PLoS ONE: ресвератрол подавляет рост рака желудка путем индуцирования фазы G1 арестовывать и старении в Sirt1-зависимых Manner

Абстрактный

ресвератрол, в природе соединения полифенолов, как сообщается, оказывает противоопухолевую активность, воздействуя разнообразные молекулярные мишени. В данном исследовании мы изучали эффекты и механизмы, лежащие в основе ресвератрола на рак желудка. Мы обнаружили, что ресвератрол ингибирует пролиферацию клеток рака желудка в зависимости от дозы образом. При концентрации 25 и 50 мкМ, ресвератрол ингибирует жизнеспособность клеток и снижение клоногенных потенциал в желудочных раковых клеток. Ресвератрол лечение арестован клеток рака желудка в фазе G1 и привело к старению вместо апоптоза. Регуляторы клеточного цикла и стареющих путей, в том числе циклин D1, циклин-зависимой киназы (CDK4 и 6), р21 и р16, были дизрегуляции обработкой ресвератрола. Ингибирующее действие ресвератрола на рак желудка были также проверены В естественных условиях
с использованием обнаженной модели мышей ксенотрансплантата. Ресвератрол (40 мг /кг /сут), оказываемое ингибирующей активностью по развитию рака желудка и значительно снижает фракции Ki67-положительных клеток в опухолевых образцах из голых мышей. После лечения ресвератрол, индукция старении и изменения в экспрессии регуляторов, участвующих в пути клеточного цикла и стареющих были аналогичны тем, что мы наблюдали в пробирке
. Тем не менее, истощение сиртуина (Сирт) 1 обратное описанные выше эффекты ресвератрола и в пробирке
и В естественных условиях
. Наши данные свидетельствуют о том, что ресвератрол подавляет рак желудка в Sirt1-зависимым образом и представить подробные доказательства возможности применения ресвератрола в желудочном профилактики и лечения рака
<р> Образец цитирования:. Ян Q, Ван B, Занг W, Ван X , Лю Z, W Li и др. (2013) ресвератрол подавляет рост рака желудка путем индуцирования G1 фазы Аресты и Старение в Sirt1-зависимым образом. PLoS ONE 8 (11): e70627. DOI: 10.1371 /journal.pone.0070627
<р> Редактор: Доминик Хейман, faculté де médecine де Нант, Франция
<р> Поступило: 20 марта 2013 года; Принято: 19 июня, 2013 года; Опубликовано: 21 ноября 2013
<р> Copyright: © 2013 Ян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81101869, 81100103, 81171536 и 81000868), Национальный программы фундаментальных исследований Китая (+973 программы, No. 2012CB911202) и Независимый инновационный фонд Шаньдун университета (2012TS108) .The спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что никакие конкурирующие интересы не существуют

Введение

рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных с смертности в мире. Согласно глобальной оценке, в общей сложности 989,600 новых случаев GC был поставлен диагноз и минимум 738,000 пациентов умерли от этой болезни в 2008 году, что составляет 10% от общего числа смертей от рака [1]. Хотя заболеваемость GC снижается во всем мире, она остается на высоком уровне в развивающихся странах, особенно в Китае [1], [2]. Предыдущие исследования выявили тесную связь между хроническим гастритом, вызванной хеликобактерной
инфекции и развитие GC [3]. Кроме того, хост-генетические, экологические, пищевые и другие факторы, которые были вовлечены в желудочном онкогенного процесса [1]. Как это все еще трудно сделать раннюю диагностику для GC, большинство пациентов диагностируется на поздних стадиях. Несмотря на улучшение обычных методов лечения для продвинутых GC, в том числе хирургии, химиотерапии и лучевой терапии, продолжительности и качества жизни пациентов с поздними стадиями GC-прежнему бедны [2], [4]. Таким образом, исследование новых профилактических препаратов или терапевтических целей GC является насущной необходимостью.
<Р> Потребление свежих фруктов и овощей способствует к снижению заболеваемости раком, в том числе GC [2], [5]. Клиническое применение также предполагают, что некоторые биологически активные пищевые молекулы обладают способностью ингибировать несколько шагов онкогенные [5] - [7]. Ресвератрол (Res, 3,5,4'-trihydroxystilbene) является естественным полифенольных соединение, которое присутствует в почти 70 видов растений, в том числе кожи красного винограда, арахис, ягоды и другие [6] - [8]. Res впервые было сообщено оказывать противоопухолевой активностью в 1997 году [8]. Более поздние отчеты показали, что Рез придает ингибирующее действие на несколько видов рака, таких как рак толстой кишки, рак молочной железы и лимфомы, и влияет на различные молекулярные мишени [9] - [11]. Sirtuin 1 (Sirt1), класс III никотинамид-аденин нуклеотид (НАД ^{+) - зависимой гистонов /белок деацетилаза, сообщается, что ключевую цель Res в нескольких моделях опухолей [9], [10]. Тем не менее, некоторые данные показывают противоположные результаты, предполагающие, что Res оказывает химиопротекторных эффект не зависит от Sirt1 [11]. Ингибирующее действие Res на GC и базовый механизм не очень хорошо изучены.
<Р> В настоящем исследовании мы показали, что Res ингибирует пролиферацию клеток GC в пробирке
. Лечение Res индуцированное остановку клеточного цикла в фазе G1 и привело к возникновению клеточного старения. Эти эффекты Res были возвращены истощением Sirt1. Ингибирующее SIRT1-зависимой активности Res на GC клетки были также проверены В естественных условиях
. Взятые вместе, наши результаты указывают на то, что Res оказывает тормозящее действие SIRT1 зависимой от GC и предлагает терапевтическую роль Res в GC.}

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> Все исследования на животных были одобрены Комитетом по этике Шаньдун школы медицины университета (№ 001 в 2011 году для утверждения животных по этике) путем и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания.

Клеточные линии, условия культивирования и Res Лечение <бр> <р> клеток человека GC линии AGS (полученные из клеток ресурсный центр, Шанхайский институт биохимии и клеточной биологии китайской академии наук), BGC-823 и SGC-7901 (приобретенного у китайского центра коллекции типовых культур, Ухань, Китай), были использованы в этом исследовании. Клетки культивировали в F12 (AGS), или RPMI 1640 (КУП-823 и СГК-7901), содержащей 10% FCS, 100 ед /мл пенициллина и 2 ммоль /л L-глутамина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <югу> 2. Высокая степень чистоты Рез был приобретен у фирмы Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США), растворяли в ДМСО и добавляли в культуральную среду в указанной концентрации. Все эксперименты проводились через 24 часа после того, как Res добавок, если не указано иное.

Малые РНК-интерференции Трансфекция
<р> Химически модифицированные малые интерферирующие РНК (миРНК) с таргетингом SIRT1 и контроля миРНК были приобретены у GenePharma (Shanghai , Китай). Последовательность Sirt1 миРНК был 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Клетки инкубировали в течение ночи, а затем трансфицировали миРНК с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Через сорок восемь часов после миРНК трансфекции клетки обрабатывали 50 мкМ Res в течение 24 ч до дальнейшего изучения.

Жизнеспособность клеток пробирного
<р> Пролиферацию оценивали с использованием клеточного титра 96 ® Водную одно решение Пролиферация клеток анализа (Promega, Madison, WI, USA). В кратком изложении, 2 × 10 3 клетки высевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение 24 часов. Через двадцать четыре часа спустя, 20 мкл МТС (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбокси-метоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) добавляли в каждую Что ж. После инкубации в течение 3 ч при 37 ° С, оптическую плотность при 490 нм регистрировали на Varioskan флэш многодисковой Reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле: относительная жизнеспособность ячейку формула = (среднее значение оптической плотности обработанной группы - среднее поглощение бланка) /(среднее поглощение из-под контроля группы- средней поглощательной заготовки). Эксперименты были проведены в трех повторах и повторяли три раза.

Колонии Формирование анализа
<р> Клетки высевают в 6-луночные планшеты (300 или 500 клеток на лунку) и инкубировали в течение 10 дней, пока колонии не были достаточно большой, чтобы быть четко различить. Клетки фиксировали метанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым, и число колоний с более чем 50 клеток подсчитывали вручную. Эксперименты проводили в трех повторах и повторяли три раза.

клеточного цикла Анализ
<р> Клетки собирали, фиксировали предварительно охлажденным 70% -ным этанолом при температуре 4 ° С в течение ночи, а затем окрашивали пропидийиодидом (Beyotime , Цзянсу, Китай), содержащий РНКазы А при 37 ° с в течение 30 мин в темноте. Распределение клеточного цикла определяли с использованием проточного цитометра (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США), и данные были проанализированы с помощью программного обеспечения многотактной (Flow Systems Феникс, Сан-Диего, Калифорния, США). Эксперименты проводились независимо друг от друга три раза.

Апоптоз Анализ
<р> Обнаружение и Количественное апоптоза были выполнены мечения разрывов ДНК с использованием In Situ Cell Death Detection Kit, TMR красный (Roche Applied Science, Базель, Швейцария). Клетки или парафиновые сечения ксенотрансплантатов метили TUNEL в соответствии с инструкциями изготовителя. Для клеток, лечение с 0,2 мМ Н <суб> 2О <суб> 2 в течение 12 ч служил в качестве положительного контроля. Для парафиновых срезах, положительные контроли были приобретены у фирмы Millipore (Биллерика, Массачусетс, США). Ядра были контрастно с DAPI (Beyotime) и слайды или секции были обследованы с помощью флуоресцентной микроскопии (Olympus, Токио, Япония) с использованием программного обеспечения cellSens измерение. Эксперименты проводились независимо друг от друга три раза.

β-галактозидазы Окрашивание
<р> Старение оценивали с помощью старении -галактозидазы Окрашивание Kit (Beyotime). В кратком изложении, клетки или замороженные срезы ксенотрансплантатов фиксировались, а затем инкубировали со свежеприготовленным -галактозидазы (β-Gal) окрашивание раствора при 37 ° С в течение ночи. Эксперименты проводились независимо друг от друга три раза.

Стабильные Lentiviral-короткая шпилька РНК (shRNA) GC клетки
<р> Lentiviral векторы, содержащие контроль или Sirt1 shRNA были построены GenePharma и использовали для трансфекции клеток BGC-823. Эффективное нокдаун Sirt1 была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга. Для стабильной трансдукции, контрольно-лентивирусов-инфицированных или Sirt1 shRNA-лентивирусов инфицированных BGC-823 клетки культивировали в полной среде, поставляемой с 2 ​​мкг /мл пуромицин в течение четырех недель, и рассматривается как LV-C и LV-S, соответственно.

безволосых мышей модели ксенотрансплантата
<р> Женский бестимусных Balb /C голых мышей (6~8 недель) были приобретены из Пекинского университета (Пекин, Китай) и поддерживали при определенных патогена условиях на ключ Лаборатория ремоделирования сердечно-сосудистой и исследовательской функции, Qilu больницы, Шаньдун университет. Мыши были случайным образом разделены на четыре группы (по 8 мышей в каждой группе): группа I и, КУП-823 клетки II (1 × 10 ^{6 клеток на инъекции в 0,1 мл PBS) вводили подкожно в бок области из голых мышей; группа III, вводили LV-C (BGC-823 клеток); и группа IV, LV-S (КУП-823 клеток) вводили. После имплантации голых мышей из групп II, III и IV обрабатывают Res (40 мг кг -1 в 0,1 мл растительного масла, администрируемых через желудочный зонд один раз в день). Подкожный размер опухоли измеряли с суппортом, и объем опухоли рассчитывали по формуле (длина) × (ширина 2) /2. Мышей умерщвляли через четыре недели спустя. Опухоли собирали и обрабатывали для Вестерн-блот и иммунологических исследований.}

Real Time-количественной ПЦР (RT-КПЦР)
<р> Общую РНК в клетках был выделен с использованием TRIzol реагента (Invitrogen) и преобразуется в кДНК с использованием набора реагентов PrimeScript ™ RT (Takara, Токио, Япония). RT-КПЦР проводили для генов, в том числе циклин D1, циклин-зависимой киназы 4 (CDK4), p21 и бета-актина, как описано ранее [12]. Последовательности праймеров для амплификации приведены в таблице S1. Экспрессии мРНК циклин D1, CDK4 и p21 нормализовали к бета-актина относительно управления с помощью -ΔΔCt метод 2. Каждый эксперимент повторяли в трех повторностях.

вестерн-блот
<р> Общий белок из клеток или образцов опухоли экстрагировали RIPA лизирующий буфер (Beyotime), как описано [12]. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Мембрану зондировали антителами против Sirt1 (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США), Bcl-2, Вах, каспазы-3, циклин D1, CDK4 и 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), р16 и р21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Вторичное антитело было использовано с пероксидазой хрена (HRP) анти-кроличий или мышиного антитела. Белковые полосы визуализировали, используя систему ECL (Pierce). β-актина (Cell Signaling) служил в качестве контроля загрузки.

Immunohistochemistry
<р> Опухолевые образцы из голых мышей депарафинировали, регидратации и антиген извлекается. Срезы инкубировали с антителом против Ki67 (1:500, Abcam) в течение ночи при 4 ° С. HRP-конъюгированного IgG анти-кролик и окрашивание ДАБ были использованы для визуализации антитела Ki67. Слайды были, наконец, контрастному окрашиванию гематоксилином. Слайды были обследованы с помощью светового микроскопа Olympus (Токио, Япония) с использованием программного обеспечения cellSens измерение. В Ki67-положительные клетки подсчитывали вручную, так и процент Ki67-позитивных клеток были оценены на полях. Пять отдельных полей были подсчитаны для каждой секции.

Статистический анализ
<р> Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием статистического пакета для социальных наук (SPSS, версия 16.0, Чикаго, Иллинойс, США) с помощью однонаправленной ANOVA с ретроспективном тесте Тьюки. Значения Р менее 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Res Угнетает Жизнеспособность GC клеток в Sirt1-зависимым образом
<р> Три клеточные линии GC (AGS, КУП-823 и SGC-7901) были исследованы в наших экспериментах. Культивирования клеток в транспортном средстве (0,1% ДМСО) не влияет на жизнеспособность клеток (данные не показаны). Тем не менее, при обработке различными концентрациями Res в течение 24 ч, пролиферации клеток была дозозависимо ингибирует на 25, 50, 100 и 200 мкМ Res (Фигура 1А). Следует отметить, что распространение AGS явно тормозится при обработке 10 мкМ Res, чего не наблюдалось в двух других линий клеток (Фигура 1А). Во всех трех клеточных линий, присутствие 100 мкМ Res было достаточно, чтобы вызвать более чем 50% -ное ингибирование роста (56,78% для AGS, 54,87% для BGC-823 и 52.16% для СГК-7901, соответственно). Таким образом, 25 и 50 мкМ Рез использовались для последующих экспериментов. Для определения функциональной роли Sirt1 в лечении Res, мы сбиты выражение Sirt1 с использованием конкретного миРНК. Эффективное ингибирование экспрессии Sirt1 подтверждали Вестерн-блоттинга (Фиг.1В). Результаты анализа показали, что МТС в Sirt1-истощенных клетках, Рез не ингибирует пролиферацию клеток (рис 1C). Эти данные указывают на то, что Res способен ингибировать пролиферацию клеток GC и что тормозящее воздействие может быть спасен истощением Sirt1.

Res Уменьшается клоногенные Потенциал GC клеток в Sirt1-зависимым образом
<р> для опухолевых клеток, образование колоний было установлено, чтобы быть более чувствительным параметром, чем жизнеспособность для оценки эффекта лекарственного средства. Таким образом, усилия были затем проведены для определения влияния Res на клоногенного потенциала GC клеток. Рез, в концентрации 25 мкМ, привело к значительному сокращению в очагах чисел, а также размеров в GC клетки. После обработки 50 мкМ Res, то клоногенному потенциал уменьшается дальше. Однако нокдаун Sirt1 до начала лечения Res увеличилось число очагов до уровня, сопоставимого с группой транспортных средств (рисунок 2).

Res Индуцирует накопление GC клеток в G1 фазе в Sirt1-зависимым способом
<р> Чтобы исследовать ингибирующее действие Res на GC клеток, мы провели анализ клеточного цикла. Мы наблюдали, что 25 и 50 мкМ Res привело к увеличению доли клеток в фазе G1 в обоих BGC-823 и SGC-7901 клеток (Фигуры 3A и 3B). Индукция G1 фазы задержания Res также зависит от дозы. Рез при концентрации 50 мкМ показали более сильный эффект, чем это было при 25 мкМ. Увеличение числа клеток в G1 фазе сопровождалось уменьшением популяции клеток, главным образом, в фазах S. Истощение Sirt1 до лечения Res уменьшило G1 фазы индукции Res (Фигуры 3A и 3B). Для подтверждения вышеуказанных результатов, мы исследовали экспрессию регуляторов клеточного цикла G1 фазы, в том числе циклин D1, CDK4, CDK6, р21 и р16 в клетках КУП-823. Как показано на фиг.3С, в Res обработанных BGC-823 клетки, уровни белка активаторов G1 /перехода S (циклин D1, CDK4 и CDK6) уменьшилась, в то время как уровни белка ингибиторов CDKs (CDKIs) (р21 и p16) увеличился. В противоположность этому, эти изменения не найдены в Sirt1-истощенных клетках КУП-823, когда их обрабатывали 50 мкМ Res. Аналогичные результаты были получены с RT-QPCR циклина D1, CDK4 и p21 (рис 3D).
<Р> Отсутствие суб-G1 клеток показали, что лечение Рез не вызывали апоптоз в клетках GC (фиг.3А) , что согласуется с результатами экспериментов, обозначая TUNEL из клеток КУП-823 (рис S1a). Уровни протеина связанных с апоптозом молекул, таких как Bcl-2, Bax и каспазы-3, из каждой группы были сопоставимы (рис S1B). Взятые вместе, наши результаты показывают, что Res индуцирует G1 арест фазы в GC клетки в Sirt1-зависимым способом и не индуцирует апоптоз.

Res Индуцирует Старение GC клеток в Sirt1-зависимым образом
<р> в наших руках, Res приводит к остановке роста, а не увеличением апоптоза. Таким образом, мы сделали дальнейшие усилия по изучению, может ли Res индуцируют старении в GC клетки. бета-гал окрашивания, специфическим маркером для млекопитающих стареющих клеток, был использован. После обработки Res, мы обнаружили увеличенные фракции клеток окрашивали бета-гал. Тем не менее, предварительная обработка с Sirt1 миРНК блокировали Res-индуцированный клеточный старении (рисунок 4). Аналогичные результаты были получены как из BGC-823 и SGC-7901 клеток, что свидетельствует о Res иждивенцы на Sirt1 для индукции клеточного старения в клетках GC.

Res угнетает рост опухоли в естественных условиях в Sirt1-зависимым образом <бр>

Далее, дополнительные исследования были проведены, чтобы определить эффекты Res на КУП-823 роста ксенотрансплантатов у голых мышей. Для В естественных условиях
исследовании были использованы стабильные трансдуцированных клетки лентивирусов-shRNA BGC-823. Из четырех Sirt1 shRNA-лентивирусах, LV-1 и LV-4 оказывали очевидные эффекты Глушащий на Sirt1 выражении (рис S2). После четырех недель скрининга, экспрессия Sirt1 поддерживалась на пониженных уровней в стабильных клетках лентивирусов-shRNA BGC-823 (рис S2). Стабильные LV-1 лентивирусов-shRNA клетки BGC-823 были использованы в последующих исследованиях ксенотрансплантатов из-за сильных тормозящее действие на экспрессию Sirt1 по сравнению с РН-4. Все животные выжили к концу наших экспериментов, и никаких очевидных различий не было найдено в их веса тела (данные не показаны). Через четыре недели после имплантации, измерения объемов опухоли показал, что лечение Res значительно снизило рост BGC-823 ксенографтов (Res по сравнению с контролем: 0.5728 ± 0,2276 см ^{3 против 1.4288 ± 0,1741 см 3, P &л; 0,001) , Стабильная трансдукция управления shRNA-лентивирусов не оказывает существенного влияния на объем опухоли (Res против Res + Ci: 0.5728 ± 0,2276 см 3 против 0,68 ± 0,0672 см 3, P = 0,603). Тем не менее, в Sirt1-истощенных ксенографтов, ингибирующие эффекты Res на рост опухоли были спасены (Res + Si против Res + Ci: 1.2313 ± 0,1777 см 3 против 0,68 ± 0,0672 см 3, P &л; 0,001, Res + Si по сравнению с контролем: 1.2313 ± 0,1777 см 3 против 1,4288 ± 0,1741 см 3, P = 0,123) (рис 5А). В Res обработанных ксенотрансплантатов, маркер пролиферации, Ki67, значительно уменьшилось (рис 5B) (% от Ki67-позитивных клеток, Res по сравнению с контролем: 3 ± 1,8 против 44,67 ± 3,79, P &л; 0,001). Старение наблюдалась в ксенографтов от Res мышей, обработанных указанными β-Gal окрашивания (рис 5B). Тем не менее, не очевидно, апоптозом не индуцировали Res на ксенотрансплантаты (рис S1D) и не наблюдали никаких изменений в регуляторы апоптоза, таких как Bcl-2, Bax и каспазы-3 (рис S1C). Эти результаты согласуются с в пробирке
экспериментов. Более того, изменения в экспрессии регуляторов клеточного цикла, в том числе циклин D1, CDK4, CDK6, р21 и р16 были аналогичны тем, что мы наблюдали <ЕМ> в пробирке
(5С). Все изменения, наблюдаемые в Ki67, бета-Gal и регуляторов клеточного цикла были отменены Sirt1 обеднения (фиг 5В и С) (% от Ki67-позитивных клеток, Res + Si против Res + Ci: 46,32 ± 6,03 против 2,65 ± 1,53, P &л; 0,001, Res + Si по сравнению с контролем: 46,32 ± 6,03 против 44,67 ± 3,79, P = 0,946)}

Обсуждение
<р> Res, естественный полифенол, в настоящее время оценивается как перспективный противораковыми. агент. Несмотря на то, что было доказано, чтобы придать антипролиферативное действие против нескольких типов рака, как в культуре клеток и ксенотрансплантата модели [9] - [11], его химиопрофилактики воздействие на GC и основного механизма не были хорошо изучены. В этом исследовании мы показали, что Res ингибирует пролиферацию клеточных линий GC (AGS, КУП-823 и SGC-7901). Активность против роста наблюдалась после того, как клетки обрабатывали 25 мкМ Res в течение 24 ч, и ингибирующий эффект зависит от дозы. При концентрации 50 мкМ Res, ингибирование отношения для этих трех клеточных линий были 41%, 34% и 32% соответственно. Когда концентрация Res дополнительно увеличена, ингибирующие эффекты были усилены. Оба 100 и 200 мкМ Рез ингибирует рост более чем на 50% по сравнению с группой транспортного средства. Кроме того, чем выше доза Res слишком велика, чтобы достичь в естественных условиях
и таким образом не имеет никакого смысла в клинических условиях [13], [14]. Таким образом, были использованы два нижних эффективные концентрации 25 и 50 мкМ Res в последующих исследованиях. Активность ингибирования роста Res, как представляется, для соты, так как IC 50 различается в зависимости от типа клеток и варьирует от 27 мкм до 180 мкм [9], [10], [15], [16]. Некоторые из этих исследований также показали, что Res оказывает тормозящее эффекты в зависимости от времени [15], [16]. Концентрация и продолжительность лечения Res, используемых в нашем исследовании были совместимы с большинством отчетов из других групп [8], [9], [16]. Для
естественных условиях исследования в метод введения мы использовали с принудительным кормлением, потому что это метод, который обычно используется в мышах в качестве альтернативы внутрибрюшинной инъекции [15], [17]. Кроме того, исследования на мышах показали, что Res поглощается эффективно после перорального приема и могут быть найдены по всему телу [17], [18]. При использовании В естественных условиях
, Res значительно снижает пролиферацию клеток, характеризуется выражением Ki67, что согласуется с результатами наших
пробирке экспериментов в области.

Res может замедлить пролиферацию раковых клеток с помощью различных механизмов, среди которых, регуляции клеточного цикла является важным [9], [15], [19]. Наш в пробирке
данные показали, что лечение GC клеток с Res индуцирует G1 арест фазы. Фазы G1 является первой из четырех фаз клеточного цикла, который имеет место в эукариотической делении клеток. G1 является особенно важной фазе клеточного цикла, так как это точка, в которой клетка совершает в раунде деления. Прогрессирование через G1 фазы требует формирования и действия циклин D-CDK4 или -CDK6 комплексов. Эти комплексы затем фосфорилируют ретинобластома, что приводит к освобождению факторами транскрипции E2F и вниз по течению транскрипции генов, участвующих в прогрессии фазы S. Деятельность циклин D-CDK комплексов регулируются вверх по течению ингибиторов, включая членов ИНК (p15, p16 и p18) и CIP семей (p21, p27 и p57) [20], [21]. Вдоль той же линии, сопровождающегося фазы G1 арестом, мы наблюдали понижающей регуляции циклин D1, CDK4 и CDK6 и повышающая регуляция р21 и р16 в Res обработанных GC клеток. Наш В естественных условиях
результаты уровней экспрессии этих регуляторов клеточного цикла в опухолевых образцах согласуются с в пробирке
результаты. Наши результаты также согласуются с результатами предыдущих исследований [15], хотя некоторые другие сообщили, что фаза S арест индуцируется Res [9], [19]. Постоянство остановки роста может привести к апоптозу или старении в клетках. Поскольку оба р21 и р16 сигнальные пути участвуют в прогрессии увядания, опосредованной различными видами стресса [22], [23], мы провели бета-гал окрашивания. Лечение Рез значительно повышало частоту стареющих GC клеток в зависимости от дозы образом. Программа клеточное старение представляет собой важный барьер против инициации рака и развития [24], [25]. Хотя предыдущие исследования показывают, что, через ослабление окислительного стресса и улучшению обмена веществ, Res оказывает омолаживающие эффекты и в пробирке
и В естественных условиях
[26] - [28], противоположные эффекты, как было показано при раке. Res было установлено, индуцируют ингибирование роста стареющих как в нескольких типах рака [29], [30]. Двойная роль Res в клеточном старении, замедляющие старение в нормальных тканях и ускоряет старение в опухолях, делает его идеальным кандидатом для профилактики и лечения рака.
<Р> Апоптоз является еще один общий эффект, который, как правило, наблюдается в Res лечение раковые клетки [9], [11], [15], [16]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что апоптоз может быть опосредован несколькими различными путями и многочисленных регуляторных молекул. Среди этих регуляторов, белки, содержащие семейства Bcl-2, имеют важное значение. Есть оба антиапоптические белки (Bcl-2, Bcl-XL) и про-апоптотических белков (Вах, плохо, BAK и BCL-хз) в этой семье. Увеличение Bcl-2, соотношение проапоптотического Bax /антиапоптической повышает проницаемость митохондриальной мембраны, вызывает высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитозоль и, в свою очередь, приводит к активации каспазы-9 и вниз по течению целевой каспазы-3 [31]. Несмотря на эту митохондриального пути активации апоптоза, про-апоптотических лиганды, такие как FasL, путем связывания с их рецепторами, вызывает активацию каспазы-8 и ниже по течению эффекторов, таких как каспазы-3. Активация эффекторных каспаз вызывает расщепление многих клеточных субстратов и непосредственно вызывает апоптоз [31] - [33]. Несмотря на многочисленные предыдущие доклады показали, что апоптоз был ответственен за Рез-индуцированного ингибирования роста, мы не наблюдали очевидного апоптозу в Res обработанных GC клеток. Это отсутствие апоптоза может быть связано с концентрацией и длительности лечения Res адаптированной в нашем эксперименте, потому что исследования разных групп показывают, что Res оказывает дозировочно и продолжительность-зависимых эффектов [34], [35]. Кроме того, как эффекты Res также специфичное соте [36] - [38], ГХ клетки, используемые в нашем исследовании, могут быть стойкими к Рез-индуцированного апоптоза
<р> Res имеет несколько целей. среди которых, класса III NAD ^{+ - зависимой деацетилаза Sirt1 является наиболее часто изучены. Хотя биохимические исследования показали, что Res не был прямым активатором Sirt1 [39], Res до сих пор рассматривается как классический агонист Sirt1. Многочисленные исследования показывают, что Res оказывает различные эффекты в различных моделей в Sirt1-зависимым способом [40], [41]. В нашем эксперименте, Sirt1-Истощение обратное торможение роста Res и в пробирке
и В естественных условиях
. Фаза G1 арест и Старение, индуцированное обработкой Res были спасены Sirt1-истощения. Эти результаты указывают на то, что ингибирование эффекты Res на GC зависят от Sirt1. В соответствии с предыдущими исследованиями, Sirt1 может регулировать экспрессию генов посредством двух различных механизмов. Во-первых, непосредственно, Sirt1 непосредственно опосредует дезацетилирования белка, а затем усиливает его убиквитинирование и последующая деградация убиквитин протеасом [42]. Во-вторых, косвенно, Sirt1 оказывает дезацетилазы деятельность, влияющую на подтверждение хроматина или налагая гнет деятельность факторов транскрипции, а затем регулирует транскрипцию генов [43] - [45]. В качестве молекул (циклин D1, CDK4, CDK6, р21 и р16), обнаруженное в наших экспериментах, не были представлены как прямых мишеней Sirt1, мы предположили, что, возможно, Sirt1 регулировать экспрессию этих генов в основном за счет косвенного механизма. Результаты RT-QPCR также подтверждают эту гипотезу.
<Р> Взятые вместе, наши результаты показывают, что Res ингибирует как пролиферацию клеток GC в пробирке
и рост ксенотрансплантатов в естественных условиях
. Лечение Res индуцирует G1 арест фазы в GC клетки и приводит к старению вместо апоптоза. Sirt1-истощение спасает описанные выше эффекты Res и в пробирке
и в естественных условиях
. Наша работа показывает, что Res ингибирует GC в Sirt1-зависимым способом и предоставляет подробные доказательства возможности применения Res в предотвращении GC и терапии.}

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Res не оказывает никакого влияния на апоптоз клеток BGC-823. (A) Апоптоз обозначено маркировкой TUNEL (красный) и клеток BGC-823 были контрастно с DAPI (синий). Лечение с помощью H <суб> 2O <подразделам> 2 служил в качестве положительного контроля. Оригинальное увеличение: × 200. Шкала баров, 50 мкм. (B) регуляторы апоптоза в КУП-823 клеток, в том числе Bcl-2, Bax и каспазы-3 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. (C) Регуляторы апоптоза на ксенотрансплантаты, включая Bcl-2, Bax и каспазы-3 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Для обнаружения расщепленной каспазы-3, клетки BGC-823 обрабатывают H <> 2O к югу <югу> 2 служил в качестве положительного контроля (как показано на правой панели). (D) Апоптоз в ксенографтов была обнаружена TUNEL маркировки (красный) и секции были контрастно с DAPI (синий). Секции из женских грызунах молочной железы получают 3~5 после отъема крысят (Millipore) служил в качестве положительного контроля. Оригинальное увеличение: × 200. Шкала баров, 50 мкм. 'R' представляет ресвератрол, 'Ci' представляет собой контроль миРНК, а 'Si' представляет собой Sirt1 миРНК
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF) Рисунок S2
.
Нокдаун Sirt1 по shRNA-лентивирусов. Клетки (А) КУП-823 трансфицировали с контролем или Sirt1-специфических shRNA-лентивирусов. Эффективность трансфекции оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа. При множественности инфекции (MOI) 50, более чем 90% клеток были трансфицированы shRNA-лентивирусов. После четырех недель скрининга с пуромицин, все живые клетки были трансдуцированных. Увеличение: × 100, бар для 200 мкм. (В) Клетки собирали через 4 дня после инфицирования и через 28 дней после того, как пуромицин скрининга. Эффективность глушение Sirt1 была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF)
таблице S1.
Грунтовки для экспериментов RT-КПЦР, выполненных в данном исследовании
DOI: 10.1371. /journal.pone.0070627.s003
(DOC)

• PLoS ONE: Rhoe Способствует метастаза рака желудка через механизм зависимых от усиления экспрессии CXCR4
• PLoS ONE: микофенолокислота Тормозит Миграция и Вторжение клеток рака желудка через несколько молекулярных путе…