PLoS ONE: Малый Молекула R1498 как хорошо переносимым и пероральный активный киназы Ингибитор для гепатоцеллюлярной карциномы желудка и лечения рака с помощью таргетинга ангиогенез и Митоз Pathways

Абстрактный

протеинкиназы играют важную роль в развитии и прогрессии опухоли. Много ингибиторов киназы вошли в рынок и показать перспективные клинические преимущества. Здесь мы сообщаем об открытии новой маленькой молекулы, хорошо переносится, перорально активный ингибитор киназы, R1498, главно ориентированные как развитие кровеносных сосудов, и митотических пути для лечения гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и рака желудка (GC). Ряд биохимических и клеточных анализов показали, что целевой киназы кластер R1498 включены Aurora киназ и VEGFR2 и соавт. R1498 показал умеренное экстракорпорального
ингибирование роста в на панели опухолевых клеток с ИК50 диапазоне микромолей. В естественных условиях
противоопухолевую эффективность R1498 была оценена на панели ГХ и ГЦК ксенографтов в параллельном сравнении с другим ингибитором мультикиназный сорафениба. R1498 продемонстрировал высокую эффективность и токсичность профиль над сорафениба во всех моделях испытаний с > 80% ингибирования роста опухоли и регрессии опухоли в некоторых xenogratfts. Терапевтический потенциал R1498 также была подчеркнута его эффективности на трех человек GC первичной опухоли производных моделей ксенотрансплантатов с 10-30% скорости регрессии опухоли. R1498 было показано, активно подавляют активность Aurora A в естественных условиях
и уменьшить васкуляризации в опухолях. Кроме того, R1498 представлены хорошо В естественных условиях
экспозиции и терапевтическое окно в исследованиях дальномер фармакокинетических и дозы. Тезисы свидетельства показывают, что R1498 является мощным, хорошо переносится, перорально активным ингибитором киназы multitarget с уникальной антиангиогенного и антипролиферативным профиль, и обеспечить надежную уверенность для дальнейшего развития НСС и GC терапии
<р> Образец цитирования:. Чжан C, Ву X, Чжан M, L Чжу, Чжао R, Сюй D и др. (2013) Маленький Молекула R1498 как хорошо переносимым и пероральный активный киназы Ингибитор для гепатоцеллюлярной карциномы желудка и лечения рака с помощью таргетинга ангиогенеза и митоза путей. PLoS ONE 8 (6): e65264. DOI: 10.1371 /journal.pone.0065264
<р> Редактор: Клод Prigent, Институт де Génétique и др Développement де Ренн, Франция
<р> Поступило: 22 февраля 2013; Принято: 23 апреля, 2013 года; Опубликовано: 5 июня 2013
<р> Copyright: © 2013 Чжан и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы: Все авторы являются сотрудниками или предыдущие сотрудники компании Рош R &Amp; D Center (Китай), за исключением Тайпинский Чен. , который является сотрудником CRO компании под названием Crown Bioscience Inc. Пекин, Китай. Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов общего доступа.

Введение
<р> протеинкиназы служат в качестве мишеней для терапевтического вмешательства при раке, который проверяется и подтверждается успешное и широкое применение ингибиторов протеинкиназы в нескольких видов рака, либо в качестве монотерапии или в комбинации препаратов. Тем не менее, как гетерогенный заболевание, вызываемое накопительные мутации нескольких генов, а не движимый одной киназы мутанта, рака, которые держат хороший ответ на терапию одного агента весьма ограничены. Кроме того, приобретенная резистентность опухолей помочь себе быстро уклоняться от химиотерапии, а затем рецидив. Комплекс аберрантное сигнализации при раках привлекает разработку стратегий, нацеленных на несколько биологических путей, имеющих отношение к биологии опухолей, таких как пролиферация, метастазирование и антиапоптоз. Одна стратегия включает в себя рациональные комбинации лекарственных средств. Например, сочетание VEGF целевых моноклональных антител с традиционной химиотерапией показал значительное увеличение выживаемости при раке молочной железы, толстой кишки и легких [1]. Другая стратегия заключается в разработке соединений, которые охватывают несколько механизмов в рамках одного агента. Такой подход имеет несколько потенциальных преимуществ по сравнению с комбинированной стратегии, в том числе простота пути развития, скорость на рынок, и меньше перекрывание побочных эффектов. В настоящее время мультикиназный ингибитор сорафениб используется в качестве первой линии терапии распространенным и метастатическим ГЦК с улучшением медиана выживаемости от 7,9 месяцев (группа плацебо) до 10,7 месяцев [2]. Тем не менее, лечение с результатами сорафениба в статистически значимых, но клинически легких, улучшение общей выживаемости, времени до прогрессирования и скорость борьбы с болезнями [3]. В то же время, традиционная цисплатин терапия на основе по-прежнему широко используется в клинических условиях для продвинутых и метастатическим GC. Для HER2 /Neu гиперэкспрессией желудка аденокарциномы, трастузумаб в комбинации с химиотерапией увеличивает медиана общей выживаемости с 11,1 месяцев (только химиотерапии) до 13,8 месяцев [4]. Хотя companioned диагностическая методика была создана для целевой экран пациентов, трастузумаб не обладает активностью в большой подгруппе пациентов, несущих высокий уровень HER2 /Neu с указанием причины быть идентифицированы [5]. Учитывая высокую смертность ГЦК и ГХ и текущих терапевтических режимов с ограниченным исходом, есть еще огромная неудовлетворенная медицинская потребность для обоих типов рака.
<Р> Ангиогенез терапия на основе рака, включая анти-VEGFR-2 антитела, малые молекулы против VEGFR -2 сигнализации [6], [7], и VEGFR химерный белок [8], было доказано, чтобы быть эффективной стратегией для лечения различных типов рака. Кроме того, эффективность мультикиназный ингибиторов сунитиниба и сорафениба частично будут отнесены к передаче сигналов VEGF блокировки [9]. Тем не менее, количество пациентов, по своей природе устойчивы или развивают устойчивость к анти-антиангиогенной терапии после нескольких циклов лечения [10], [11]. Таким образом, клинические испытания, сочетающие ингибиторы ангиогенеза и препаратов с альтернативным механизмом действия, как ожидается, повысить эффективность или преодолеть сопротивление к антиангиогенной терапии [12]. Это было широко признано, что избыточная экспрессия полярное киназ в различных раковых образований участвует в процессе онкогенеза [13], [14]. ингибитор киназы Aurora VX-680 был способен эффективно подавлять рост раковых клеток в пробирке
и В естественных условиях
, а затем вступил в клинических испытаниях, предполагая, что киназ Aurora являются druggable цели [15] .
<р> В свете накопительные свидетельств ангиогенеза и Aurora киназ при раке и их терапевтических значений доказанными биологическими и низкомолекулярные ингибиторы, мы обнаружили, ингибитор киназы, R1498, что существенно повлияло на основные пути ангиогенеза и митоз. R1498 имеет уникальный профиль ингибирования киназы, высокой активностью и хорошей фармакокинетики и токсикокинетические профили, все они поддерживают дальнейшее клиническое развитие.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> Использование и уход за экспериментальных животных было одобрено животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC), Roche R &усилитель с; D Center (Китай). Корона Bioscience, ОЦР сервисная компания стремится защитить частную жизнь пациентов и соблюдать все этические принципы для пациента полученных материалов, собранных свеже выброшенных образцов опухолей человека, с IRB (местная больница эквивалент комитета) утверждения и требования согласия пациента. Все клеточные линии были приобретены у АТСС, США, или Шанхай института биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук

Соединения
<р> R1498 (чистота > 98%). Синтезировали Roche R &усилитель; D Center (Китай). Для получения ферментных анализов и в пробирке
анализов на основе клеток, R1498 растворяли в ДМСО в 0,01 моль /л раствора. Для исследований на животных, R1498 растворяли в 1% Klucel EF /0,1% полисорбат 80 /0,09% метилпарабен /0,01% пропилпарабен вода, раствор был приготовлен на еженедельной основе. Сорафениб был синтезирован Roche R &Amp; D центр (Китай) и растворяют в Cremophor EL /этанол (50:50, Sigma) с получением раствора 5 мг /мл маточного раствора, фольгу, навивка, и хранить при комнатной температуре. Этот исходный раствор свежеприготовленный каждые 3 дня. Окончательные решения дозирования были подготовлены на день использования путем разбавления исходного раствора с стерилизованной воды.

Клеточные линии
<р> Все клеточные линии от американской Типичные коллекции Центра (АТСС) и клетки банка, Шанхай институтов биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук поддерживали при 37 ° с с 5% CO <югу> 2 увлажненной атмосфере в среде роста рекомендуют от поставщиков и подвергают в пробирке
анализы между проходами 8~15 , клеточные линии для исследований на животных были между проходами 5~10. Человеческой пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC), полученные из Allcells (Emeryville, CA) находился в EGM-2 (LONZA, Allendale, NJ) с эндотелиальными добавок роста клеток и 10% фетальной телячьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA).

пролиферации клеток Анализ
<р> Каждая клеточная линия была посеяна в 96-луночный планшет для тканевых культур в (Корнинг, штат Нью-Йорк) при заданной плотности в 180 мкл полной среды, прилагается в течение ночи и обрабатывали соединением в течение еще 72 час Затем среду выбрасывали и замен ли 10% ССК-8 (Dojindo, Кумамото, Япония), в полной среде, а затем инкубируют планшеты в течение еще 2 ч. ОП <суб> 450 измерялось с Spectramax 190 спектрофотометре (МБС, Sunnyvale, CA). Фоновое поглощение OD <> к югу заготовки вычитали из всех лунок. Тогда степень ингибирования (ИК) определяли с помощью следующей формулы:. ИК (%) = (значение OD <суб> ДМСО-ОД <суб> соединение) /ОП <суб> ДМСО × 100%
<р> В СЭФР-индуцированный HUVEC анализ пролиферации, то HUVECs взвешенные в 170 мкл EGM-2 с 0,5% FBS были посеяны и инкубировали в течение ночи. После того, как клетки прикрепленными, 10 мкл 1 мкг /мл рекомбинантного человеческого VEGF-165 (R &Amp; D Systems, Minneapolis, MN) добавляли в каждую лунку вместе с 20 мкл составных растворов, приготовленных в EGM-2 с 0,5% FBS. ССК-8 анализа, как было описано выше, использовали для определения жизнеспособности клеток.

киназа
Assays <р> Сродство R1498 против 402 киназ, определяли KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) и данные были представлены в виде значений константы диссоциации (Kd) [16]. Ингибирование активности киназы Аврора киназ и VEGFR2 дополнительно характеризовали с помощью анализов активности киназы Z'-Lyte при соответствующих концентрациях АТФ.

HUVEC Tube Формирование анализа
<р> Анализ образования HUVEC трубки проводили, как ранее сообщалось [17]. Если коротко, то Матригель ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), оттаивают при температуре 4 ° С в течение 3~4 ч. 100 мкл жидкого Матригель ™ был добавлен в предварительно охлажденный 96-луночный планшет для тканевых культур, и планшет инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2 увлажненной атмосфере в течение 1 ч, чтобы затвердеть Matrigel ™. HUVECs культивировали в EGM-2 с 0,5% FBS в течение ночи, и высевали в 90 мкл EGM-2 с 0,5% FBS при плотности 2,2 × 10 5 клеток /мл на Матригель ™ пластины с покрытием. Клетки обрабатывали соединением или эквивалентное количество ДМСО. Планшет инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2 увлажненной атмосфере в течение 7 ч, а затем клеточной морфологии была захвачена с фазово-контрастным микроскопом (IX71, Olympus, Hamburg, Германия).

вестерн-блот
<р> клеточный лизат был подготовлен в буфере RIPA и количественно с помощью метода бицинхониновой кислоты (ВСА) (Pierce, Rockford, IL). Тридцать микрограммов белка в образце загружали на 4~12% NuPAGE® Novex SDS гель (Invitrogen). Белок переносили с помощью сухой промокательной устройства iBlot® (Invitrogen) на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования неспецифического связывания с TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /T), содержащей 5% обезжиренного молока в течение 1 ч при комнатной температуре, мембрану инкубировали в фосфо-Aurora A (Thr288) (C39D8) кролика моноклональное антитело ( Cell Signaling Technology, ДКБij9, Beverly, MA) или фосфо-гистона H3 (Ser10) кроличьи поликлональные антитела (ДКБϊ1) (1:1000 в TBS /T, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), и осторожно встряхивают в 4 ° с в течение ночи. После этого мембрану промывали TBS /T в три раза, чтобы удалить несвязанного антитела, а затем инкубировали со вторичным антителом (конъюгированным с пероксидазой хрена козьего антитела против мышиного IgG или козьего антитела против кроличьего IgG, 1:10000, KangChen Биотек, Шанхай, Китай) в течение 1 ч при комнатной температуре, соответственно. Белковые полосы визуализировали с улучшенным хемилюминесценции (ECL) комплект (Pierce, Rockford, IL).

иммунофлуоресценции
<р> Клетки высевают на камеру срезы фиксировали в 4% параформальдегида при комнатной температуре, а затем делают проницаемыми с 0,15% Triton-X100 в TBS и блокировали в 3% БСА в TBS /T. в качестве первичных антител (фосфо-Aurora A (Thr288) (ДКБĵ7), фосфо -Histone Н3 (Ser10) (ДКБϊ1) и MPM2 (анти-фосфо-Ser /Thr-Pro) Millipore-368), инкубировали с горками во влажной камере при 4 ° с в течение ночи. Вторичные антитела Alexa Fluor® 488 козий анти-кроличий IgG (H + L) или Alexa Fluor® 594 козьего антитела против мышиных IgG (H + L) (Invitrogen) применялись соответственно в течение одного часа после того, как предметные стекла промывали TBS тщательно. После того, как несвязанные антитела были удалены, слайды были высушены и установлены с DAKO antifide монтажной средой. Изображения были захвачены с IX71 при наличии соответствующих возбуждения и эмиссии фильтров.

Проточная цитометрия
<р> Содержание ДНК измеряли с помощью FACS-Calibur цитометра (Becton Dickinson, San Jose, CA) и распределения клеточного цикла вычисляли, как описано ранее [18].

Tubulin в пробирке
полимеризация анализ

в пробирке
анализ полимеризации тубулина проводили, как описано ранее [18 ]

однократной дозы Фармакокинетические (СДПК) Исследование
<р> использование и уход экспериментального животного был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета, Roche R &Amp;. D центр (Китай). Мужские безволосые мыши (масса тела: от 19 до 24 г) использовались в СДПК исследовании. Перед фармакокинетического исследования, животные были случайным образом распределены по группам выборки (3 животных в момент времени). Десять дополнительных мышей были использованы для собранной плазмы заготовки для калибровочных кривых. Мыши голодали в течение ночи перед оральным введением.
<Р> Образцы крови собирали путем ретроорбитального прокола до введения дозы и 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 и 24 часов после введения дозы. Образцы плазмы и рецептура доза хранили при -20 ° С до биоанализа. Система сбора данных и управления были созданы с использованием Analyst 1.4 программного обеспечения от компании ABI Inc. Концентрации в плазме ниже предела количественного определения (ПКО = 1 нг /мл) были назначены в качестве нуля. Анализ фармакокинетических данных проводили с использованием noncompartmental модулей анализа в WinNonlin Professional v5.2 (Pharsight, США) .The биодоступности рассчитывали как F (%) = (доза <суб> IV × АУК <суб> ро (0-∞)) /(доза <суб> ро × АУК <подразделам> IV (0-∞)) * 100%. Для крысы, собаки и обезьяны СДПК, образцы крови собирали из яремной вены прокола.

ксенотрансплантата Эффективность Исследование с клеточных линий и пациентов производный Опухоли
<р> Использование и уход за экспериментальных животных было одобрено Институциональная Уход за животными и использование комитета, Roche R &Amp; D Center (Китай). Опухолевые клетки засевали в правый бок BALB /C ню /ню
женщина ню мышей (5~6 недель, 16~18 г, полученные из китайско-британских SIPPR /BK Lab. Ltd животных, Шанхай, Китай) при оптимальной плотности на основе нашего исследования проверки в доме. После того, как опухоль была установлена ​​и достигла 100~150 мм 3, мышей случайным образом делили на десять мышей на группу и получали лечение в соответствии с графиком. Рост опухоли регистрировали три раза в неделю с измерением длины (L) и ширина (W) по суппорту, и рассчитывается как объем опухоли (ТВ, мм 3) = 0,5 * L * W * W (мм) , Ингибирования роста опухоли рассчитывали как TGI% = (1- (средний объем опухоли в группе лечения на первый день среднего объема опухоли группы обработки на конец дня) /(средний объем опухоли в контрольной группе на первом день средний объем опухоли в контрольной группе на конец дня)) × 100%. Опухоль регрессия отдельной мыши была определена -. Объем опухоли в конце была меньше, чем объем опухоли, когда лечение было начато
<р> В первичных моделях опухолей человека, свежие желудка человека опухолевых тканей были непосредственно имплантируется в диабетический и не страдающих ожирением тяжелый комбинированный иммуно-дефицитных (NOD-SCID) мышей в течение 5 часов после операции с 5 мм 3 фрагментов для создания первичных моделей опухолей ксенотрансплантатов. Каждая модель опухоли была проверена по крайней мере тремя последовательными естественных условиях
пассажей, чтобы продемонстрировать стабильность приживление. Опухоли из пассажей 4-7 подкожно заражают троакаров в правых флангах BALB /C ню /ню женщина ню мышей (5~6 недель, 16~18 г). Лечение началось, когда объем опухоли достигал 100~150 мм 3. Протокол измерения и операции опухоль была такой же, как клеточная линия, полученной модели опухоли.

Immunohistochemistry

парафином горок ткани 8 мкм опухоли, полученные из опухоли В естественных условиях
эффективности исследования нагревали в сушильном шкафу при температуре 60 ° с в течение 1 ч, а затем депарафинировали и гидролизуется Leica autostainer XL ST5010 при комнатной температуре. Антиген поиск проводили при 95~99 ° С в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0), нагреваемого медицинской микроволновой печи при 92-98 ° С в течение 5 мин, затем охлаждают до комнатной температуры. Затем пероксидазой блокирующий реагент (Dako, DK-2600, Glostrup Denmark) наносили для гашения эндогенной пероксидазы. Срезы инкубировали в блокирующем сыворотки в течение 20 мин, затем покрывают 100 мкл фосфо-Aurora A (Thr288) (C39D8) кролика мАт (ДКБij9, 1:200 в TBS /T) или кролика против человеческого CD31 поликлональные антитела ( Santa Cruz Biotech, SC-8306, Santa Cruz, CA, США; 1:200 в TBS /T) при 4 ° с в течение ночи, а затем инкубировали в 100 мкл DAKO Envision + /HRP, кролик /мышь после того, как тщательно промывают TBS. Сто микролитров субстрата-раствор хромогенного (DAB) были применены к слайдам и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Срезы тщательно промывают водопроводной водой в течение 15 мин. Проводят контрастное и обезвоживание проводили XL ST5010 при комнатной температуре. И, наконец, слайды были установлены с монтажной предметный столик Permount среды (Fisher Scientific, Майами, Флорида).

доза дальномер и Токсикокинетические исследование
<р> доза дальномер и токсикокинетические исследование было проведено на крысах и Beagle собаки на основе в пробирке
метаболитов идентификации. Вистар (самцы: 3, женщина 3 в каждой группе, от Vital River, Пекин, Китай) голодали в течение ночи, а затем получил тестовые статьи как 0, 6,25, 50 и 100 мг /кг дважды в день на желудочный зонд в течение 14 лет -день непрерывный режим. наблюдение Подвижность наносили на ежедневной основе, чтобы найти максимальную толерантную дозу для животных. Животных забивали на d14, и последующее наблюдение токсикологии были проведены в том числе изменения веса тела, клиническое наблюдение, патологоанатомического, химии гематологии и гистопатологии. На 1-й день и 14-й день пробы крови были получены через яремную вену пункции у всех животных (если он жив, с использованием ЭДТА-K2 трубки). Образцы осторожно перемешивали и не помещается на дробленый мокрым льдом до центрифугирования, которая была проведена немедленно. Образцы центрифугировали в течение примерно 15 минут при 4 ° C 2,700 оборотов в минуту. Полученную плазму отдел, переносили в однозначно маркированных прозрачных полипропиленовые пробирки и немедленно заморожена над твердым диоксидом углерода (сухой лед) до передачи приблизительно -80 ° С. Каждое животное кровоточили в следующих временных точках: примерно 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после первой дозы на определенный день. Концентрации препарата в плазме определяли с помощью LC-MS /MS. Фармакокинетические анализ был проведен с использованием программного обеспечения WinNonlin (Version 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), и фармакокинетические параметры были рассчитаны с использованием метода Non-полигамное модели.

гончих собак (примерно 8-10 месяцев, от Пекин Маршалл Biotechnology Co. Ltd., Пекин, Китай) были подвергнуты протоколу исследования, как описано выше. Каждая группа имеет один мужчина и одна женщина собака, Дозировки тестируемого образца были: 0, 1, 7,5 и 15 мг /кг, соответственно. Использование и уход экспериментального животного был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета, Roche R &Amp;. D Center (Китай)

Анализ данных и статистика
<р> Независимый тест т использовался для непрерывных данных анализ и χ2 тест был применен к категорийных данных. Данные были признаны значимыми, когда значения р были &л; 0,05.

Результаты

1. Характеристика R1498 в качестве мультикиназный Ингибитор

Pyrazolobenzodiazepine аналоговый R1498, с помоста на основе слияния бензодиазепины и пиразола кольца (рис 1А), ранее был идентифицирован слабым циклин-зависимой киназы 2 (CDK2) ингибитор [19]. Эта молекула показала характер ингибитора мультикиназный когда мы проанализировали библиотеку ингибитор киназы. Профиль ингибирования киназы из R1498 (1 мкМ) характеризовалось посредством KINOMEScan® при концентрации АТФ вокруг Km каждой киназы. Степень ингибирования R1498 составляет более 80% по сравнению с 39 киназ из 402 киназ, в том числе 359 киназ дикого типа и 43 киназы мутантов (рис S1). Константы диссоциации (Kd) из 39 хит-киназ Затем определяли, а киназ с Kd &ЛТ; 0,2 мкМ были показаны на рисунке 1В. Большинство потенциальных хитов принадлежат к семейству тирозинкиназы (ТЗ) и семейства AGC. Кроме того, анализ Z-Lyte проводилось для дальнейшего определения ингибирования киназы активности R1498. Результаты показали, что IC50s из R1498 были 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 нМ против VEGFR2, Aurora-киназы А и В, соответственно (рис 1C). Тогда наше исследование было сосредоточено на антиангиогенные и анти-митотических путей главно пострадавших от R1498.
<Р> Панель клеточных линий рака 16, в том числе гепатокарциномой, рак желудка и носоглотки линий клеток карциномы, был использован для определения в пробирке
анти-пролиферации способность R1498. Большинство клеточных линий устанавливаются из азиатских видов рака, так как азиатские распространенные виды рака в центре нашего внимания. Гепатокарцинома и рак желудка панели клеточная линия были более чувствительны к лечению R1498, чем носоглотки линий раковых клеток. Общее среднее IC50s были 7,81, 7,55 и 30.07 мкм, что соответствует epatocellular карцинома, рак желудка и носоглотки линий клеток карциномы, соответственно. Чувствительность клеточных линий, полученных от населения Азии (Бел-7402, QGY-7701 и QGY-7703) была сравнима с чувствительностью Нер3В, который был из кавказского (рис 1D).

2. R1498 Угнетает Aurora киназ и Индуцирует клеточного цикла
<р> Aurora-киназы ингибирование R1498 визуализировали с помощью иммунофлуоресценции в клетку рака желудка линии SGC-7901. Прямые сайты фосфорилирования фосфо-Aurora протеинкиназа А (T288) и фосфо-гистона H3 (S10) были использованы для обозначения активность киназы Aurora A и B, соответственно [20], [21]. Фосфо-Ser /Thr-Pro митотический белок моноклональное(MPM2) был использован в качестве маркера митотической (красный) для маркировки митотических клеток. Aurora протеинкиназа А (T288) фосфорилирования происходит в центросоме митотических клеток (зеленый цвет). После того, как клетки обрабатывали 5 мкМ MR1498 в течение 24 ч, зеленый фокусы Aurora A T288 в митозе стали слабее или исчезали (рис 2А, верхняя панель), показывая, что активность Aurora-киназы пониженную при обработке R1498. Фосфорилирование гистона H3 (S10) в основном локализованы в центромеры делящихся клеток. После того, как клетки были обработаны с R1498, то фосфо-гистона H3 (S10) резко уменьшилась (зеленый). Это наблюдение позволяло предположить, что активность Aurora-киназы B также упал после обработки R1498. Эти результаты были подтверждены иммунофлюоресценции с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на фигуре 2В, фосфорилирования фосфо-Aurora-киназы А (T288) и фосфо-гистона H3 (S10) уменьшилось в зависимости от концентрации в острой лечения R1498.
<Р> Ингибирование Aurora киназ А и B производит различные фенотипические изменения в клеточном цикле. Подавление Aurora A индуцированной фазы G2 клеточного цикла [22], в то время как торможение на Aurora-киназы B, как сообщается, причиной полиплоидию в клетках вследствие endoduplication без цитокинеза [15]. После того, как клетки обрабатывали 10 мкМ R1498, как SGC-7901 (клетку рака желудка) и BEL-7402 (печеночно-клеточный рак) показал G2 /фазы ареста и накопления полиплоидных клеток M. Для BEL-7402, клетки, распространяющие в G2 /M фазы увеличилась с 25,6% до 57,0%, в то время, клетки с &соли 4 Содержание N ДНК увеличилась с 6,7% до 17,6%. SGC-7901 был более чувствительным, с G2 /M населения увеличилась с 25,2% до 75,5%, а полиплоидных клеток увеличилась с 3,1% до 21,6% (рис 2С). Микротрубочек стабилизатор (например, таксола) и дестабилизатора (например, колхицин) приведет к G2 /M фазы ареста, а также. Для того, чтобы понять, является ли R1498 микротрубочка целевой реагент, в пробирке
тубулина анализ проводили полимеризацию. Данные показали, что R1498 ни стабилизировалась, ни дестабилизировали полимеризации микротрубочек даже при высокой концентрации R1498 (40 мкМ) в пробирке
(Рисунок 2D), предполагая, что клеточный цикл G2 /M арест не был вызван нарушением микротрубочек цитоскелета. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что R1498 ингибирует Aurora киназы А и В в клетках и произвел фенотипические изменения в клетках.

3. R1498 антагонистом ангиогенеза прогресс человеческого эндотелиальных клеток
<р> Ангиогенез инициализируется секреции ангиогенного фактора роста из опухолевых клеток, а затем эндотелиальные клетки пролиферируют, мигрируют и трубки формы сосуда в ответах на стимуляции VEGF. Для решения специфичности R1498 антагонизм роста эндотелиальных клеток, стимулированную VEGF, Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) подвергались воздействию двух различных раздражителей, VEGF и FBS, при лечении R1498 в течение 72 ч. В условиях культивирования содержащих VEGF или FBS, HUVECs показали различную реакцию на R1498. В IC50s были 89 и 2064 нМ для VEGF и FBS, соответственно; они предположили, что R1498 омрачает рост HUVEC приводимый VEGF более мощным, чем FBS (рис 3А). В HUVEC анализе образования трубки, после 8 часов воздействия R1498, HUVECs образуется меньше сетках неповрежденные трубы, чем ДМСО обработанных групп (рис 3б). R1498 не влияет на пролиферацию HUVEC при этом условии лечения (данные не показаны).

4. R1498 Подавляет рост человеческого рака ксенотрансплантатов
<р> фармакокинетические свойства с однократной дозой R1498 в были определены несколько видов. Время полураспада (T1 /2) и биодоступность при пероральном приеме (Oral BA%) способствует дальнейшему исследования эффективности в голой мыши (таблица S1) с двукратного оральной график зондового. Панель ксенографтов включая азиатский рак желудка, гепатокарциномой и рак носоглотки использовали для сравнения между R1498 и другим ингибитором мультикиназный сорафениба (рисунок 4, Таблица S2). Sorafenib утвержден в качестве терапии первой линии для гепатокарциномой [2], а также в клинических испытаниях для комбинаторной терапии раком желудка [23]. Параллельное сравнение состояла из ингибирования роста опухоли, регрессию и веса тела животного изменения с дозировкой 25 мг /кг, два раза в день за полостью рта. Во всех протестированных ксенотрансплантатов, R1498 показал лучшую скорость ингибирования роста опухоли (TGI%) над сорафениба. Для гепатокарциномой, то TGI% от R1498 составляет 10-19% больше, чем TGI% сорафениба, рака желудка, 2-12% по сравнению с TGI% сорафениба. Скорость регрессии опухоли также была включена в качестве еще одного терапевтического конечной точки. В гепатокарциномой панели, регресс опухоли наблюдалась в Бел-7402 модели, 8/10 (80%) животных были регрессию в группе R1498, в то время как 1/10 (10%), животное было регрессию группе сорафениба (рисунок 4, Бел-7402) , Для желудка панели рака, MGC-803 и SGC-7901 ксенографты имели такой же показатель регрессии в ответ на испытания изделий: 5/10 (50%) для R1498 и 2/10 (20%) для сорафениба (рисунок 4, SGC -7901, и Таблица S2). На основе эффективности конечных точек от всех 7 протестированных моделей, R1498 имеет более высокую эффективность, чем сорафениба по той же схеме лечения. Кроме того, R1498 показали хорошую эффективность на одном карцинома носоглотки ксенотрансплантата, то TGI% от R1498 (90%, 25 мг /кг, два раза в день, за перорально через зонд) превосходил над уровнем струкциям циклофосфамид (60%, через каждые 10 дней, внутрибрюшинной инъекции) (рис 4, НИК-2). Изменения массы тела, которые были записаны во всех моделях для сравнения токсичности показали, что обнаженном мышь показала более терпимым к R1498 в течение всего лечения в Бель-7402, SGC-7901 и CNE-2 моделей, хотя увеличение массы тела немного снизилась за 10 дней после того, как лечение (рис 4, Таблица S2). Тем не менее, сорафениба вызвало непрерывное снижение массы тела животного. Для сорафениба обработанной мыши в BEL-7402 и SGC-7901 моделей, процент потери веса тела превышала 15% на день расторжения. Как показано в таблице S2, R1498 показал меньшее влияние на вес тела мышей, чем сорафениба сделал, которое предложил R1498 провел лучший профиль безопасности.

5. R1498 вниз регулирует фосфорилирование Aurora A и плотности сосудов в опухолевой
<р> фосфорилированные Aurora A (T288) и CD31 в опухолях от эффективности исследования были использованы для определения влияния на-мишени R1498. Масса опухоли собирали из исследования BEL-7402 ксенотрансплантата готовили в парафином горками и подвергали immunohistochemisty для визуализации кровеносных сосудов создателя человеческого CD31 и Aurora протеинкиназа А активность маркера фосфо-Aurora A (T288). В BEL-7402 опухолях CD31 окрашивание групп лечения R1498 уменьшилось в зависимости от дозы, который предложил васкуляризации в опухолях подавлялось (рис 5А). Активность Aurora-киназы А также была снижена при обработке R1498, что нашло отражение на более слабое окрашивание фосфо-Aurora A (T288) в R1498 лечение опухолей (Рисунок 5Б).
<Р> первичной опухоли желудка получена модель человеческого ксенотрансплантата была использована для прогнозирования эффективности для клинического перевода. Раковые ткани трех отдельных больных раком желудка были привиты у мышей, и ксенографты разграничены различные кривые роста В естественных условиях
. Ксенотрансплантаты показали различное воздействие на изменения веса тела хозяев. Мышей обрабатывали R1498 (25 мг /кг) в течение указанного периода, конечный TGI% достиг 73,6 ~ 91,6%, а уровень регрессии 10~30%. Изменения веса тела ограниченные предположил, что опухоль мышам были хорошо толерантными к R1498 (рисунок 6).

6. R1498 имеет хороший фармакокинетический профиль (PK) и терапевтическое окно
<р> СДПК показали, что приемлемые биодоступности и период полураспада свойства R1498 среди голой мыши, крысы и собаки (таблица S1). Обобщённые микросом печени были использованы для прогнозирования основных метаболитов у разных видов. Крыса и гончей собаки с подобными микросом метаболитов человека были использованы в максимальной переносимой дозы (МПД) исследования для определения терапевтического окна между эффективными и токсичных веществ (таблица S4). Самок и самцов крыс показали различную реакцию на эскалированных доз R1498.

• PLoS ONE: пируваткиназа M2 играет двойную роль по регулированию /EGFR сигнализации EGF через Е-кадгерин-зависимым обр…
• PLoS ONE: проспективное исследование на частоты послеоперационных венозных тромбоэмболии у корейских больных р…