Финансирование:. Это исследование была частично поддержана Министерством образования, науки, спорта и культуры Японии и грантов-в-помощь для молодых ученых (B), № 20790286 (http://www.mext.go.jp), и исследовательский фонд на усмотрении президента, Оита университет (http://www.oita-u.ac.jp/english/index.html). Никакого дополнительного внешнего финансирования не было получено для данного исследования. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка остается одним из самых смертельных болезней, несмотря на постоянно тенденцию к снижению по всему миру. В целом, смертность от рака желудка оценивается в 700000 случаев ежегодно (10,4% от всех случаев смерти, связанных с раком), занимая 2-е место только после рака легких [1]. Клинический результат лучше, когда опухолевые клетки ограничиваются слизистой оболочкой. Тем не менее, как только опухолевые клетки проходят через мышечный слизистой оболочки, клинический результат становится хуже, так как риск метастазов в лимфатических узлах, который является одним из наиболее важных прогностических факторов при раке желудка, значительно возрастает до 18% или более, по сравнению с менее чем на 4%, когда опухолевые клетки остаются ограниченными в слизистой оболочке [2], [3]. Таким образом, более глубокое понимание механизмов, участвующих в процессе подслизистого вторжения требуется.
<Р> В настоящее время признано, что многоступенчатая накопление генетических аномалий отвечает за возникновение и прогрессирование различных видов рака [4]. На самом деле, сообщалось, что общее число геномных аберраций возрастает с увеличением опухолевой прогрессии в различных типах опухолей [5]. Мы также обнаружили, что частоты прибыли на 20Q, 20p12, 1q42, 3q27 и 13q34 и потерь при 4q34-qter, 4p15, 9p21, 16q22, 18q21 и 3p14, который часто присутствует при раке желудка, были более частыми в AGC, чем в ГКЦ [6]. В то же время, недавно было сообщено, что, в ходе прогрессии опухолей, одной клетки опухоли происхождения развивается в несколько генетически различных субпопуляций путем приобретения самых разнообразных геномных аберраций. Полученную массу опухоли, которая состоит из генетически разнородных субпопуляции, считается, чтобы стать устойчивым к различным давлением окружающей среды выбора [7], [8], [9], [10].
<Р> на основе массива сравнительная геномная гибридизация (CGH массив) предоставляет информацию о количестве копий геномных аберраций (СНА) через весь геном [11]. Кроме того, ГКГ также применимо к изучению внутриопухолевой геномной гетерогенности [12], [13], [14], [15]. Хотя несколько групп использовали массив CGH для идентификации областей укрывательство онкогенные или опухолевые подавляющих генов при раке желудка [6], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25], СНА, связанные с подслизистых вторжения и раннюю фазу узла метастаза лимфатический до сих пор не определены. Кроме того, так как большинство предыдущих исследований CNAS при раке желудка проанализировали только один образец для каждой опухоли, детали неоднородности геномных профилей в пределах одного рака желудка в основном остаются неясными.
<Р> В этом исследовании мы исследовали участие геномных CNAS в процессе вторжения подслизистой и метастазов в лимфатических узлах в ранних стадиях рака желудка. С этой целью мы собрали образцы опухолей от разных частей той же опухоли отдельно, анализировали их геномных профилей по массива CGH, и сравнили геномные профили между парными образцами слизистых оболочек (MU) и подслизистой (SM) порционно и SM части и лимфы узел (LN) метастаз. Кроме того, путем сравнения CNAS между метастатическим и без метастатических подслизистых-инвазивной рака желудка (SMGC), мы определили кандидат СНА, связанные с Л.Н. метастазирования раннего рака желудка.
Этика Заявление
<р> Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Оита университета (Сертификат № р-05-04). Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов и /или членов их семей.
Статистический анализ геномная клональности и гетерогенность в слизистой оболочке и подслизистой частях SMGC геномная клональности и гетерогенность первичной (СМ) и метастатического (LN) части SMGC Далее, чтобы исследовать причастность CNAS в процессе метастазов в лимфатических узлах раннего рака желудка, мы сравнили число из CNAS между парными первичной (СМ) и метастатического (LN) частями 9 SMGCS (рис 4а). Три из 9 случаев показали повышенное количество CNAs в части LN, в то время как остальные 6 случаев наблюдалось снижение (фиг.4А). В результате, не было значительной разницы в количестве CNAs между спаренными SM и LN части (рис 4A, не имеет существенного значения в парного критерия Стьюдента). Кроме того, для идентификации СНА в частности, связанные с LN метастазирования, мы сравнили усредненные частоты CNAS в СМ с теми, в парном LN части (рис 4В), но не могли найти. Выражение признательности
<р> были использованы теста парного т и точный критерий Фишера. Различия в P
&л;. 0,05 считались статистически значимыми
Результаты
<р> Для того, чтобы исследовать участие геномных CNAS в процессе подслизистого вторжения, мы сначала сравнили число CNAS между сопряженными MU и SM образцов из 23 SMGCS (Рисунок 2А). Одиннадцать из 23 случаев показали повышенное количество CNAs в части СМ, по сравнению с участком MU, 11 показал уменьшение числа, а оставшийся один случай не показали изменения (фиг.2А). В результате, не было статистически значимых различий в количестве CNAs между парными MU и SM частями (Фигура 2А, не имеет существенного значения в парного критерия Стьюдента). Кроме того, для идентификации СНА специфически связаны с подслизистого вторжением, мы сравнили усредненные частоты CNAS в части MU с теми, в парном SM части (рис 2В), но не удалось найти какой-либо
. <Р> Для того, чтобы исследовать разница между CNAS MU и СМ от той же опухоли, мы сравнили геномные профили парного MU и СМ в каждом конкретном случае. Один из представителей случай показан на рис 2С, D, E и F. Парная MU и SM образцы разделяют аналогичную картину геномной аберраций в хромосоме 9P (рис 2D). Однако, были различные геномные аберраций хромосом в 7р и 11 в том же случае, как показано на рисунке 2Е и F. Амплификация 7p12 наблюдалась только в MU, но не в СМ (рис 2E), и наблюдалось усиление хромосомы 11 только в СМ, но не в MU (рис 2F). Эти результаты свидетельствуют о том, что опухолевые клетки в MU и SM этого случая были клонированных связаны между собой, но состоят из генетически разнородных субпопуляции.
<Р> Далее, чтобы определить, является ли опухолевые клетки, показывающие усиление 7p12 и те, которые показывают усиление 11q13 из случай 4 действительно были ограничены MU и SM, соответственно, мы проанализировали срезы ткани от случая 4 с помощью иммуногистохимии с антителами против EGFR, дополненную только в части MU (Рисунок 2E) и CTTN, которая была получена только в СМ часть (рис 2F). Как показано на рисунке 3, положительная иммунореактивность для EGFR был ограничен участком MU (рис 3D, E и F), в то время как только часть SM показал сильную иммунореактивность для CTTN (рис 3G, H и I). Эти результаты свидетельствуют о том, что, в случае 4, опухолевые клетки с 7p амплификации в MU может не вторглись в СМ, в то время как те, с хромосомой 11 усиления, возможно, вторглись в СМ.
<Р> Далее, мы проанализировали геномную клональности и гетерогенность в MU и СМ других случаях. Среди других 22 случаев, 14 показали аналогичную картину геномной аберраций в MU и SM (цифры S1 (6 случаев) и S2 (8 случаев)), что свидетельствует о том, что раковые клетки в MU и СМ из этих случаев были клонально связаны , Интересно, что 12 из 14 случаев показали значительное различие в геномных образцов профилей между MU и SM (цифры S1 (6 случаев) и S2 (6 случаев)), предполагая, что эти случаи были также состоят из генетически разнородных субпопуляции.
<Р> Чтобы исследовать разницу СНА между СМ и ЛУ той же опухоли, мы сравнили геномные профили парного SM и образцы LN в каждом конкретном случае. Представитель случай показан на фигуре 4C, D и E. парного SM и LN образцы разделяют аналогичную картину геномной аберраций в хромосоме 8 (рис 4D), предполагая, что обе части были получены из того же клонального происхождения. Тем не менее, наблюдалось усиление хромосоме 14 только в СМ, но не в LN (рис 4д). Эти результаты свидетельствуют о том, что опухолевые клетки в СМ и LN частей этого случая были клонированных связаны между собой, но состоят из генетически разнородных субпопуляции.
<Р> Мы также проанализировали геномную клональности и гетерогенность в SM и LN порциями из других случаев. Среди других 8 случаев, 5 показали аналогичную картину геномной аберраций в обоих СМ и LN (рис S3), предполагая, что спаренные SM и LN части из этих случаев были клонированных связаны между собой. Кроме того, 4 из 5 случаев показали значительное различие в геномных образцов профилей между СМ и LN (рис S3), предполагая, что эти случаи были также состоят из генетически разнородных субпопуляции.
Сравнение геномных профилей между метастатическим и неметастатической SMGC
<р> поскольку нет статистически значимых различий были обнаружены в частотах CNAS между парными SM и LN части (рис 4б), мы предположили, что субпопуляции проведение метастазирования связанной с CNAs могут присутствовать в СМ, а также как часть LN метастатического SMGC. Таким образом, мы в следующий раз по сравнению частоты CNAS в части SM метастатических SMGCS (12 случаев) с таковыми неметастатической SMGCS (15 случаев), и обнаружили, что выигрыш в 11q13, 11q14, 11q22 и 14q32 были обнаружены более часто в метастатическим SMGCS чем в неметастатической SMGCS (рис 5А и таблица 2). Мы также сравнили частоты высокого уровня числа копий аберраций, таких как усиление и удаление, между этими двумя группами, и обнаружили, что усиление 17q21 выявлялась чаще в метастатических SMGCS, чем в неметастатической SMGCS (таблица 3 и таблица S1) , Эти результаты свидетельствуют о том, что прибыль на 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 и усиления в 17q21 участвуют в LN метастазирования SMGCS.
<Р> Минимальная общая область усиления в 17q21 содержала 5 генов, перечисленных в таблице 3. Так как ERBB2 , хорошо известный онкоген [26], [27], [28], был включен в список, мы провели иммуногистохимический анализ ERBB2 избыточной экспрессии во всех 27 случаях. Как показано на рисунке 5В, случаи с 17q21 усиления выставлены сильное окрашивание для ERBB2 в СМ, в то время как один случай без усиления не сделал. Кроме того, избыточная экспрессия ERBB2 была в значительной степени связано с усилением 17q21 (таблица 4), предполагая, что ERBB2 усиление и избыточная экспрессия могут быть вовлечены в LN метастазирования пропорции SMGCS.
Обсуждение
<р> Он широко принято считать, что опухоль возникает из единственной клетки. Тем не менее, как он прогрессирует до продвинутой стадии все еще обсуждается. Ранние исследования ободочной и прямой кишки и поджелудочной железы привело к понятию, что развитие и прогрессирование этих видов рака связаны с накоплением хромосомных аберраций, именуемых как многоступенчатой модели онкогенеза [29], [30]. Например, геномные аберраций генов APC, KRAS, SMAD4 и TP53 участвуют в последовательности аденома-карциномы толстой кишки [29]. Тем не менее, такие исследования сосредоточены на только часть генов, связанных с опухолью, и пренебрегли роль большинства других генов. Кроме того, эта модель не смогла оценить значимость внутриопухолевой геномной гетерогенности для развития и прогрессии опухоли. В то же время, недавние исследования привели к созданию другой модели, обозначенный клонального модель эволюции [7], [9], [10]. В этой модели один клон развивается в нескольких различных субпопуляций через накопление различных генетических аномалий. Преобладающее население, может быть заменен различными субпопуляций в пределах одной массы опухоли посредством влияния давления окружающей среды отбора и /или стадии развития опухоли. Как следствие, некоторые популяции генетически гетерогенных клеток могут сосуществовать в пределах одной массы опухоли. Свидетельство внутриопухолевой генетической гетерогенности, связанной с клональной эволюции было получено для различных солидных опухолей, включая рак простаты [14], пищевода Барретта [31], рак яичников [32], [33], рак шейки матки [34], рак молочной железы [15], [35], нейробластома [36], рак поджелудочной железы [13], [37], и колоректальный рак [38]. Интересно отметить, что при исследовании летального метастатического рака предстательной железы, не СНА конкретно не относящейся к участку метастазирования были найдены [14]. Аналогичным образом, в исследовании высокосортного серозного рака яичников, не было никаких доказательств связи между приобретением сопротивления цисплатин и специфических CNAS [39]. Эти результаты свидетельствуют о том, что многоступенчатая модель канцерогенез, в котором конкретные аберраций играют важную роль в развитии и прогрессии опухоли, не всегда представляет собой способ, в котором опухоли приобретают злокачественный характер. В настоящем исследовании мы изначально предположили, что приобретение конкретного CNA (ов) может быть важно для подслизистого вторжения. Тем не менее, нам не удалось найти какие-либо CNAS, которые были более частыми в СМ, чем в парной выборки MU. Кроме того, мы также не наблюдали никаких существенных различий в отношении количества CNAS в спаренных участков MU и SM. Тем не менее, мы обнаружили, что большинство SMGCS состояли из клонированных-родственных, но генетически различных субпопуляций, предполагая, что клоновая эволюция может происходить во время прогрессии рака желудка. Взятые вместе, хотя число рассмотренных дел было ограничено, наши результаты свидетельствуют о том, что поколение генетически различных субпопуляций, а не приобретение конкретного CNAS в части MU может иметь важное значение для процесса подслизистого вторжения. На основании этих выводов, мы предлагаем гипотетическую модель процесса вторжения СМ и Л.Н. метастазирования раннего рака желудка (рисунок 6). Чтобы подтвердить эту гипотезу, потребуются дальнейшие исследования с более крупными образцами.
<Р> Наши данные, указывающие, что SMGCS состоят из генетически разнородных субпопуляции имеют важное значение в контексте желудка исследований и лечения рака, потому что опухоль гетерогенность делает развитие эффективные препараты трудно. Так как геномные CNAs оказывают влияние на профили экспрессии генов в различных онкологических заболеваний [16], [21], [40], [41], [42], [43], вполне возможно, что каждый из генетически различных субпопуляций в пределах одного опухоль может отличаться как в биологическом поведении и реакции на противоопухолевым препаратам, в том числе молекулярных агентов, нацеленных. Cooke и др. предложили уточнение различных генетических субпопуляций в пределах одной опухоли позволило бы эффективную терапию с использованием конкретного агента таргетирования общую геномную аберрация или комбинированных агентов таргетирования уникальных геномных аберраций в каждом из различных субпопуляций [39]. Эта стратегия может также применяться для лечения рака желудка.
<Р> Среди 23 случаев мы анализировали, 15 показали клонального отношения между частями MU и СМ. Кроме того, 13 из последних 15 случаев также показали различия в CNAS между двумя регионами, предполагая, что клоновая эволюция часто происходит в ранней стадии рака желудка. Отношения между парными MU и SM образцов в остальных 8 случаях без общего CNAS остается неясным. Два возможных объяснений этому может быть предложено. Одним из них является то, что опухоли в спаренных участках, которые не имеют общих СНА, разработаны независимо друг от друга. Другие, что спаренные участки разделяют другие типы генетических аберраций, такие как мутации и транслокации, которые не могут быть обнаружены с помощью массива CGH. В последнем случае, следующего поколения секвенирования может быть полезен для анализа таких отношений.
<Р> В этом исследовании, прибыли на 11q13, 11q14, 11q22 и 14q32, и усиление при 17q21, были более частыми в части С.М. метастатических SMGCS, чем в образцах неметастатической SMGCS. Интересно отметить, что прирост в 11q13 и 14q32, как сообщается, участвуют в метастазировании печени рака толстой кишки [38]. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что увеличение в 11q13 и 14q32 могут быть вовлечены в метастазирование рака желудочно-кишечного тракта. Хромосома 17q21 таит в себе мощный онкоген, ERBB2. Ассоциация экспрессии ERBB2 с клинико-патологическими особенностями рака желудка было исследовано в ряде исследований [44], [45], [46], [47], [48], [49]. Тем не менее, влияние ERBB2 оверэкспрессии на Л.Н. метастазирования отличался среди этих исследований [44], [46], [47]. В настоящем исследовании, несмотря на ограниченное число SMGCS исследуемого, все те, с ERBB2 усиления и избыточной экспрессии показали метастазов в лимфатических узлах. Дальнейшее исследование с использованием большего количества SMGCS будет необходимо оценить значимость этой тенденции.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
Случаи, показывая как общие, так и различные геномные аберраций между частями MU и SM. Левые панели показывают общие закономерности геномных аберраций в MU и SM для каждого случая. Центр и правая панели показывают различные образцы геномной аберрацией между двумя частями в каждом случае
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s001
(TIF) Рисунок S2
.
Случаи, показывая как общие, так и различные геномные аберраций между частями MU и SM. Общие и различные образцы геномной аберрацией между MU и SM для каждого случая показаны
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s002
(TIF) Рисунок S3
.
случаи, показывающие как общие, так и различные геномные аберраций между SM и LN частями. Левые панели показывают общие закономерности геномных аберраций между SM и LN для каждого случая. Центр и правая панели показывают различные образцы геномной аберрацией между двумя частями в каждом случае
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s003
(TIF)
таблице S1.
Повторяющиеся усилений и делеции в SMGCS.
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s004
(DOC)
<р> Мы благодарим Misuzu Тагучи, Йоко Miyanari и Tsuyoshi Ивао за отличную техническую помощь
Недавно обнаруженные крупные фаги стирают границу между жизнью и неживой
Люди с симптомами СРК могут иметь низкий уровень витамина D,
Нанотехнологии и диагностика и лечение COVID-19
Как укрепить свою иммунную систему для борьбы с коронавирусом
Что такое изжога
Вакцинация против ротавируса не связана с риском сахарного диабета 1 типа
Дисбиоз микробиоты кишечника может вызвать тяжелую вторичную инфекцию у пациентов с COVID-19
Интересное исследование, проведенное учеными из США, недавно показало, что микробное сообщество в кишечнике напрямую поражено тяжелым острым респираторным синдромом, коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), и чт
Повышение рисков биозащиты, создаваемых синтетической биологией
Исследование, проведенное по заказу Министерства обороны США, показало, что существует несколько инструментов генной инженерии, которые можно использовать для создания биологического оружия за коротки
Исследования связывают распространенность SARS-CoV-2,
больничные поверхности и микробиомы пациентов Исследователи обнаружили более высокое бактериальное разнообразие в палатах и поверхностях помещений для пациентов с SARS-CoV-2, предполагая, что разно