя ингибитор протеаз (Sigma, St. Louis, MO, USA) в соответствии с протоколом производителя. Затем Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-Rock1 и анти-β-актина (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) антитела. Сигналы были обнаружены с помощью простого набора ECL (GE Healthcare, Piscataway, Нью-Джерси, США) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Анализы клеточной пролиферации
<р> пролиферации клеток измеряли с использованием анализа МТТ. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (3 × 10 3 клеток на лунку) и трансфицировали с микроРНК-135а мимике после двух дней инкубации. Затем добавляли 200 мкл МТТ (0,5 мг /мл, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США) были добавлены в каждую лунку. После четырех часов дополнительной инкубации МТТ растворы отбрасывали 200 мкл ДМСО (Amresco, Солон, Огайо, США), были добавлены в каждую лунку, и планшет осторожно встряхивали. Оптическую плотность измеряли на считывателем ELISA (Moecular Devices, Саннивейл Калифорния, США) на испытательном стенде при длине волны 570 нм.

клеточного цикла анализа

Клетки высевали в 60π культуральные планшеты и трансфицировали микроРНК -135a подражает или микроРНК имитирует отрицательный контроль (мимики-NC). Эти клетки собирали путем обработки трипсином и фиксировали в 70% этаноле в течение не менее двух часов при -20 ° С. Клеточный осадок промывали холодным фосфатно-буферным солевым раствором и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PI /РНКазы окрашивающего буфера (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). После окрашивания образцы анализировали с помощью FACScan проточном цитометре (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) и 10000 событий были собраны на образец. Данные проточной цитометрии были проанализированы с использованием программного обеспечения Cell Quest (Becton Dickinson, Сан-Хосе, штат Калифорния, США).

миграции Транс-фильтр и инвазионные анализы
<р> Клетки трансфицировали микроРНК-135а мимики , ингибиторы микроРНК-135a, ROCK1 миРНК и ROCK1 миРНК отрицательный контроль (scRNA) в течение одного дня, а затем переносится в верхнюю палату Transwell пластины, покрытой 0,5 мг /мл коллагена типа I (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) и 1:15 разведение Матригель (BD Bioscience, Бедфорд, штат Массачусетс, США). Среду RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков (GIBCO BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США) добавляли в нижнюю камеру и планшет инкубация в течение 20 часов. Перенастройка и вторгшиеся клетки количественно с использованием гематоксилином и эозином.

люциферазы репортер конструкции плазмид
<р> дикого типа 3 'UTR из Rock1, содержащий сайты связывания микроРНК-135а, амплифицировали с использованием GDNA из SNU668 клетки в качестве шаблона. Коррелированной мутантные конструкции были созданы мутирует семенные участки сайтов связывания микроРНК-135. Оба дикого типа и мутантных 3 'UTR клонируют в ниже гена люциферазы в качестве контрольного вектора pGL3. Конструкции были проверены с помощью секвенирования.

люциферазы
<р> люциферазы анализы проводили в SNU668 и YCC2 клеток. SNU668 и YCC2 клетки трансфицировали каждой из плазмид (пустой вектор [ЯКОБЫ], ROCK1 3 'НТО дикого типа [WT], и Rock1 3'-UTR мутант [MUT], как сайт связывания микроРНК-135а) вместе с miRNA- 135a подражает, ингибиторы микроРНК-135a и отрицательной РНК контроль в 24-луночные планшеты. Через два дня после трансфекции клетки собирали и подвергали лизису. Люциферазы анализы проводили на лизатах с использованием набора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI, USA). Активность люциферазы нормализовали к бета-галактозидазы.

Иммуногистохимическое окрашивание
<р> Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание проводили в течение 20 типичных случаев из Rock1 низкой и высокой экспрессии групп. Антиген поиска было сделано с термической обработкой в ​​течение 30 мин при рН 8,0 Трис-ЭДТА буфере (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, США) при 95 ° С. Тканевые срезы инкубировали при 42 ° С в течение 30 мин с анти-Rock1 мАт (ab134181, клон EPR638Y, кроликом моноклональные, 1:5,000; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Отрицательные контроли одинаково используются с непривитых кроличьего IgG. Результаты были интерпретированы опытным патологоанатомом (MC Kook).

Статистический анализ
<р> Scale данные приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Хи-квадрат или точный критерий Фишера и критерий Манна-Уитни U были использованы для сравнения категориальные переменные и непрерывных переменных, соответственно. Коэффициент корреляции Пирсона был использован для сравнения паттерн экспрессии генов между микроРНК-135а и Rock1. Многомерная модель логистической регрессии была использована для определения независимых факторов, связанных с Л.Н. метастазирования. Ковариаты, которые были значительными использованием хи-квадрат или точный критерий Фишера ( P
&л; 0,05) были введены в модель логистической регрессии. Все данные были проанализированы с использованием STATA 12.1 (Stata Corp, Колледж Стейшн, штат Техас, США). A значение менее 0,05 P
считалось статистически значимым.

Результаты

уровни экспрессии микроРНК-135а связаны с прогрессированием и метастазированием LN в ГКЦ
<р> предыдущее исследование показало, что экспрессия микроРНК-135а подавляется в желудочном линиях раковых клеток [23]. Используя QRT-PCR, мы также обнаружили, что экспрессия микроРНК-135а подавляется в различных желудочных линии раковых клеток по сравнению с таковым в нормальной желудочной эпителиальной клеточной линии (Рис. 1А)
<р> Тем не менее, корреляция между выражение микроРНК-135а и клинические исходы при раке желудка не была исследована. Таким образом, мы измерили уровни экспрессии микроРНК-135а в первичном раке желудка и их соответствующие уровни в нормальных тканях от 59 пациентов с ГКЦ. Down- и повышающей регуляции генов в опухолевых тканях по отношению к нормальным тканям определяли как отношение опухоли к нормальным уровням экспрессии генов в ткани ≪ 1,0 и &Гт. 1,0 соответственно
<р> Обратно к результату из в пробирке
эксперимент, только 20 (33,9%) из 59 пациентов с ГКЦ выставлялись понижающая регуляция экспрессии микроРНК-135а. Тем не менее, эти пациенты значительно показали более продвинутой стадии (TNM stage≥IB, 35,0% против 12,8%, р = 0,045; отношение шансов сырой [OR], 2.11; 95% доверительный интервал [ДИ] 1.08-4.10) и А выше скорость LN метастазирования (30,0% против 5,1%, р = 0,014; сырой нефти или 2,73; 95% ДИ 1.50-4.98), чем те, с повышающей регуляции экспрессии микроРНК-135а (таблица S1). Чувствительность и специфичность статуса экспрессии микроРНК-135а для предсказания LN метастаза были 75,0% и 72,5%, соответственно. Кроме того, у пациентов с более продвинутой стадии (рис 1B) или LN метастаз (рис 1C) показали значительно более низкое отношение опухоли к нормальным уровням экспрессии микроРНК-135а, чем те, со стадией IA или без Л.Н. метастазирования. Многофакторный логистический регрессионный анализ также показал, что микроРНК-135а понижающая регуляция была независимо связана с LN метастазирования (ОШ 8,04; 95% ДИ, 1.08-59.81; р = 0,042; таблица 1). В совокупности эти данные позволяют предположить, что вниз регуляции экспрессии микроРНК-135а может быть связано с желудочным прогрессирования рака, включая Л.Н. метастазирования.

микроРНК-135а подавляет жизнеспособность клеток рака желудка, EMT, миграция и вторжение
<р> для дальнейшего изучения связи между микроРНК-135а и клинических исходов, мы провели функциональных анализов на жизнеспособность клеток, клеточного цикла, EMT, миграции и инвазии в желудочном линиях раковых клеток. Избыточная экспрессия микроРНК-135а по микроРНК-135а мимике значительно подавлена ​​жизнеспособность клеток (фиг.2А) и увеличивали субдиплоидных фракцию SNU668 клеток, клеточная линия, которая редко выражает микроРНК-135а (Фигура 2В), что указывает на повышенную апоптоз клеток рака желудка. Тем не менее, подавление микроРНК-135а ингибиторами микроРНК-135а индуцированных ни увеличение жизнеспособности клеток, ни субдиплоидных снижение доли в YCC2 клеток, клеточная линия, которая выражает существенную микроРНК-135а (рис 2А и 2В). Мы также исследовали связь между экспрессией микроРНК-135а и EMT в клетках рака желудка, потому что микроРНК-135а вниз регулирования был независимым фактором риска для LN метастазирования у больных ГКЦ (Таблица 1). Повышенная экспрессия микроРНК-135а был связан с подавлением EMT и показали увеличение экспрессии Е-кадгерина и подавление как N-кадгерина и слаге в SNU688 клетках. В противоположность этому, ингибирование экспрессии микроРНК-135а приводит к активации ЕМТ, включая подавление экспрессии Е-кадгерина и регуляцию обоих N-кадгерина и экспрессии Slug в YCC2 клетках (рис 2С). При оценке для функциональных последствий, избыточная экспрессия микроРНК-135а по микроРНК-135а мимики значительно подавляло миграции и инвазии способности SNU668 клеток рака желудка (рис 2D). С другой стороны, блокада микроРНК-135а ингибиторами микроРНК-135а значительно возросла миграция и вторжение YCC2 клеток рака желудка (рис 2E). В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-135а является регулятором опухоли подавляющий для желудка пролиферации и метастазирования рака.

ROCK1 является целевой ген микроРНК-135а в желудочном
рака <р> Чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе эффекты микроРНК-135а на клинические исходы, мы искали предполагаемые цели, используя базу данных TargetScan 6.2. Из 718 законсервированных мишеней, мы выбрали цели с наибольшим количеством очков которого вниз регулирование может привести к увеличению пролиферации раковых клеток, миграции и вторжения. Мы обнаружили, что ROCK1 может быть мишенью ген микроРНК-135а, так как ингибирование или подавление Rock1 Сообщалось, что стимулирует апоптоз и подавлять миграцию, инвазию и пролиферацию раковых клеток, в том числе рака желудка [28] - [30]. Анализ TargetScan показал, что последовательность 3'UTR из Rock1 имеет один возможный сайт связывания микроРНК-135а (рис 3А). Для того, чтобы подтвердить, является ли ROCK1 мишенью микроРНК-135а, пробирного люциферазы проводили. Люциферазы 3'UTR конструкции, описанные в разделе методы были котрансфицируют в SNU688 клеток с микроРНК-135а мимике и в YCC2 клетки с ингибиторами микроРНК-135а. Мы также построили Rock1 3'UTR MUT путем точечной мутации C → G в возможном месте связывания (рис 3А). Относительную активность люциферазы в Rock1 3'UTR WT была значительно увеличена в присутствии ингибиторов микроРНК-135а (фигура 3В). С другой стороны, эта активность существенно снижалась в присутствии микроРНК-135а имитаторов (рис 3C). В желудочных линиях раковых клеток, микроРНК-135а и ROCK1 показали противоположную картину экспрессии. Вестерн-блот-анализ показал, что экспрессия ROCK1 подавлялась в присутствии микроРНК-135а мимике, и повышающей регуляции в присутствии ингибиторов микроРНК-135а (на фиг.3D и 3Е). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что микроРНК-135а подавляет экспрессию Rock1 непосредственно ориентации его 3'UTR.

Анализ экспрессии Rock1 обратно пропорциональна тому, что из микроРНК-135а у больных с РГВ
<р> 59 пациентов с ГКЦ показали, что уровни экспрессии Rock1 имели значительно отрицательную корреляцию с интересами микроРНК-135а (R = -0.697, р &ЛТ; 0,001; рис 4А). Кроме того, у пациентов с повышающей регуляции экспрессии микроРНК-135а имели значительно более низкие уровни экспрессии белка Rock1, чем те, с понижающей регуляции микроРНК-135а (средняя опухоль нормального соотношения, 0,81 против 1,55, р &ЛТ; 0,001; фиг.4В) .

ROCK1 связан с Л.Н. метастаза в ГКЦ и участвует в желудочном миграции раковых клеток и инвазии, подавленной микроРНК-135а

Для дальнейшей оценки связи между экспрессией Rock1 и клинические исходы в ГКЦ, мы анализировали паттерны экспрессии Rock1 по отношению к статусу LN метастазирование включенных пациентов. У больных с метастазами в LN, имели значительно более высокую экспрессию белка Rock1, чем без LN метастазирования (средняя опухоль нормального соотношения, 1,86 vs. 0,93, р = 0,007; рис 5А). Кроме того, уровни ROCK1 IHC окрашивания были аналогичны экспрессии Rock1 в Вестерн-блот-анализа ( т.е.
, пациенты без LN метастазирования были слабые IHC окрашивания моделей [Рисунок 5B], но те, с Л.Н. метастазирования имели сильный положительный IHC окрашивания [Рисунок 5C]).
<р> Наконец, чтобы исследовать вопрос о том, что подавленные миграции и инвазии способности, возлагаемые на микроРНК-135а до регуляции, наблюдаемой в желудочном линиях раковых клеток были результатом Rock1 до регулирования, мы выполнили миграцию и инвазионные анализы с использованием желудочных линий раковых клеток, трансфицированных специфической Rock1 миРНК. ROCK1 миРНК подавлено миграционные и инвазивные деятельность в SNU668 клетках (рис 5D). В клетках YCC2 котрансфицируют с ингибиторами микроРНК-135а и Rock1 миРНК (Рисунок 5E), миграции и инвазии анализы показали, что ингибирование Rock1 по миРНК значительно ослабляется усиливающее миграционными и инвазивными эффекты микроРНК-135а понижающей регуляции ингибиторами микроРНК-135а (Рисунок 5F).
<р> Итак, эти результаты свидетельствуют о том, что ROCK1 ассоциируется с Л.Н. метастазирования у больных EGC, и что это является следствием повышенной экспрессии Rock1 в контексте микроРНК-135а понижающую регуляцию. Поэтому ROCK1 могут быть вовлечены в микроРНК-135а-подавленной желудка метастазирование рака.

Обсуждение
<р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что микроРНК-135а была опухоль подавляющие роль в рак желудка. У пациентов с ГКЦ, понижающей регуляции микроРНК-135а был независимым фактором риска для LN метастазирования. В раковых клетках желудка, повышающей регуляции микроРНК-135а подавлено желудка канцерогенеза путем подавления пролиферации клеток, EMT и метастазирования. Кроме того, мы также определили новый целевой ген микроРНК-135а, Rock1, которая была связана с Л.Н. метастазирования при раке желудка.
<Р> У пациентов с ГКЦ, оценка Л.Н. метастаза до начала лечения является важным шагом в определении стратегий лечения. Менее инвазивные методы лечения, такие как эндоскопической резекции [5] - [7] или сторожевого LN навигационная хирургия [9], [10] может быть возможно у больных ГКЦ без Л.Н. метастазирования. Эти подходы к лечению улучшили качество жизни пациентов в отношении поздних осложнений, связанных со стандартными хирургическими процедурами включая демпинг-синдрома, потеря веса, и симптомы рефлюкса, связанные с [31]. Таким образом, более специфические и чувствительные биомаркеры необходимы для прогнозирования состояния Л.Н. метастазирования у пациентов с ГКЦ. В настоящем исследовании, микроРНК-135a понижающего регулирования был независимым фактором для LN метастазирования, и значение прогнозирования состояния экспрессии микроРНК-135а был относительно высоким с чувствительностью 75% и специфичностью 73%. Хотя дальнейшие исследования по валидации необходимы, эти результаты показали, что измерение уровней микроРНК-135а до определения плана лечения пациентов с ГКЦ может быть полезным тест для прогнозирования состояния LN.
<Р> Интересно, что было сообщено микроРНК-135а быть подавляющими опухоли и онкогенными. Сверхэкспрессия микроРНК-135а был связан с подавлением пролиферации опухоли и роста почечной клеточной карциномы [21] и с увеличением апоптоза и улучшение выживаемости без признаков заболевания в лимфомы [22]. В противоположность этому, микроРНК-135а был вовлечен в колоректального рака прогрессии [32] и увеличения масштабов миграции клеток молочной железы и инвазии [33]. В настоящем исследовании, микроРНК-135а было показано, что опухоль подавляющие микроРНК, что согласуется с результатами предыдущего исследования [23]. Специально, тем выше экспрессия микроРНК-135а подавлено несколько этапов желудочного канцерогенеза, включая пролиферацию, миграцию и вторжение. Кроме того, мы также обнаружили, что микроРНК-135а может подавить EMT, который сообщается ассоциироваться с инициированием многоступенчатого процесса канцерогенеза и продвижения метастазирования [34], [35]. До настоящего исследования, связь между микроРНК-135а и EMT не исследован, хотя предыдущие исследования показали, что микроРНК, такие как микроРНК-27 [19], семейство микроРНК-200 [20], микроРНК-7 [36] и микроРНК-1228 [37] Подавить ЕМТ через свои собственные гены-мишени при раке желудка. Взятые вместе, микроРНК-135а представляет собой опухоль, подавляющих микроРНК при раке желудка.
<Р> Предыдущее исследование анализа 353 желудка человека раковых тканей показал, что паттерны экспрессии микроРНК разнообразны и что некоторые микроРНК были связаны с прогрессированием и прогнозом в желудочном рак [14]. В исследовании, микроРНК-135а был классифицирован как онкогенных микроРНК при раке желудка на основании результатов анализов ДНК микрочипов. Тем не менее, в недавнем [23], и наше исследование, микроРНК-135а действовал как подавитель опухоли, несмотря на высокий уровень пациентов с микроРНК-135а регуляцию. Хотя многие пациенты (66%) имели повышающую регуляцию микроРНК-135а аналогично результатам предыдущего исследования [14], эти пациенты показали значительно менее продвинутой стадии, и более низкий уровень LN метастазирования. Кроме того, дополнительные в пробирке
исследования также показали, что более высокая экспрессия микроРНК-135а был связан с подавлением желудочного канцерогенеза. Эти результаты свидетельствуют о том, что паттерны экспрессии микроРНК могут отличаться от клинических исходов, и, следовательно, для того чтобы подтвердить точные роли конкретных микроРНК, необходимы дальнейшие исследования.
<Р> ROCK1 является членом Rho-ассоциированной серин /треонин семейства киназ, который функционирует в качестве центрального регулятора актина организации и динамики цитоскелета [23], [38]. ROCK1 имеет широкий спектр функций в онкогенеза включая миграцию, инвазию и метастазирование [28]. ROCK1 является объектом нескольких микроРНК в различных видов рака, включая микроРНК-584 в почечной клеточной карциномы [39], микроРНК-335 в нейробластомы [40], и микроРНК-146а при раке предстательной железы [41]. При раке желудка, ROCK1 был положительно коррелирует с Л.Н. метастазирования и TNM стадии [42], а также участвует в микроРНК-148а-индуцированного подавления желудочной миграции раковых клеток и инвазии [30]. Кроме того, ROCK1 ингибитор способствует апоптоз в раковых клетках желудка [29]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что ROCK1 является мишенью микроРНК-135а при раке желудка и его экспрессия положительно связана с Л.Н. метастазирования у больных ГКЦ. В пробирке
Эксперименты также показали, что ROCK1 участвует в моторику желудка раковых клеток и вторжения. Эти результаты свидетельствуют о том, что ROCK1 может быть новой терапевтической мишенью со способностью ингибировать желудочную метастазирования рака.
<Р> В заключение, мы идентифицировали микроРНК-135а в качестве нового прогностического биомаркера Л.Н. метастазирования у пациентов с ГКЦ и показал, что микроРНК-135а подавлено желудка канцерогенез ( т.е.
, пролиферация, EMT, и метастазирование в желудочном линиях раковых клеток) путем охвата Rock1. Хотя эти выводы требуют проверки в других независимых групп пациентов, они предполагают, что микроРНК-135а и его ген-мишень ROCK1 может быть новым биомаркером и терапевтической мишенью для рака желудка с метастазами в LN.

подтверждающей информации,
таблице S1 ,
клиникопатологическими характеристика больных с ранними стадиями рака желудка по экспрессии микроРНК статус-135a
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

Other Languages