CD44, но не выражение CD24 связано с плохим прогнозом в не кардии аденокарциномы stomach

CD44, но не выражение CD24 связано с плохим прогнозом в не кардии аденокарциномы желудка
Аннотация
Справочная информация
Недавние исследования сосредоточены на диагностической и прогностической значимости CD24 и экспрессии CD44 в злокачественных опухолях человека. Целью данного исследования являлось изучение изменения уровня экспрессии CD44 и CD24 у больных раком желудка и оценить их прогностическое значение.
Методы
CD44 и уровни экспрессии CD24 были исследованы иммуногистохимическим в образцах опухоли от 290 пациентов с не-кардии желудка аденокарциномы, из которых 77 были в паре с нормальной слизистой оболочки желудка. уровни CD24 и CD44 мРНК определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции у 34 пациентов. Сыворотка против Helicobacter Pylori
IgG определяли с помощью иммуноферментного анализа. Соотношение между уровнями экспрессии белка CD44 и CD24 и параметров опухоли были проанализированы и их прогностические значения были оценены Cox модели пропорционального риска.

Результаты уровней экспрессии CD24 и CD44 были значительно выше у больных раком желудка по сравнению с теми, в паре контроль (45,5% против 0,0%, и 61,0% против 0,0%, P &
л; 0,001). Среди 290 больных, общая выживаемость была значительно выше в CD44 (-), по сравнению с CD44 (+) (лог-ранговый, P
= 0,035) пациентов. Тем не менее, не было никакой значимой корреляции между экспрессией CD24 и общей выживаемости (лог-ранговый тест, P
= 0,115). Многофакторный регрессионный анализ показал, что положительное выражение CD44 (P = 0,029
), TNM постановка (P &
л; 0,001), и лимфоваскулярная инвазии (P = 0,016
), но не выражение CD24 (P
= 0,065), были независимыми прогностическими факторами при раке желудка.
Выводы
Индивидуальное выражение CD44 была связана с плохой выживаемости у пациентов с раком желудка. Экспрессия
Ключевые слова
CD44 CD24 Прогноз рак желудка хеликобактер пилори
фон
рак желудка является третьим наиболее распространенным видом рака в Китае. Несмотря на улучшение хирургических методов и разработки новых химиотерапевтических препаратов, были 989,600 новых случаев, и более чем 738,000 смертей во всем мире в 2008 году в половине случаев и оцененные смертей происходят в Китае. Прогноз для пациентов с распространенным раком желудка остается на низком уровне, даже после радикальной операции [1-3]. Хотя многие исследования изучали молекулярные маркеры для рака желудка, механизмы канцерогенеза остаются неясными. Взаимодействие между генетическими вариантами восприимчивости молекулярных изменений, а также охраны окружающей среды и факторы образа жизни, как известно, способствуют развитию рака желудка. TNM постановка рака желудка используется для оценки прогноза, но в настоящее время не хорошая молекулярная на основе биомаркеров, которые могут служить полезным прогностическим предиктором для продвинутых рака желудка [4]. Оба CD24 и CD44, как известно, способствует клеточной сигнализации и клеточной адгезии, и их роли в процессе канцерогенеза были исследованы. CD24 представляет собой муцин-подобный белок клеточной поверхности показано, что связано с злокачественности в многочисленных исследованиях человеческих тканей [5]. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин участвует в клеточной адгезии, которое также было показано, что высокий уровень экспрессии в аденокарциномы желудка [6]. Шеридан и др. показано, что CD44 (+) /CD24 (-) фенотип клеток рака молочной железы была связана с инвазивными свойствами и плохим прогнозом [7]. Раковые стволовые клетки (ЦОК) недавно были идентифицированы в желудочном линиях раковых клеток человека в ряде исследований [8], и CD44 (+) CD24 (+) клетки, как было показано, чтобы определить высоко онкогенного, рак желудка популяции клеток со свойствами личности -regeneration и мульти-родословная дифференцировки [9]. Weichert и др. показали, что цитоплазматические экспрессия CD24 была независимо коррелирует с укороченной выживаемости при колоректальном раке [10]. Ен и др. недавно исследовали экспрессию CD44 /CD24 в ретроспективном анализе больных с рецидивами рака желудка, но не обнаружили никаких ассоциаций между отдельными или комбинированной экспрессии CD24 и CD44 и рецидива рака желудка [11]. На основании этих предыдущих исследований, мы предположили, что экспрессия CD24 и CD44 могут быть соотнесены с желудочным прогнозом рака. Целью данного исследования было поэтому оценить уровни экспрессии CD24 и CD44 при раке желудка и оценить возможности их прогностическую значимость для будущей клинической практике. Helicobacter Pylori
инфекция считается фактором риска развития аденокарциномы желудка, и недавнее исследование показало, что H. пилори
через CagA, представила CSC-подобные свойства в эпителиальных клеток желудка [12]. Поэтому мы также исследовали связь между H. инфекцией пилори
и экспрессии CD24 /CD44.
методов
Участники
в общей сложности 290 пациентов (221 мужчин и 69 женщин) с не-кардии аденокарциномы желудка, которые подверглись радикальной операции (D1 + D2 или) в первой больнице университета Цзилинь были включены в это исследование в период с августа 2000 по декабрь 2010 года пациенты не получали никакой предоперационной химио-лучевой терапии. Послеоперационный химиотерапии назначали всем пациентам со стадиями II, III, IV и опухолей. Диагноз рака желудка был сделан на основании морфологических и иммуногистохимических результатов, оцениваемых независимо друг от друга двумя патологи (MJ и YW). Отбирают образцы опухолей были собраны во время операции. Гистопатологическая классификация и сорта аденокарциномы были определены в соответствии с классификацией Lauren [13] и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) классификации 2010 [14]. Они включали папиллярные аденокарциномы (п = 4), трубчатые аденокарциномы (п = 252), коллоидный аденокарциномы (п = 27), и плохо сплоченные карцином (печаткой карциномы кольцо клеток) (n = 7) в соответствии с классификацией ВОЗ 2010. Прилегающие нормальным желудочным эпителиальные образцы были собраны из 77 пациентов, для сравнения. возраст пациентов был от 32 до 87 лет, средний возраст 64 лет. Письменное информированное согласие было получено от всех больных и протокол исследования был одобрен Комитетом по этике Первой больницы Цзилинь университета по
Иммуногистохимия
Тканевые блоки были построены с использованием массива тканей (MiniCore;. Alphelys IMPASSE Поль Ланжевен, Плезир, Франция). Разделы (4 мкм толщиной) были вырезаны, депарафинировали и окрашивали с использованием стрептавидин-биотин технику иммунопероксидазой. Затем срезы инкубировали с анти-CD24 антитела человека поликлональных (1: 100 разбавленный, SC-7034, Санта Круз, США) и моноклональные антитела CD44 (1:50 разбавленный, MA1-81995; Thermo Fisher Scientific Inc., Чикаго , IL, USA), соответственно. 3, 3-диаминобензидин был использован в качестве хромогена. Срезы контрастному окрашиванию гематоксилином. Слайды, обработанных IgG изотипов вместо первичных антител использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашенные слайды были оценены независимо друг от друга двумя патологи (MJ и YW), которые были слепы к клиническим данным и результатам. Окрашивание интенсивность и процент клеток, окрашенных в определенной величины интенсивности были оценены с использованием широко принятую систему HSCORE. не HSCORE вычисляли с помощью следующего уравнения: HSCORE = ΣPi (I) (I = 0, 1, 2, 3, Pi = 0-100%), где I представляет собой интенсивность окрашивания, то есть, 0 = нет окрашивания, 1 = слабое окрашивание, 2 = умеренное окрашивание, 3 = сильное окрашивание. (Дополнительный файл 1: Рисунок S1) Фотографии ссылочных интенсивностей приведены в дополнительных данных. Учитывая, что Pi представляет процент окрашенных клеток по интенсивности колеблется от 0 до 100%, окончательный HSCORE варьировали от 0 до 300. Процентное содержание положительных клеток подсчитывали по меньшей мере, 50 полей путем анализа клеток, по меньшей мере 1000 под микроскопом, используя 40 × объектив. Уровни экспрессии CD24 и CD44 были классифицированы как отрицательные (HSCORE &Лт; 30) и положительный (HSCORE ≥ 30). Пороговые значения для CD24 и CD44 (HSCORE &ЛТ, 30) были изменены в соответствии с результатами предыдущих исследований [11, 15]
обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции количественно оценить CD24 и CD44
уровней экспрессии CD24. и CD44 мРНК определяли у 34 больных раком желудка. Вкратце, РНК экстрагировали из тканей желудка с использованием РНК-Isolation Kit (Axygen, CA, USA) в соответствии с руководящими принципами изготовителя. После лечения ДНКазы, первой цепи кДНК синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК (Roche, Базель, Швейцария). Количественная полимеразная цепная реакция CD24 (прямой праймер: AAA CAA CAA CTG GAA СТТ CAA GTA ACT C, обратный праймер: GGT GGT GGC ATT AGT TGG ATT T) и CD44v6 (прямой праймер: TCC CTG CTA CCA ATA GGA ATG ATG, обратный праймер : ГГТ САС TGG GAT GAA GGT CC), проводили с использованием системы освещения Циклование 480 (Roche). Глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) определяли количественно в качестве эндогенного контроля РНК (прямой праймер: ТГК ACC ACC AAC ТГК TTA GC, обратный праймер: GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG).
Определение H. Pylori
инфекции
образцы крови были собраны от 103 пациентов, чтобы определить наличие антихеликобактерной
инфекции перед хирургическим вмешательством. Сыворотка анти-Н. Pylori
IgG был обнаружен иммуноферментного анализа (Biohit, Хельсинки, Финляндия). Вкратце, образцы с титром выше порогового значения 30 EIU рассматривались как положительные для хеликобактерной
инфекции, как описано ранее [16].
Статистический анализ
The HSCOREs для экспрессии CD24 и CD44 были представлены в виде медианы (диапазон межквартильного). Манна-Уитни U, Крускала-Уоллиса Н, и Уилкоксона ранг испытаний были использованы для сравнения результатов между группами. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки общей выживаемости, а также различия выживаемости были проанализированы с использованием лог-рангового тестов. ЦОГ модели пропорциональных рисков была использована для расчета относительных рисков и соответствующие 95% доверительные интервалы (CI), с учетом возраста, пола, лимфоваскулярной инвазию и TNM постановки. Анализы проводились с использованием программного обеспечения SPSS 18.0 (SPSS Inc., США). Все статистические тесты были двусторонними и P
значения &л; 0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
уровней экспрессии CD24 и CD44 при раке желудка
CD24 и экспрессии CD44 были обнаружены в мембране раковых клеток в образцах рака желудка (рисунок 1). Слабое окрашивание как для CD24 и CD44 также наблюдалось в ядре клеток рака желудка. Все отрицательные контроли продемонстрировали незначительное фоновое окрашивание. Среди 77-парных образцах, CD24 (+) и CD44 (+) результаты окрашивания были обнаружены в 35/77 (45,5%) и 47/77 (61,0%) образцов желудочного рака, соответственно. Тем не менее, спаренные нормальные эпителиальных клеток желудка показали отрицательную экспрессию CD24 и CD44. Уровни экспрессии мРНК как CD24 и CD44, были значительно выше в иммуногистохимическое положительной по сравнению с иммуногистохимическим отрицательными группами. Уровни экспрессии мРНК CD24 и CD44 согласуются с результатами иммуногистохимических при раке желудка (рисунок 2). Рисунок 1 Визуализация CD24 и экспрессии CD44 в раковых клетках желудка с помощью иммуногистохимии. CD24 (А) и CD44 (В) иммунным в мембране желудочных клеток карциномы. Рисунок 2
уровни экспрессии мРНК CD24 и CD44. Количественное с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции, показали, что уровни CD24 (А) и CD44 (В) были значительно выше в иммуногистохимическое положительной по сравнению с иммуногистохимическим отрицательными группами, соответственно. *, P &
л; 0.001.
Корреляция между уровнями экспрессии /CD44 CD24 и клиникопатологическими параметров
Пациенты с лимфоваскулярной вторжения имели значительно более высокие показатели CD44 позитивности, чем без вторжения (P = 0.013
). CD24 и экспрессии CD44 уровни были также проанализированы в зависимости от возраста, пола, дифференцировки опухоли, глубина инвазии, метастазов в лимфатических узлах и стадии TNM. Тем не менее, не было никаких существенных различий в уровне экспрессии CD24 /CD44 по отношению к этим параметрам. Клинические характеристики испытуемых представлены в таблице 1.Table 1 CD24 и CD44 выражения в желудочных карцином в соответствии с клинико-патологическими параметрами

CD24 положительную скорость п (%) завод
P значение


CD44 положительную скорость п (%)

P значение


Гендер
Мужчина (n = 221)
92 (41,6)
0,148
133 (60,2)
0,835
Женский (п = 69)
22 (31,9) 45
(65,2)
Возраст (лет)
≤60 (п = 127 )
48 (37,8)
0,435
85 (66,9)
0,087
&GТ; 60 (n = 163)
69 (42,3) 93
(57,0) <бр> h.pylori
инфекции (п = 103)
положительная (п = 67)
24 (35,8)
0,096
48 (71,6)
0,815
отрицательный результат (п = 36)
19 (52,8) 25 (
69,4)
классификации Lauren
Кишечные типа (п = 104)
42 (40,3)
0,965
67 (64,4)
0,168
диффузного типа (п = 186)
77 (41,3)
103 (55,3)
классификации ВОЗ
папиллярной аденокарциномы (п = 4)
1 (25,0)
0,906
4 (100,0)
0,064
Трубчатые аденокарциномы
Ну (п = 1)
0 (0.0)
0 (0,0)
Умеренный (п = 98) 30
(30,6)
49 (50,0)
Плохо (п = 153)
47 (30,7)
87 (56,9)
муцинозные аденокарциномы (п = 27)
7 (25,9)
13 (48,1)
Плохой контакт сплоченные карцином (перстневидно клеточные карциномы) (n = 7)
1 (14.3)
1 (14.3)
лимфо-сосудистые Вторжение
При отсутствии (п = 134)
56 (41,8)
0,642
72 (53,7)
0,013
Present (n = 156)
61 (39,1) <бр> 106 (67,9)
TNM стадии
I (п = 23)
10 (43,5)
0,844
16 (69,6)
0,559
II (п = 47)
19 (40,4)
32 (68,1)
III (п = 187)
77 (41,2)
110 (58,9)
IV (п = 33)
11 (33,3)
20 (60,6)
вторжении
T1 (п = 9)
2 (22.2)
0,537
7 (77,8)
0,485
T2 ( п = 36)
14 (38,9) 22
(61,1)
T3 (n = 212)
85 (40,1)
132 (62,2)
T4 (п = 33)
16 (48,5)
17 (51,5)
узла метастаз лимфатических
N0 (п = 62)
27 (43,5)
0,445
40 (64,5)
0,534
N1 (п = 89)
39 (43,8) 49
(55,1)
N2 (п = 74)
24 (32,4) 47
(63,5)
N3 (п = 65)
27 (41,5) 42
(64,6)
Выживание
Выжил (п = 171)
62 (36,3)
0,089
96 (56,1 )
0.028
Умер (п = 119)
55 (46,2)
82 (68,9)
выражение CD44 было связано с плохой выживаемостью
Последующая информация была доступна для всех 290 пациентов в течение периодов 3-135 месяцев (в среднем 41 месяцев). Ни один пациент не умер от послеоперационных осложнений в течение 30 дней с момента начала периода исследования, но 119 (41,0%) пациентов умерли во время периода наблюдения. Общая продолжительность жизни была значительно больше в CD44 (-), по сравнению с CD44 (+) пациентов (рис 3А; лог-рангового, P
= 0,035). Хотя пациенты с CD24 (-) опухоли наблюдалась тенденция к более общей тенденции выживания, разница не была значимой (Рисунок 3B, лог-ранговый, P
= 0,115). TNM стадия и лимфоваскулярная вторжения были в значительной степени связано с послеоперационной выживаемости (рис 3C, D). Рисунок 3 Факторы, влияющие на общую выживаемость у больных раком желудка. Примечание значимой корреляции между экспрессией CD24 и общей выживаемости (B). Однако выражение CD44 (А), TNM постановка (С), и лимфоваскулярная вторжения (D) были в значительной степени связано с плохой выживаемости при раке желудка. Выражение
CD44 был независимым прогностическим маркером
После корректировки пола, возраста, ММН этап, и лимфоваскулярная вторжения, CD44 (+) пациенты имели значительно более высокий риск смерти от рака желудка, связанных по сравнению с CD44 (-) соотношение пациентов (шансов (OR) = 1,57; 95% ДИ: 1.05-2.36; P
= 0,029). По сравнению с пациентами, которые были CD24 (-) CD24 (+) пациентов имели более высокую вероятность более короткой общей выживаемости, хотя разница не было статистически значимым (OR = 1,41; 95% ДИ: 0.98-2.02; P = 0,065
) , Многофакторные анализы выявили экспрессию CD44, TNM стадии, и лимфоваскулярная вторжение в качестве независимых прогностических факторов плохой выживаемости пациентов при раке желудка (таблица 2) анализ .table 2 Многофакторный с Кокса модели для прогнозирования общей выживаемости у больных с желудочной
рака
относительный риск (95% ДИ)

P значение *


выражение CD44
Отрицательный (п = 112)
Reference
Положительный (п = 178)
1.57 (1.05-2.36)
0,029
выражение CD24
Отрицательный (n = 173)
Reference
Положительный (п = 117)
1.41 (0.98-2.02 )
0,065
TNM постановка
I (п = 23)
Ссылка
II (п = 47)
1.69 (0.46-6.24)
0,433
III ( п = 187)
4.32 (1.33-14.01)
0,015
IV (п = 33)
14.53 (4.27-49.41)
&л; 0,001
лимфа-сосудистой инвазии <бр> отсутствует (п = 134)
Reference
Присутствует (n = 156)
1.60 (1.09-2.35)
0,016
* Кокса модель пропорциональных рисков, с поправкой на пол, возраст, венозное просачивание , TNM постановка.
CD24 /уровни экспрессии CD44 и H. пилори
инфекции Helicobacter Pylori

инфекция была обнаружена у 67 из 103 (65,4%) больных раком желудка тестируемых. Тем не менее, не было никакой корреляции между H. пилори
инфекции и экспрессии CD44 (P
= 0,815), и никакой значимой связи между H. пилори
инфекции и экспрессии CD24 (P = 0,096
).
Обсуждение
Несколько недавних исследований были сосредоточены на диагностической и прогностической значимости экспрессии CD24 и CD44 в злокачественных опухолях человека [17-19], а также роль CD24 и CD44 в раке желудка были также исследованы [6, 11 , 20, 21]. Такахаши и др. сообщили, что CD24 повышающая регуляция была в значительной степени связано с глубиной инвазии и высокой патологической стадии в 173 больных раком желудка [22]. Частота экспрессии CD44 в развитии рака желудка колеблется в широких пределах от 31 до 72%. Ozmen и др. сообщили о значительном корреляции между CD44 сверхэкспрессии и периневральным вторжения и лимфатических узлов в позитивности рака желудка [23]. В настоящем исследовании одновременно анализировали уровни CD24 и CD44 экспрессии независимо друг от друга и показали, что положительное выражение CD44 в одиночку, но не CD24, был связан с плохой выживаемостью при раке желудка. Ни один CD24 (+) или CD44 (+), окрашивание не было обнаружено в нормальной поверхности желудка эпителия в настоящем исследовании, хотя Bessède и др. было детектировать экспрессию CD44 в нормальной слизистой оболочки желудка [12]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы объяснить это явное расхождение. CD24 является муцин типа glycosylphosphatidylinositol-сшитый белок клеточной поверхности, что выражается в развитии или регенерации тканей, а также при раке яичников и гепатоцеллюлярной карциномы [20, 24]. Предыдущее исследование корреляции между экспрессией CD24 /CD44 и рака желудка показало, что CD24 пациентов (+) имели более высокую вероятность рецидива рака желудка, чем CD24 (-) пациентов [11]. Тем не менее, биологическая функция CD24 в канцерогенезе остается неизвестным. Предыдущие исследования наблюдали взаимосвязь между высоким уровнем экспрессии CD24 и метастазов в лимфатических узлах, венозная инвазию и лимфатической вторжения. Тем не менее, хотя настоящее исследование показало тенденцию к более коротким выживания в CD24 (-) по сравнению с CD24 (+) пациентов, различие не было значительным. Дакворт и др. обнаружено экспрессии CD24 в париетальных клеток желудка и показал, что она регулирует апоптоз и ответ на Helicobacter фелис ​​
инфекции в модели мыши [25]. Тем не менее, данное исследование не выявило существенных связи между Helicobacter
выражения инфекции и CD24. Одним из возможных объяснений значимой связи между CD44 и выживаемости могут быть связаны с функцией стволовых клеток CD44 (+) клеток [26-29]. В 2009 году Takaishi и др. впервые продемонстрировали существование CD44 (+) клеток, наделенных свойствами стволовых клеток в опухолях желудка. Они сообщили, что CD44 (+) Клетки рака желудка показали характеристики стволовых клеток к самообновлению и способностью образовывать дифференцированное потомство и приводят к возникновению CD44 (-) клетки. Takaishi и др. далее проверено CD44 в качестве маркера клеточной поверхности желудка ЦОК в нескольких желудочных линий раковых клеток человека, и показано, что CD44 (+) Клетки рака желудка показали повышенную устойчивость к химиотерапией или радиационно-индуцированной гибели клеток [29]. Лю и др. сообщил, что CD44 был прямым и соответствующим нижестоящей мишенью MIR-34а при раке простаты. уровни белка CD44 были снижены в клетках сверхэкспресирующим MIR-34а, и сбить из CD44 функционально имитировал микроРНК-34а эффекты ингибирования развития опухолей и метастазов [30]. Поэтому мы считали, что выше, экспрессия CD44 в раковых клетках желудка может представлять собой более высокий процент ЦОК, что объясняет, почему CD44 (+) пациенты демонстрируют худшую общую выживаемость по сравнению с CD44 (-) пациентов. Дальнейшие исследования дает гарантию исследовать механизмы микроРНК регулирования ЦОНов.
Выводы
В заключение, экспрессия CD44 была связана с плохой выживаемости у пациентов с раком желудка. Это говорит о том, что CD44 может быть клинически полезным прогностическим маркером, а также может представлять собой полезный терапевтическую мишень. Тем не менее, функции CD24 и CD44 в канцерогенезе желудка остаются неясными [31, 33], и необходимы дальнейшие исследования для выяснения их роли.
Декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана Norman Bethune Программы Цзилинь университета [2013025], а Национальный фонд естественных наук Китая (81072369 и 81273065)
Электронный дополнительный материал
12876_2014_1181_MOESM1_ESM.pptx Дополнительный файл 1:. Рисунок S1: Photographies интенсивностей окрашивания CD44 иммуногистохимических: 0, 1 , 2 и 3. (PPTX 5 МБ) Авторы 'оригинальные файлы представлены для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинальных представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12876_2014_1181_MOESM3_ESM.pdf Авторского 12876_2014_1181_MOESM2_ESM.pdf авторов исходного файла для фигурного 2 12876_2014_1181_MOESM4_ESM.pdf Авторского исходного файла для фигурного 3 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Авторы " взносов
JJ и XC разработал исследование и провели большую часть исследования; JJ и XC написал первый вариант рукописи; DC проводили молекулярные эксперименты; HM выполнили эксперименты патологии; MJ, YW и FK анализировали патологические данные; DC, ZJ, и FK собирали клинические данные пациентов; JJ выполнил статистический анализ. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• В overmethylated гены Helicobacter Pylori-инфицированной слизистой оболочки желудка являются деметилируется в рака желудка
• Спонтанный разрыв желудка гигантской опухоли стромы в просвет желудка