Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: MED30 Reguluje proliferáciu a Pohyblivosť rakovina žalúdka Cells

abstraktné

MED30 je základným členom mediátorov komplexu, ktorý tvorí rozbočovač medzi zápisu a aktivátory a RNA polymerázy II. Avšak, výrazy a úloha MED30 boli zle vyznačujúci sa tým, rakoviny. V tejto štúdii sme skúmali funkčné role MED30 počas progresie rakoviny žalúdka. Bolo zistené, že MED30 bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka tkanivách a bunkových líniách. Okrem toho, že nadmerná expresia MED30 zvýšilo proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo MED30 knockdown inhibuje tieto účinky. Ďalej knockdown významne inhibujú tumorigeničnosti u SCID myší. MED30 tiež podporoval výrazy génov spojených s epitelové-mezenchymálnych prechodu a indukuje fibroblastov-ako morfológia. Táto štúdia ukazuje, MED30 má patologické úloha v množenia sa, migrácie a invázie nádorových buniek žalúdka a navrhuje, aby MED30 by mala byť vnímaná ako silný terapeutický cieľ pre zhubný karcinóm žalúdka

Citácia: Lee YJ Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Reguluje proliferáciu a Pohyblivosť žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10,1371 /journal.pone.0130826

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Spojené štáty

Prijaté: 22. septembra 2014; Prijaté: 26. mája 2015; Uverejnené: 25. júna 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) a základná vedecká nadácia pre výskum (2012R1A1A3010521) Národná nadácia pre výskum (NRF) financovaného kórejskou vládou (MEST) a grantom z Národného R &D program na kontrolu nádorových ochorení, Ministerstvo zdravotníctva, sociálnej starostlivosti a rodinné záležitosti, Kórejská republika (0920050). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu na celom svete [1, 2]. Približne 95% karcinómov žalúdka sú adenokarcinómy a v epidemiologických štúdiách je rakovina žalúdka bol klasifikovaný anatomickú ako kardio /proximálnej alebo noncardia /distálnej [3] a histologickým fenotyp ako črevnú, difúzny, alebo zmiešané /Neklasifikovateľné, ako je popísané Lauren [4 ]. Okrem toho, u pacientov s karcinómom žalúdka proximálnej majú horšie prežitie nezávisle na TNM fáze [5]. Helicobacter pylori
infekcie bolo preukázané, že je etiologickým agens rakoviny žalúdka, najmä rakoviny nájdené v distálnych žalúdka u starších mužov, ktoré sú zvyčajne črevné typu. V poslednej dobe bolo navrhnutých niekoľko molekulárnej klasifikácie rakoviny žalúdka na základe zistení z celého genómu génovej expresie štúdií a /alebo počtu kópií génu štúdiách [6-10].
Regulácia

transkripcie je rozhodujúcim krokom, ktorý ovláda bunky identity, rastu, diferenciácie a vývoja. Ľudský mediátor (MED), komplex, ktorý obsahuje 30 ~ bielkoviny, je kľúčovým koaktivátor /aktivátor z výrazov RNA polymerázy II (Pol II) -transcribed génov [11]. MED komplex uľahčuje montáž pre-iniciačný komplex (PIC) interakcií s Pol II a gén špecifických transkripčných faktorov (TFS), ako je napríklad, tri, TFIIB, triedy, tri, TFIIF a TFIIH [12, 13]. MED komplex sa skladá z troch rozdielnych štrukturálnych submodulov (hlava, strednej a chvost). Modul hlava priamo interaguje s Pol II, zatiaľ čo predĺžený zadný modul interaguje s regulačnými proteínmi génovo špecifických [12, 13], a prostredný modul pôsobí v regulačnom prenosu signálu v post-väzbové fáze [13]. Hoci mechanizmus nie je celkom známy, MED komplex pevne viaže na Pol II, zmení jeho konformácii a ovplyvňuje proces iniciácie transkripcie [14, 15]. Vzhľadom k tomu, MED komplex je nevyhnutnou súčasťou transkripčného strojového zariadenia, väčšina z podjednotiek v jadre MED sú nutné pre embryonálny rast a životaschopnosť buniek [16].

Cancer genómu štúdie sekvencovania uvádzajú mutácie alebo zmeny v RNA prepis stroje zložky obsiahnuté v MED podjednotky a korelácia medzi niektorými z týchto zmien v MED podjednotky (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8 a cyklin C) a progresie rakoviny boli hlásené u rôznych druhov rakoviny, aj keď mechanizmy zodpovedné za tieto korelácie sú neznáme [17].

Nedávno bolo oznámené, že MED19 môžu podieľať na progresiu rakoviny žalúdka, ako jeho knockdown významne inhibovala proliferáciu buniek a kapacita kolónie-formácie, a vyvolané G1 fázy bunkového cyklu zatýkacom v dvoch ľudských žalúdočných rakovinových bunkových línií (SGC7901 a MGC803) [18]. Avšak, funkčné role a patologické relevantnosti ostatných MED podjednotiek v karcinómu žalúdka, zostávajú nejasné.

V tejto štúdii, odhaliť funkčný význam MED30 počas progresie rakoviny žalúdka, sme sa zaoberali jeho úlohu v proliferácii, migrácii, invázie a karcinogenity buniek karcinómu žalúdka. Pred funkčné vyšetrenie, kontroluje sme expresného profilu MED30 v rakovinových bunkách a tkanivách žalúdka.

Materiály a metódy

Bunkové kultúry a transfekcia

žalúdočné nádorových bunkových línií (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 a N87) boli zakúpené od kórejskej bunkové línie Bank (Soul). Bunky boli kultivované v RPMI 1640 doplnenom 25 mM HEPES, 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS) a 100 ug /ml penicilínu /streptomycín (1 x P /S) v 5% CO 2/95% vzduchu pri teplote 37 ° C ° C. Bunky boli transfekovány s použitím siRNA DharmaFECT činidla 1 alebo 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), podľa inštrukcií výrobcu. Sekvencia siRNA boli nasledovné: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Kórea) 5'-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 ', 5-GCU GCC AAA UGG UGU CAC U (dTdT) - 3 'a 5'-CGA GAA auu GCU GAA GUA a (dTdT) -3'; miešaná (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5 'GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3'.

MED30 nadmerná expresia

Aby bolo možné postaviť MED30- cez expresné vektor, sme použili pLenti6.3-V5 /DEST lentivirovým vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stručne povedané, MED30 cDNA bol klonovaný do pLenti6.3-V5 /DEST vektora pomocou in vivo rekombinácie
na báze klonovacia systém Brána (Invitrogen). Vektor darcu (pDONR221) obsahujúci kódujúci sekvenciu MED30 (MED30 cDNA) bol zakúpený od Ultimate TM ORF Klony (Invitrogen), a znovu spojí s protiprúdom-voliteľný ccdB
génu Gateway cieľového vektora pLenti6.3-V5 /DEST pomocou LR Clonas zmesi enzýmov (Invitrogen). Prázdny vektor pLenti6.3 /V5-DEST bola použitá ako falošný kontrolu. Rekombinantný lentiviry boli produkované v bunkách 293FT, a použité pre infikovanie SNU638 bunky v súlade s pokynmi výrobcu (ViraPower Lentivirový Expression System; Invitrogen). Stabilné bunkové línie boli vytvorené selekciou s blasticidin (7,5 ug /ml) (Invitrogen).

Real-time PCR

rakovina žalúdka tkaniva boli získané po získaní písomného informovaného súhlasu pacientov, ktorí podstúpili chirurgický resekcia u Pusan ​​National University Hospital alebo Pusan ​​National University Hospital Yangsan. Štúdia bola schválená Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) a Pusan ​​National University Hospital Yangsan-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Celková RNA bola extrahovaná z tkanív alebo buniek za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) alebo RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), podľa návodu výrobcu. cDNA sa syntetizuje za použitia MMLV reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI), dNTP, a oligo-dT primérov. Sekvencie primérov boli nasledovné: MED30, 5'-ACC GMT TAA CAA AGC TAC AGG -3 "(sense) a 5'-TAA GTT GCT CGA GAA CTG TGG G-3 '(antisencie); CDH1, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'a 5'-CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3'; CDH2, 5'-CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA-3 'a 5'TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3'; CDH3, 5 'CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC-3' a 5'ACG CCA TGG CGC TGA GTT GG -3 '; TWIST1, 5'-CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 'a 5'TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3'; TWIST2, 5'-CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT-3 'a 5'-TAG CCA AGC AAT CAC GGA GA -3'; VIM, 5'-TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G-3 'a 5'-TAG CAG CTT CAA CAA CGG AGT TC -3'; SNAI1, 5'-GAG GTG GCG GCA GAC TAG-3 'a 5'-GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3'; SNAI2, 5'-TAG GAA GAG ATC TGC CAG AC-3 'a 5' CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3 '; GAPDH, 5'-GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3 'a 5'TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3'. Real-time PCR bola vykonaná za použitia LightCycler TM 96 real-time PCR systému (Roche, Nutley, NJ, USA) s FastStart DNA Essential Green Master (Roche), podľa inštrukcií výrobcu. GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola.

Western blot analýza

Bunky boli Lyžovanie pufrom RIPA, pridá sa inhibítor proteázy koktail, a koncentrácia proteínu boli stanovené pomocou testu Bio-Rad proteín kit (na bio-Rad, Hercules, CA). Vzorky (80 ug /jamku) boli podrobené SDS-PAGE a potom prenesené na PVDF membrány. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech§87-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ181, San Jose, CA), anti-N-cadherin (1 : 1000, BD Bioscienceɢ920), anti-P-kadherin (1: 1000, BD Bioscienceɢ227), anti-Twist1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) a anti-β-aktínu (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778), protilátky boli nariedia v 5% odstredeného mlieka a inkubuje s membránami pri teplote 4 ° C cez noc. Zodpovedajúce sekundárne protilátka bola použitá (1: 2000, s chrenovou peroxidázou konjugovanou anti-myšou alebo anti-králičie) pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. detekcia chemiluminiscencie (GE Health Care Little Chalfont, Veľká Británia) bol použitý pre vizualizáciu MED30, E-cadherinu, N-cadherin, P-cadherin, Twist1, vimentin, a β-aktínu. Western blot analýza bola vykonaná trikrát.

Imunohistochémia

mikroskopické sústavy tkanív sekcie obsahujúce rakovina žalúdka tkaniva od pacientov boli získané z SuperBiochip (Soul). Histopatologické diagnózy boli vykonané na oddelenie patológie, Pusan ​​National University Hospital a patologickým staging bola vykonaná za použitia klasifikácie TNM (AJCC, 7. ed.). Všetci pacienti mali histologicky potvrdené rakovinu žalúdka, a vzorky nádorov boli kontrolované, aby sa zabezpečilo, že nádorové tkanivá sa skladá viac ako 80% vzoriek. Pre imunohistochémia boli rezy deparafinizovány a rehydratované, spracuje sa s 0,3% peroxidu vodíka po dobu 30 minút, aby sa uhasiť endogénnej peroxidázy, a blokované 10% normálnej somárov sérum (NDS) a 1% BSA v 1 x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Sklíčka bola potom inkubovaná cez noc pri 4 ° C v blokovacím pufri, ktorý obsahuje primárne protilátka (anti-human MED30, 01:50, Proteintech). Sekundárne protilátka (HRP-konjugovaná) väzba bola vykonávaná pri riedení 1: 200 v blokovacom pufri po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Sklíčka sa potom zafarbené na HRP (Vector Laboratories) a kontrastne hematoxylínom farbenie pufra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) po dobu 1 min. Percentuálny podiel buniek, ktoré farbia MED30 v časti boli stanovené a Rezy potom boli odstupňované na škále 1-4 (1, < 24%, 2, 25 až 49%, 3, 50 až 74%, 4, 75 - 100% ). Intenzity farbenie nádorových buniek bola hodnotená ako 0, 1, 2, alebo 3, čo zodpovedá bazálnej, slabé, stredné a silné resp. Celkovo farbenie potom bola zastúpená kompozitné skóre, ktoré boli vypočítané vynásobením týchto dvoch tried. V súlade s tým, celkovo zafarbený bola odstupňovaná od 0 do 12.

testu proliferácie buniek

Ak chcete skúmať účinok siRNA na proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, kultivačné médiá boli nahradené s 1% FBS médium jednom deň po transfekciu siRNA. Päť dní po transfekciu, pridané 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Soul) a bunky boli inkubované po dobu 0,5 až 2 hodín za bežných kultivačných podmienok. Potom bola zmeraná absorbancia pri 450 nm za použitia čítačky ELISA (TECAN, Mannedorf, Švajčiarsko). Skúmať vplyv MED30 nadmernej expresie, bunky boli nasadené na 1% FBS médium. Tri dni po naočkovaní 10 ul Ez-Cytox bol pridaný.

Boyden komory test

V dolnej komora z transwell komora bola naplnená médiom obsahujúcim 10% FBS. Jeden deň po transfekciu sa obraz (SCR) alebo MED30 siRNA, buniek karcinómu žalúdka boli vrúbľovať do hornej komory pri hustote 5 x 10 5 buniek /ml v 50 ul média bez séra. Ak chcete skúmať účinky MED30 nadmernej expresie, bunky (makety a MED30-over) boli vrúbľovať pri hustote 1 × 10 5 buniek /ml. Eliminovať proliferácie spojené účinky, mitomycín C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) bol pridaný. Bunky boli ponechané migrovať po dobu štyroch až šiestich hodín. Membrány potom boli fixované a zafarbené za použitia Diff-Quik roztoku (Sysmex, Kobe, Japonsko) a premyje sa destilovanou vodou. Počty buniek v 10 náhodne vybraných poliach boli počítané za použitia svetelného mikroskopu.

Matrigel invázie test

Schopnosť buniek karcinómu žalúdka napadnúť bola skúmaná za použitia 24-jamkové BioCote TM TM komory vložky (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Horný povrch vložky vo invázie komorách boli potiahnuté 0,5 mg /ml rastového faktoru-zníženého Matrigelu (BD Bioscience) a spodnou plochou s 0,5 mg /ml fibronektínu (Sigma-Aldrich). Jeden deň po transfekciu sa SCR alebo MED30 siRNA, bunky boli schovať v hustote 5 x 10 4 buniek /ml v bezsérovém médiu do 8 um porézny BioCote Matrigelu komory vložky a umiestnené v jamkách naplnené 750 ul z médiu doplnenom 10% FBS ako chemoatraktantu. Ak chcete skúmať účinky MED30 nadmernej expresie, buniek (mock a MED30, ktoré nadmerne exprimujú bunky) boli vrúbľovať pri hustote 1 × 10 4 buniek /ml. Pre odstránenie účinkov proliferácie asociované sa pridá mitomycinom C (0,01 g /ml, Sigma-Aldrich). Po inkubácii po dobu 24 hodín, ne-napadajúce bunky na hornej plochy membrány boli odstránené škrabkou. Napadajúce bunky na spodných plochách boli fixované a zafarbené Diff-Quik riešenie. Experimenty boli vykonávané v triplikátech a najmenej 5 polí boli počítané za celý experiment.

xenoimplantátu test

SNU638 bunky boli transfekovány SCR alebo MED30 siRNA. Po 2 dňoch boli bunky pozbierané trypsinizací, premyté dvakrát PBS a boli subkutánne (1 x 10 6 buniek v 100 ul PBS) na ťažkú ​​kombinovanú imunodeficienciou (SCID myší). Nádorové objemy boli vypočítané každý týždeň z troch každý týždeň sedem po injekcii s použitím nasledujúceho vzorca: Objem nádoru (mm 3) = ( a
x b
2 ) /2, kde a
= dĺžka v mm a b
= šírka v mm. V siedmich týždňoch boli myši usmrtené a boli zaznamenané objemy a hmotnosti nádoru. Tento experiment bol vykonaný v prísnom súlade s odporúčaniami uvedenými v Príručke pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat vydaných National Institute of Health. Univerzita Institutional Animal Care and Use výbor Pusan ​​National (PNUIACUC) schválila experimentálne protokol.

Štatistická analýza

Výsledky sú prezentované ako priemer ± SDS. Neparametrické Mann-Whitney U-test alebo Student t-test (nepárový) bol použitý na určenie významy rozdielov medzi strednými hodnotami dvoch skupín, a jednosmerný bola použitá analýza rozptylu (ANOVA), nasledované Tukeyho mnohopočetné porovnanie analyzovať tri alebo viac skupín. * Označuje P
hodnotu menšiu ako 0,05. Doba prežitia bola definovaná ako čas, ktorý uplynie medzi liečbou a smrti alebo do Posledným cieľom sledovania informácie boli získané. Spôsob podľa Kaplan-Meiera bola použitá na určenie vzťahu medzi prežitím a expresiou MED30. Krivky boli porovnané pomocou log-rank testu na hladine významnosti 95%. P
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. Dáta boli analyzované s použitím SPSS softvér verzia 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Výsledky

Nadprodukcie MED30 v žalúdočnej rakovinové tkanivá

Ak chcete preskúmať úlohu hrali podľa MED30 rakoviny žalúdka, najprv skúmal stav expresie MED30 v nádorových tkanivách 23 pacientov s karcinómom žalúdka. Bolo zistené, MED30 proteín byť široko nadmerne exprimovaný v tkanivových oblastiach rakovinových (Obr 1A-1D), a zrejme nadmerne exprimovaný u napadajúce žalúdočné rakovinových bunkách (obr 1C) a metastatických nádorových buniek vnútri postihnutých lymfatických uzlín (viď obr 1D). Aby bol overený naše výsledky imunohistochémia, sme vykonali kvantitatívne PCR v reálnom čase na žalúdočné tkaniva s rakovinou s použitím MED30-špecifických primérov. Ako je znázornené na obr 1F, DPY30 bol nadmerne exprimovaný v 10 prípadoch (10/23, 43%). Tiež sme skúmali expresné vzor MED30 v žalúdočných nádorových bunkových línií pomocou real-time PCR, a zistila, že je nadmerne vystavený v piatich z karcinómu žalúdka testované bunkové línie (s výnimkou SNU1) oproti normálnej žalúdočnej tkanive (obr 1e). Vyšetrovať koreláciu medzi expresiou MED30 a klinické vlastnosti, sme sa vykonáva s použitím imunohistochémia 41 vzoriek žalúdočnej rakovina tkaniva (tabuľka 1). Je zaujímavé, že expresia MED30 v pozitívnej korelácii s N stupňami (obr 1G), ale nie s prežitím pacientov (dáta nie sú uvedené).

Úloha MED30 v proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka

Ak chcete skúmať úlohu MED30 v žalúdočnej karcinogenéze sme skúmali účinky MED30 knockdown alebo nadmerné expresie na množenia sa, migrácie a invázie zo šiestich žalúdočných rakovinových bunkových línií (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638 a NCI -N87 bunky). PCR v reálnom čase a western blot sa použili na analýzu vyraďujúce a zvýšenú expresiu v SNU216 a MED30 SNU638 bunky (obr 2A-2C). Keď boli tieto bunky transfekovány MED30 siRNA (100 nM), MED30 výraz zmenšil na proteínu a mRNA o približne 80% za dva dni v závislosti na SCR siRNA a MED30 zvýšenou expresiou cDNA transfekciu zvýšená MED30 mRNA a hladín proteínov v porovnaní s prázdnym kontrolným Vektor transfekované bunky (mock bunky) o viac ako 3 krát.

Ďalej sme skúmali úlohu MED30 v proliferáciu nádorových buniek. Proliferačnej testy boli vykonávané 5 dní po transfekciu s SCR alebo MED30 siRNA. Vyradenie MED30 inhibuje proliferácie všetkých buniek karcinómu žalúdka testovaných (SNU16, SNU216, SNU620 a SNU638) oproti SCR o 18%, 68%, 98% a 42%, v danom poradí (obrázok 2D). Podobné výsledky boli pozorované, keď vykonáva proliferačnej testy dva až tri dni po transfekciu (dáta nie sú uvedené). Dôsledne, MED30 nadmerná expresia zlepšilo porasty SNU216 a SNU638 bunky o 1,9 a 2,2 násobne, respektíve proti falošne buniek.

Ak chcete určiť úlohu MED30 v migrácii buniek karcinómu žalúdka, sme použili Boyden komory test. Vyradenie MED30 znížila FBS-indukovanej migrácie na SNU216 a SNU638 buniek o 90% a 52%, v uvedenom poradí, v porovnaní s SCR transfekciou buniek (obrázok 3A a 3C). Okrem toho, že nadmerná expresia MED30 zvýšila FBS-indukovanú migráciu SNU216 a SNU638 bunky o 3,2 a 2,8 násobne, v danom poradí, v porovnaní s falošne buniek (obr 3B a 3C). Tieto výsledky nás viedli k skúmať úlohu MED30 pri invázii rakovinových buniek žalúdka. V inváziu teste Matrigel, MED30 siRNA inhibovala FBS indukovanej invázie SNU216 a SNU638 bunky oproti SCR siRNA o 64% a 47%, v danom poradí (obr 4A a 4C), a MED30 nadmerná expresia zrýchlené FBS indukovanej invázie SNU216 a SNU638 bunkám v porovnaní s modelovými buniek 2,5 a 2,2-násobne a AUC (obr 4B a 4C).

vplyv MED30 knockdown na in vivo
tumorigenicity

Ak chcete skúmať vplyv na MED30 nádorový rast, sme sa subkutánnou injekciou SNU638 bunky prenesené s SCR alebo MED30 siRNA do SCID myší, a potom sledovaný rast nádoru po dobu siedmich týždňov (obr 5A). počas troch týždňov boli zistené Hmatateľné nádory v kontrolných stranách SCR. Avšak, rakovinové bunky transfekované siRNA MED30 vykazovali pomalší rast. Sedem týždňov po injekcii boli myši usmrtené a objemy a hmotnosti nádoru boli merané (obr 5B a 5C). Výsledky ukázali, MED30 Knockdown výrazne znížiť objemy a hmotnosti nádoru.

Regulácia EMT dráhy podľa MED30

Ak chcete určiť mechanizmus tvoriaci základ pre podporu žalúdočné karcinogenéze zo strany MED30, sme skúmali expresné vzory génov podieľajú na epiteliálny-mezenchýmových prechod (EMT: kľúčový proces metastázy a invázia) pomocou real-time PCR. Vyradenie MED30 mierne zvýšila úroveň E-cadherinu (CDH1) mRNA v SNU638 bunkách oproti SCR transfekciu, ale znížila vyjadrenie N-cadherinu (CDH2), P-cadherinu (CDH3) a vimentin (VIM) o 42%, 36% a 41%, v uvedenom poradí (obrázok 6A). Dôsledne, MED30 nadmerná expresia zníženie hladiny CDH1 mRNA o 35% v porovnaní s falošne buniek, ale zvýšila vyjadrenie N-cadherinu (CDH2), P-cadherinu (CDH3), krútiť rodiny bHLH transkripčný faktor 1 a 2 (TWIST1 /2), a vimentin (VIM) o 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, a 4,2-krát, v danom poradí (obrázok 6A). Hladiny mRNA šnek rodiny prsta zinku 1 a 2 (SNAI1 /2) boli nezmenené. Potom sme potvrdili, že nadmerná expresia MED30 tiež zvýšené hladiny proteínovej E-cadherinu, N-cadherinu, P-cadherinu, Twist1 a vimentin (obr 6B). Skúmanie morfológie SNU638 buniek, zistilo sa, že nadmerná expresia MED30 vyvolal prechod od dlažobné kocky, ako pretiahnuté fibroblastov-ako morfológia (obr 6C), vzhľadom k tomu, MED30 knockdown nemení morfológiu (dáta nie sú uvedené). Tieto výsledky naznačujú, že MED30 pozitívne reguluje EMT.

Diskusia

Funkčné role podjednotky MED30 MED (tiež známy ako TRAP25) sú zle rozumie. V nedávnej správe, MED30 bolo zistené, že hrajú významnú úlohu v regulácii mitochondriálnej funkcie a integrity v homozygotnom myší [19]. V tejto štúdii sme skúmali funkčné role MED30 počas progresie rakoviny žalúdka. Bolo zistené, MED30 upravené na proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka a ich in vivo
karcinogenity. Po zaistení vyraďujúce a účinnosti nadmerná expresia kvantitatívnej real-time PCR a analýzou Western blot (obrázok 2), sme zistili, že MED30 knockdown výrazne potláča proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, a že MED30 nadmerná expresia mal opačný účinok (obr 2-4). Navyše MED30 porazený znížená in vivo
tumorigenicity (obr.5). Ďalej sme tiež zistili, že MED30 bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka tkanivách a žalúdka nádorových bunkových línií (obr 1). Tieto výsledky naznačujú, že MED30 by mohli zohrávať dôležitú úlohu pri patologickej žalúdočnej rakoviny.

Vzhľadom k tomu, špecifické MED podjednotky sú spojené so signálnymi aktivovaných transkripčných faktorov a RNA polymerázu II (Pol II) [20] a fungovať ako potrubia a integrátorov pre smerovanie rôznych signálnych dráh, ako je napríklad, dráhy jadrového hormónu receptora (cez MED1) [21], TGF-β-signálne dráhy (pomocou MED12 a MED15) [22, 23], je Wnt signálne dráhy (pomocou MED12) [ ,,,0],24], a Ras-MAPK signalizačnej dráhy (pomocou MED23) [25-27]. Bolo navrhnuté, že tieto signálne dráhy môže vyvolať EMT [28-32], ktoré je známe, že je spojená s metastázy, invázia, proliferáciu a chemorezistence epiteliálne rakoviny [29, 33, 34]. Preto sme sa opýtali, či MED30 spúšťa EMT. MED30 vyvolané výrazov z EMT súvisiacich génov (N-cadherinu, CDH2, P-cadherinu, CDH3, spojené krútenie proteín 1 a 2; TWIST1 /2, vimentin, VIM), ale inhibuje expresiu E-cadherinu (CDH1) A známy nádorový supresor (obr 6A a 6B). Okrem toho, MED30 nadmerná expresia indukuje fibroblastov-ako morfológia (obr 6c), čo naznačuje MED30 spúšťa EMT v nádorových bunkách žalúdka.

sumarizácia, táto štúdia podporuje názor, že MED30 pôsobí ako onkogén počas žalúdočné karcinogenéze a navrhuje MED30 mohlo regulovať EMT v rakoviny žalúdka. Aj keď sú potrebné ďalšie štúdie na určenie, ako MED30 spúšťa EMT, naše výsledky naznačujú, že MED30 byť považované za román molekulárnym cieľom pre liečbu rakoviny žalúdka.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená Bio & Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) a základná vedecká nadácia pre výskum (2012R1A1A3010521) Národná nadácia pre výskum (NRF) financovaného kórejskou vládou (MEST) a grantom z Národného R &D program na kontrolu rakoviny, ministerstvo zdravotníctva , sociálnej starostlivosti a rodinné záležitosti, Kórejská republika (0.920.050).