Иммунизация с иммунодоминантном Helicobacter суис уреазы субъединицей B индуцирует частичную защиту от инфекции H. суис в мышиной модели

Иммунизация с иммунодоминантная хеликобактер суис
уреазы субъединицы B индуцирует частичную защиту от H. суис
инфекции в модели мыши
Аннотация
Helicobacter
(H.
) суис
является свиной и возбудитель желудка человека. Предыдущие исследования на мышах показали, что H. суис
инфекции не приводит к протективного иммунитета, в то время как иммунизация H. суис
целого клеточного лизата (лизат) защищает от последующей экспериментальной инфекции. Таким образом, двумерный гель-электрофорез из Н. зшз
белков осуществляли с последующим иммуноблоттингом с объединенными сыворотками из H. зшз
- инфицированных мышей или мышей, иммунизированных лизата. наблюдалась слабая реактивность против H. зшз
белков в пост-инфекции сывороток. Сыворотки из лизатов иммунизированных мышей, однако, показали, иммунореактивность против в общей сложности 19 белковых пятен, которые были идентифицированы с использованием LC-MS /MS. H. суис
уреазы субъединица B (UreB) показал наиболее выраженную реактивность в отношении сывороток от лизатов иммунизированных мышей и не был обнаружен с сывороткой от зараженных мышей. Ни один из объединенных сывороток не обнаружено H. суис
активирующий нейтрофилы белок А (Napa). Защитная эффективность интраназальной вакцинации BALB /с мышей с H. суис
UreB и Napa, как рекомбинантно выраженная в кишечной палочки
(rUreB и rNapA, соответственно), сравнивали с Г. суис
лизат. Все вакцины содержали холерный токсин в качестве адъюванта. Иммунизация мышей с rUreB и лизата вызвало значительное снижение H. суис
колонизацию по сравнению с невакцинированных H. суис
-infected управления, в то время как rNapA не оказало существенного защитного эффекта. Возможно, сочетание локальных ответов Th1 и Th17, дополненные реакции антител играют определенную роль в защитный иммунитет против H. зшз
инфекций.
Введение
Helicobacter
(H.
) суис
является мировым широкое распространение патогена, в основном колонизировать свиней. Инфекция с этим грамотрицательная бактерия была связана с язвами желудка не-железистой слизистой оболочки [1, 2] и вызывает гастрит и снижение суточный прирост массы [3] у свиней. H. суис
также наиболее распространенными без хеликобактер пилори Helicobacter
видов у людей, страдающих от заболеваний желудка [2] и свиньи могут служить источником H. суис
инфекции для человека [2, 4 ]. Контроль H. суис
инфекций с помощью антибактериальной терапии на основе не рекомендуется частично из-за повышенный риск развития приобрели устойчивость к противомикробным препаратам штаммов H. зшз
и у бактерий, принадлежащих к обычному свиных микробиоты [5]. Поэтому иммунизация против H. суис
может представлять собой ценную альтернативу. До сих пор, однако, немногие исследования касались вакцинации против этого свиного и зоонозных патогена.
Предыдущие исследования в мышиной модели показали, что H. суис
инфекция не приводит к защитного иммунитета, в то время как вакцинация на основе гомологичных (H. суис
) или гетерологичным (H. bizzozeronii
или H. cynogastricus
) цельноклеточная лизат вызывало уменьшение или даже полное очищение желудка колонизации с H. суис
[6]. Тем не менее, использование этого типа вакцин имеет свои недостатки, в том числе трудоемкий экстракорпоральное культуры Н. суис
, что приводит к трудности с получением достаточного антигена. Кроме того, в целом-клеточные лизаты могут содержать как защитные антигены и антигены, подавляющие защиты [7]. Эффективная вакцина субъединица может быть полезной альтернативой для управления H. зшз
инфекций. Immunoproteomics является подходящим подходом для быстрой идентификации кандидатов белков для вакцинации и применяется для изучения и разработки субъединичные вакцины для широкого спектра патогенных микроорганизмов [8].
Это была цель настоящего исследования, чтобы выбрать H. суис
белки, которые могут индуцировать защитный иммунитет против H. суис
инфекции. Таким образом, H. суис
белки, распознаваемые сывороткой мышей, иммунизированных H. суис
весь-клеточный лизат и защиту от инфекции, были идентифицированы с использованием двухмерного электрофореза (2D) гель с последующим иммуноблоттингом и LC-MS /МИЗ. Сыворотки H. зшз
- инфицированных мышей также были включены, поскольку инфекция не приводит к защите. На основе этого анализа, иммунореактивная H. суис
уреазы субъединица B (UreB) был выбран для дальнейшего тестирования в естественных условиях. В качестве контроля мы включили H. суис
активирующий нейтрофилы белок А (Napa), который был описан ранее в качестве возможного фактора вирулентности [9], но не был признан сыворотках мышей, иммунизированных цельного клеточного лизата. Впоследствии защитная эффективность против H. суис
инфекция обеих субъединиц вакцин была оценена и по сравнению с концентрацией H. суис
лизата в стандартной модели мыши.
Материалы и методы
бактериальный штамм
Во всех экспериментах, H. суис
штамм 5 (ТГ5, GenBank: ADHO00000000) был использован. Этот штамм был выделен из слизистой оболочки желудка свиньи в соответствии с методом, описанным Baele и др. [10].
Животные
За одну неделю до начала проведения экспериментов, пять-недельных Specific-патоген -бесплатно самок мышей BALB /с были получены от уполномоченного заводчика (HARLAN, Хорст, Нидерланды). Животных содержали на стерилизованных древесных стружек в фильтр верхних клетках. Кормили с автоклавного коммерческой диеты (Teklad 2018S, Харлан) и получил автоклавированы воду вволю
. Все лабораторные эксперименты на животных были одобрены Animal Care и комитетом по этике факультета ветеринарной медицины, Гентского университета по.
Immunoproteomics из H. суис

Двумерный гель-электрофорез (2D-PAGE)
ТГ5 выращивали, как описано ранее [11]. Бактерии собирали центрифугированием (5000 г
, 4 ° С в течение 10 мин) и промывают четыре раза сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS). Общее количество белков (как растворимые и нерастворимые белки) были извлечены в два этапа с использованием набора ReadyPrep ™ последовательного извлечения (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для того, чтобы получить хорошие результаты 2D-PAGE, гомогенаты обрабатывали с соответствующими добавками (5 мг ингибитора протеаз, 1 мкл ДНКазы I, 1 мкл РНКазы А, 10 ингибиторы мкл фосфатазы ФП2 и РР3 (Sigma-Aldrich, Стейнхейм, Германия) ). И, наконец, концентрацию белка определяли с использованием RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) и белки хранили при -70 ° С до дальнейшего использования. В общей сложности 100 мкг ТГ5 белков регидратации в 200 мкл буфера для регидратации (7М ureum, 2М thioureum, 2% CHAPS, 0,2% амфолит носитель pH3-4, 100 мМ дитиотреитола (ДТТ) и бромфеноловый синий). Образцы были пассивно абсорбируется в ReadyStrip (11 см, PH3 до pH 10, Bio-Rad) и Изоэлектрическая фокусирование проводили в многогранной ИЭФ камерным (Bio-Rad), как описано ранее [12]. После Изоэлектрическая фокусировки полоски уравновешивали в течение 15 мин в 1,5% DTT в равновесном буфере (50 мМ Трис HCl, рН 8,8 6 М мочевины, 20% глицерина, 2% ДСН) с последующим другим уравновешивания в 4% иодацетамидом в равновесном буфере. Гель-электрофорез проводили на 10% Трис HCl SDS-PAGE с использованием 150В в течение 30 мин с последующим 200В в течение 1 ч. Два гели проходили параллельно: один окрашивали Sypro® рубин Протеин Гель для окрашивания (Bio-Rad), в то время как другой был использован для иммуноблоттинга (см Вестерн-блоттинга описано ниже). Перед окрашиванием, гели фиксировали в 10% MeOH, 7% -ной уксусной кислоты. После окрашивания H. SUIS
белки визуализировали с помощью VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
Бассейны
Сыворотка Три бассейна сывороток мыши были использованы в этом исследовании:.

Сыворотки мышей, иммунизированных Х. суис
целого клеточного лизата (далее именуемой "лизатов иммунизированных мышей") (п
= 10). Эти животные были привиты интраназально дважды с интервалом в три недели с 100 мкг HS5 лизата + 5 мкг холерного токсина (СТ) (Список Биологическое Laboratories Inc., Мэдисон, штат Нью-Джерси, США). ТГ5 лизат получали, как описано выше, но без окончательной фильтрации супернатанта [6]. Через три недели после последней иммунизации собирали кровь и сыворотку собирали. Этот протокол иммунизации было показано, что (частично) защитное против H. суис
вызов [6] и защитный эффект был подтвержден здесь в предварительном эксперименте (данные не показаны).

<Литий> Сера от H. суис
-infected мышей (далее именуемые "зараженных мышей") (п
= 10). Эти животные были привиты внутрижелудочно с 200 мкл Brucella бульона при рН 5, содержащий 10 8 свежеприготовленные H. суис
бактерии [11]. Через четыре недели после заражения, отбирали кровь и сыворотку собирали.

<Литий> Сера из отрицательных контрольных мышей (п = 10
). Эти животные получали HBSS интраназально дважды с интервалом в три недели с последующим внутрижелудочного инокуляции 200 мкл бульона Brucella при рН 5 (4 недели после последней иммунизации мнимого). Через четыре недели, собирали кровь и сыворотку собирали.


Все Сыворотку хранили при -70 ° С до дальнейшего использования.
Вестерн-блоттинга
Белки electrotransferred из гелей на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad), как описано в другом месте [12]. Мембраны блокировали в 5% обезжиренное молоко в фосфатно-солевом буфере (PBS) (блокирующем буфере), инкубировали в течение ночи (ON) с разведенной мышиной сывороткой (1/100 в блокирующем буфере) при комнатной температуре (RT), промывали в PBS с 0,3% твин-20 (промывочный буфер) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с стабилизировалось козий анти-мышиного иммуноглобулина G (IgG), хреновый-пероксидазы (HRP) (1/1000 в блокирующем буфере, Pierce, Rockford, IL, USA). После стадии промывки в промывочном буфере, иммунологического белков проводили с помощью улучшенного обнаружения хемилюминесценции с использованием SuperSignal West Dura Extended Длительность субстрата (Pierce). Белковые образцы были отсканированы и оцифрованы с помощью Imaging System VersaDoc. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.
In-гель усвоению белков и идентификации с помощью масс-спектрометрии
В геле был выполнен переваривание белков, как описано Cheung и др. [13]. До масс-спектрометрии выделенные пептиды были разделены на U3000 нано-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Dionex, Саннивейл, Калифорния, США), как описано ранее [14].
Идентификация пептидов проводили с использованием электрораспылением ионизация квадрупольный время пролета масс-спектрометрии (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA), как описано ранее [14]. Анализ данных проводили по отношению к Helicobacter
базе белка из NCBI (146 612 записей) с использованием в доме поисковой Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, Лондон, Великобритания). Ошибка терпимая поиска была выполнена с carbamidomethyl (C) в качестве фиксированной модификации. Carbamidomethyl (N-терминал) и окисление (М) были установлены в качестве модификаций переменных. Пептид масса терпимости и фрагмент массовой толерантности был установлен на уровне 0,35 и 0,45 Da Da, соответственно. Максимум два miscleavages были разрешены. Белки были рассмотрены только правильно аннотированный, когда значение было ниже 0,05 (р
≪ 0,05) и по меньшей мере один пептид, прошли необходимые красным жирным шрифтом критерии из Mascot Daemon, что указывает, что по меньшей мере один пептид имел ранг 1 и значение ниже 0,05.
одномерный гель-электрофорез (1D-PAGE) и Вестерн-блоттинга rUreB
1D-PAGE 10 мкг рекомбинантного H. суис
уреазы субъединицей B (rUreB) проводили, как описано Ван Steendam и др. [12]. подготовка Сыворотки и Вестерн-блот-анализы проводили, как описано выше.
Защитная эффективность рекомбинантного H. зшз
белков в мышиной модели
Получение рекомбинантного UreB
A фрагмент, кодирующий Х. суис
последовательность UreB (GenBank локус тег HSUHS5_0285) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Pwo полимеразы с активностью корректуры (Roche, Mannheim, Германия) с ДНК ТГ5 (прямой праймер: 5'-ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA ТАТ G -3 '; обратный праймер: 5'- CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC-3') и клонировали в вектор экспрессии белка пет-24d. RUreB выражалось в E.coli штамма
BL21 (DE3). Клетки лизировали путем обработки ультразвуком (5 раз в течение 30 с) в буфере, содержащем 50 мМ Na.PO <суб> 4 Ph7, 0,5 М NaCl, 1 М DTT, 1% Тритон Х-100 и 1 мМ PMSF. После центрифугирования (4 ° C, 20 000 г
в течение 30 мин), rUreB очищали из растворимой фракции с использованием никель-аффинной хроматографии в буфере, состоящем из 1 М NaCl, 50 мМ PBS, 1% Triton X-100, 250 мМ имидазола и 10% глицерина (Его GraviTrap, GE Healthcare Bio-наук AB, Уппсала, Швеция) с последующей гель-фильтрации на Superdex ™ 200 HR 16/60 колонку (GE Healthcare Bio-наук AB). После очистки rUreB анализировали с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блот-анализ с использованием анти-гексагистидиновый-тег мышиное моноклональное антитело (Icosagen Cell Factory, Тарту, Эстония). Моющее средство Тритон Х-100 был удален из очищенного rUreB с помощью Pierce моющих средств для удаления Spin Columns (Pierce) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрацию белка определяли с RC DC
белка анализ (Bio-Rad).
Получение рекомбинантного Napa
выразилось белка в E.coli,
Expression System с Gateway® Technology (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) следующим образом. Фрагмент, кодирующий H. суис
активирующий нейтрофилы белок А (Napa) последовательности (GenBank, локус тег HSUHS5_0014) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Pwo-полимеразы с активностью корректуры (Roche) из ДНК ТГ5 (прямой праймер: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; обратный праймер: 5'-TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC-3') и клонировали в ™ /TEV /D-TOPO® вектор pENTR и переносили в вектор назначения pDEST17 ™. Выбранный pDEST17-Напе плазмиду трансформировали в BL21-AI ™ кишечной палочки
и затем выращивали при 37 ° С до OD <югу> 600 0.6-1.0 в Лурии в бульоне с добавлением 50 мкг /мл карбенициллина. Рекомбинантный H. суис
выражение Napa (rNapA) индуцировали добавлением 0,2% L-арабинозы. После 4 часов инкубации при 37 ° С, клетки собирали и ресуспендировали в буфере для лизиса: 50 мМ Трис HCl, 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,2 мг /мл лизоцима, 20 мкг /мл ДНКазы, ингибитор 1mM протеазы (Sigma), и 1mM MgCl <югу> 2. Клетки лизировали путем обработки ультразвуком (5 раз в течение 30 секунд). Остатки клеток и тела включения выделяли центрифугированием при 4 ° С (20 000 г
в течение 30 мин). Тела включени были последовательно промывали дважды основаны на следующей методике: осадок ресуспендировали в холодном буфере для лизиса, обрабатывали ультразвуком в 5 раз, в течение 30 с с последующим центрифугированием (4 ° C, 20 000 г
в течение 30 мин). Промытые тельца включения солюбилизировали в буфере для связывания, рН 8 (6 М HCl, guanidium, 20 мМ Трис HCl, 0,5 М NaCl, 5 мМ имидазола, 1 мМ β-mercaptomethanol) при осторожном вращении в течение 1 часа при комнатной температуре. Нерастворимый материал был удален путем высокоскоростного центрифугирования при 4 ° С (100 000 г
в течение 30 мин). rNapA очищали из осветленной супернатанта на колонку Ni-сефарозой (Его GraviTrap, GE Healthcare Bio-наук AB) в соответствии с инструкциями изготовителя. rNapA элюируют буфером для элюции, рН 8 (8 М мочевины, 20 мМ Трис HCl, 0,5 М NaCl, 0,5 М имидазола и 1 мМ бета-меркаптоэтанола) и диализовали против PBS при 4 ° С. Затем rNapA анализировали с использованием SDS-PAGE и концентрация белка была определена с использованием RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Эксперименты Иммунизация и инфекции
Экспериментальный дизайн обобщены на рисунке 1. Пять групп 10 мышей интраназально инокулировали в два раза с интервалом в 3 недели, каждый раз с 17,5 мкл посевного материала. В группах 1, 2 и 3 прививочный состоял из HBSS с добавлением 5 мкг КТ, содержащей 30 мкг rUreB, 30 мкг rNapA и 100 мкг ТГ5 лизат соответственно. Группы 4 (фиктивный иммунизированных группа) и 5 ​​(отрицательный контроль) были привиты с HBSS. Через три недели после того, как второй интраназальной иммунизации, кровь собирали хвост кровотечение из пяти животных на группу и одну неделю спустя, все животные, кроме отрицательной контрольной группы, были привитых внутрижелудочно с 200 мкл Brucella бульона при рН 5, содержащий 10 8 жизнеспособные H. SUIS
бактерии [11]. Отрицательная контрольная группа засевают внутрижелудочно с 200 мкл бульона Brucella при рН 5. Через четыре недели после внутрижелудочного прививки мышей подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков следующим изофлуран анестезии (IsoFlo; Abbott, IL, USA). Из умерщвленных животных, кровь собирали путем пункции сердца стерильной, центрифугировали (1000 г
, 4 ° С, 10 мин) и сыворотку замораживали при -70 ° С до дальнейшего использования. Желудки были вырезаны и рассекали вдоль большой кривизны. Половина из желудков, в том числе антральном и глазного дна, сразу же помещали в 1 мл РНК Позже (Амбион, Остин, Т.Е., США) и хранили при -70 ° С для дальнейшего РНК- и ДНК-экстракции. Продольная полоска ткани желудка была вырезана из пищевода в двенадцатиперстную кишку вдоль большой кривизны для гистопатологического исследования. Рисунок 1 Экспериментальный дизайн исследования вакцинации. В каждой группе 10 мышей, иммунизированных интраназально дважды с интервалом в 3 недели, каждый раз с 30 мкг rUreB + 5 мкг холерного токсина (КТ); 30 мкг rNapA + 5 мкг КТ и 100 мкг ТГ5 лизат + 5 мкг CT (группы 1, 2 и 3, соответственно). Группы 4 (фиктивный иммунизированных группа) и 5 ​​(отрицательный контроль) были интраназально инокулировали HBSS. Через три недели после второй иммунизации, собирали кровь из 5 мышей на группу и одну неделю спустя мышей групп 1, 2, 3 и 4 были внутрижелудочно инокулированных 108 жизнеспособных H. суис
бактерий. Группа 5 была внутрижелудочно засевают HBSS. Через четыре недели после внутрижелудочного заражения мышей умерщвляли.
Количественное определение Х. суис
в желудке
После оттаивания ткани желудка гомогенизировали (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Germany) в 1 мл Tri Reagent® RT (MRC, Бруншвиг Chemie, Амстердам, Нидерланды) и ДНК экстрагировали из внутри- и органической фазы в соответствии с инструкциями Tri Reagent® RT производителя. Бактериальной нагрузки в желудке определяли с помощью ранее описанных H. суис
конкретное количественное ПЦР в реальном времени (КПЦР) [5].
Анализ желудка цитокинового ответа
уровни экспрессии IFN-gamma, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17 и ФНО-α оценивали с помощью кПЦР с использованием кДНК, синтезированные из ткани желудка, как описано ранее [15]. Порогового цикла значения (Ct) были нормированы на среднее геометрическое Ct-значения из опорных генов, после чего нормализуемых уровни мРНК были рассчитаны с использованием 2 -ΔΔCt метод [16].
Измерение ответов антител в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа (ELISA)
Белок детектор ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) использовали для оценки rUreB-, rNapA- и ТГ5 лизата специфический IgG в сыворотке. Вкратце, 96-луночные планшеты с плоским дном (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Рочестер, штат Нью-Йорк, США) покрывали 2 мкг /лунку очищенного rNapA, 1 мкг /лунку очищенного rUreB, или 1 мкг /лунку H. SUIS
целые белки клетки разводили в 100 мкл буфера для нанесения покрытия (24 ч, 4 ° C). После блокирования 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS, 100 мкл 1/400 разбавленной сыворотки добавляли в каждую лунку. После дополнительной промывки, 100 мкл HRP-меченого антитела против мышиного IgG (H + L) в конечной концентрации 50 нг на лунку добавляли. Через пять минут после добавления 2,2'-Азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) раствора субстрата пероксидазы (ABTS), оптическую плотность считывали при 405 нм (ОП <суб> 405нм).
Гистопатологические исследования
продольные полосы желудочные ткани фиксировали в 4% фосфатно-буферном растворе формальдегида, обрабатываются с помощью стандартных процедур и заливали в парафин. Для оценки гастрит, гематоксилин - эозином (HE) окрашенные срезы 5 мкм вслепую забивали на основании степени инфильтрации лимфоцитов, плазматических клеток и нейтрофилов, с использованием визуальной аналоговой шкалы, похожий на Обновленном Sydney система (по шкале от 0- 3) [17] со следующими характеристиками для каждого балла гастрит: 0 = нет инфильтрацию одноядерных и /или полиморфноядерных клеток; 1 = легкая диффузная инфильтрация одноядерных и /или полиморфноядерных клеток; 2 = умеренное диффузное инфильтрацию мононуклеарных и /или полиморфно-клеток и /или при наличии одного или двух воспалительных агрегатов; 3 = отмечен диффузная инфильтрация одноядерных и /или полиморфноядерных клеток и /или присутствии, по меньшей мере, трех воспалительных агрегатов.
Статистический анализ
нормальности и дисперсия гомогенность данных анализировали с помощью Д'Агостино-Пирсона и Шапиро Wilk тест нормальности. Значительные различия в H. суис
колонизации и экспрессии мРНК цитокинов между группами оценивали путем выполнения односторонней ANOVA анализа. тест множественного сравнения Бонферрони был использован в качестве ретроспективном, когда были оценены равные дисперсии. T3 тест ретроспективном Даннета был использован, когда не были оценены не равные дисперсии. OD <суб> уровни 405nm от ELISA и гистологических показателей воспаления сравнивали с помощью анализа Крускала-Уоллиса, сопровождаемый Mann-Whitney U
тест. Для корреляций между различными переменными, рассчитывали коэффициент Rho Спирмена (ρ
). GraphPad Prism5 программное обеспечение (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, США) использовали для всех анализов. Статистически значимые различия между группами были рассмотрены на р
&ЛТ; 0.05.
Результаты
Immunoproteomics Х. суис

H. SUIS
белки были разделены на 2D-PAGE (рис 2а). После того, как 2D-иммуноблоттинга с объединенными сыворотками из лизата-иммунизацию (рис 2b) или H. суис
-infected животных (рис 2С), были выбраны в общей сложности 19 иммунореактивного белка пятен. Эти пятна были сопоставлены с белком пятна, которые можно было увидеть в параллельной 2D-PAGE (рис 2а). наблюдалась Литтл реактивность против H. зшз
белков в пост-инфекции сывороток по сравнению с высокой реакционной способностью в отношении сывороток от лизатов иммунизированных мышей. Когда блот зондируют пула сывороток, полученных из отрицательных контрольных мышей не конкретных иммунореактивный белок пятна не были обнаружены (дополнительный файла1). Пятна интерес (п
= 19) вырезали из геля, переваривали и идентифицированы с помощью анализа ЖХ-МС /МС. Подробные результаты этих белков приведены в таблице 1. Пятна с самой высокой реакционной способностью (спот от 1 до 5) были определены как UreB. H. суис
шаперонина GroEL, проиллюстрирована в виде пятен 9 и 10 на рисунке 2а, показал также сильную гибридизацию с сыворотками из лизатов иммунизированных животных. Кроме того, сыворотка из лизатов иммунизированных мышей показали сильную реактивность против уреазы вспомогательного белка (UreH) и уреазы субъединица A (мочевина) (пятна от 15 до 19), который был менее выражен в инфицированной группе. Слабая реакционная способность по отношению к основной флагеллина Flaa (видит, от 11 до 13) присутствовал в обоих клякс. Рисунок 2 H. суис 2D-протеом профиль (A) и Вестерн-блоттинг дубликата 2D-гель подвергают взаимодействию с объединенными сыворотками лизата иммунизированных мышей (B) или H. суис -infected мышей (C). 100 мкг общего экстракта белка H. суис
разделяли с помощью 2D-электрофореза с использованием линейного градиента PH3 до10 в первом измерении и 10% Трис HCl SDS-PAGE во втором измерении. Разделенные белки были обнаружены с помощью белка окрашивания SYPRO®Ruby. В штучной упаковке области показывают, где иммунореактивных антигенов вырезали из геля и подвергали LC-MS /MS. Выявленные белки обозначены были идентифицированы как UreB спот номеров приведены в таблице 1. Ящики и цифры в красном цвете. Положение молекулярной массы (MW) дается справа, и рН дается в нижней части.
Таблица 1 иммунореактивного белки H. SUIS идентифицированы LC-MS /MS
спот № 1

название белка

NCBI ID2

Gene

PI3

MW3

No. совпадающая пептиды

Mascot score4

COV. (%) 5
1
Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
117
1589
72
2
Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
80
1042
58
треонил-тРНК синтетазы
EFX41598
THRs

6,34
69,315
7
186
60 страница 3 Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB
<бр> 5,97
62,967
80
903
46 4
Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
4
103
6 страница 5 Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB

5,97
62,967 4
103
6
6
30S рибосомальной белка S1
EFX42427
РАПН

8,29
64,051
23
625
28
хинон-реактивный Ni /Fe гидрогеназная, большая субъединица
EFX41851
hydB

8,22
64,943
19
520
28
уреазы из H. heilmannii

AAA65722
8,86
25,844
8
258
26
7
метил-прием хемотаксиса белка
EFX43528
7.1
48.907
35
905
50
8
фактор элонгации G
EFX41637
Fusa

5,15
77,242
57
1066
55
9
шаперонина GroEL
EFX42237
GroEL

5,58
58,498
150
3085
78
10
шаперонина GroEL
EFX42237
GroEL

5,58
58,498
135
2647
73
Уреазный субъединица B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
43
682
41
11
Флагеллин
EFX41982
Flaa

7,77
54,232
29
756
47
12
Флагеллин
EFX41982
Flaa

7,77
54,232
57
1294
62
13
Флагеллин управлением
EFX41982
Flaa

7,77
54,232
46
1085
63
пусковым фактором
EFX42378
ВИГ <бр>
5,13
49,587
12
343
24
14
гидрогеназная выражение /образование белка
EFX41790
hypB

5,59 <бр> 27,617
15
314
35
никотинат-нуклеотид пирофосфорилазы
EFX42191
NADC

6,46
30,591
11
219 <бр> 25
7-альфа-гидроксистероиддегидрогеназы
EFX41880
6,62
28.246
6
186
24
гипотетическая секретируемый Под сохранением белка
EFX42511
hdhA

5,84
28,011 страница 5 из 174
19
гипотетический белок HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
пероксиредоксин
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
Уреазный аксессуары белок
EFX42255
ureH

6,79
30,447 4
106
13
16
Уреазный субъединица
EFX42255
Мочевина

7,79
27,389
24
270
55
17
Уреазный субъединица
EFX42255
Мочевина

7,79
27.389
28
112
45
18
Уреазный субъединица
EFX42255
Мочевина

7,79
27,389
57
418
69
19
Уреазный субъединица
EFX42255
Мочевина

7,79
27,389
75
568
73
1 протеин пятно, соответствующее положение на геле и помарок ( Рисунок 2)
2NCBI
:.. Национальный центр информации по биотехнологии
3 Теоретическая изоэлектрическая точка (ИЭТ) и молекулярная масса (MW)
4 для хеликобактером
данных, Mascot баллов больше. чем 40 являются значимыми (р
≤ 0,05).
5% от белковой последовательности, охватываемого пептидов идентифицировал.
Подтверждение сыворотки реактивности против rUreB продажу из 2D-анализа, UreB показали отличную реактивность с сыворотками от лизатов иммунизированных мышей, которые не наблюдали в сыворотках от неиммунизированных но инфицированных мышей. Для того чтобы подтвердить эти показатели, 1D-страницы загружаются с rUreB была выполнена, с последующим иммунологического с сывороткой лизатов иммунизированных и H. зшз
-infected мышей. 0.01. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Характеристика профилей экспрессии генов для различных типов тучных клеток объединенных из субрегионов жел…
• Клинико-патологическими характеристики и прогностическое анализ Lauren классификации аденокарциномы желудка …