Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE :. proteomiky-Based Identifikácia a analýza proteínov spojená s Helicobacter pylori v žalúdku Cancer

abstraktné

Helicobacter pylori
( H
pylori
) je špirálovitá gramnegatívne baktérie, ktorá spôsobuje, že najčastejšie chronické infekcie v ľudskom žalúdku. Približne 1% -3% infikovaných jedincov vyvinie rakovina žalúdka. Avšak mechanizmy, ktorými H
. pylori
vyvoláva rakovinu žalúdka však nie sú celkom známe. Dostupné dôkazy svedčia o silnú väzbu medzi faktor virulencie H
. pylori
, cytotoxin-spojený gén A (ČAGA), a rakovina žalúdka. Pre ďalšie charakterizáciu H
. pylori
virulencie, sme založili tri bunkové línie tým, že nakazí žalúdočné rakovina bunkových línií SGC-7901 a AGS s ČAGA
+
H
. pylori stroje a transfekcia SGC-7901 s vektorom nesúcim plnej dĺžke ČAGA
génu. Zistili sme, 135 odlišne exprimované proteíny z troch bunkových línií za použitia proteomu technológie a 10 diferenciálnej proteíny, spoločná všetkým trom bunkové línie boli vybrané a identifikované pomocou LC-MS /MS, rovnako, ako bolo overené pomocou Western blot: beta-aktínu, L-laktát (LDH), dihydrolipoamid dehydrogenázy (DLD), pre-mRNA spracovanie faktorom 19 homológov (PRPF19), ATP syntázy, kalmodulin (CAM), P64 CLCP, Ran-špecifické GTPázu aktivujúceho proteínu (RanGAP), P43 a kalretikulin. Detekcia expresie týchto proteínov a génov kódujúcich tieto proteíny v rakovina žalúdka tkanivách PCR v reálnom čase (RT-qPCR) a western blot odhalili, že expresia β-aktínu
, LDH
, DLD
PRPF19 stroje a CaM
gény boli up-regulované a RanGAP
bola down-regulované v žalúdočných rakovinových tkanív a /alebo metastatický lymfatické uzliny v porovnaní s prímestských rakovinové tkanivá. Vysoká expresia génu bola pozorovaná u H
. pylori
infekcie v žalúdočnej rakovinových tkanív. Okrem toho LDH
DLD stroje a CAM
gény boli demetylovaný na promótor -2325, -1885 a -276 lokalít, respektíve a RanGAP
gén bol veľmi methyluje na promótor -570 a -170 miesta v H
. pylori
-infected a ČAGA
-overexpressing bunky. Tieto výsledky poskytujú nový pohľad na ciele molekulárnej patogenézy a liečby pre rakovinu žalúdka s H
. pylori
infekcie

Citácia :. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomics-Based Identifikácia a analýza proteínov združených s Helicobacter pylori
v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10,1371 /journal.pone.0146521

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

prijatá: 15. septembra 2015; Prijaté: 19.prosince 2015; Uverejnené: 08.01.2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dáta Availability :. Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. práca bola podporená národná prírodná Science Foundation Číny (81260303, 31560326), Guizhou provincia nadácie ([2014] QianJiaoHe 06) a Key Projekt vedy a technológie Guizhou Province (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). V pôvodnej verzii, práca bola podporovaná národná prírodná Science Foundation Číny (81260303, 31560326) a kľúčového projektu vedy a technológie v provincii Kuej-čou (QianKeHe SY (2011) 3067)

konkurenčnými záujmami: Text. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú.

Úvod

Helicobacter pylori
( H
. pylori
) spôsobí, že najviac spoločný chronickou žalúdočnej infekcie u ľudí po celom svete. Približne polovica svetovej populácie je infikovaná H
. pylori
, a väčšina kolonizovaných jedincov rozvíjať asymptomatickej gastritídu. U infikovaných osôb, približne 10% až 20% osôb vyvinúť peptických vredov ochorení a 1% -3% vzniku rakoviny žalúdka [1,2]. V roku 1994, H
. pylori
bola klasifikovaná ako karcinogén typu I za rakovinou žalúdka u Medzinárodnej agentúry Svetovej zdravotníckej organizácie pre výskum rakoviny.

Karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších typov rakoviny, a viac než 70% nových prípadov a úmrtí dochádza v rozvojových krajinách [3]. Aj keď sa globálna výskyt klesá už niekoľko desaťročí, rakovina žalúdka je stále prevláda vo väčšine rozvojových krajín, vrátane Japonska, Kórei a Číne [4-6]. V roku 2012, čínska onkologický register výročná správa ukázala, že rakovina žalúdka chorobnosti a úmrtnosti sú druhé a tretie miesto medzi všetkými zhubnými nádormi, resp.

Väčšina H
. kmene pylori
niesť CAG
patogenity ostrov ( CAG
PAI), ktorý obsahuje 27 až 31 gény, ktoré kódujú bakteriálne typ 4 sekrečnú systém (T4SS) [7] , Gen cytotoxin asociované Gen ( ČAGA
), ktorý sa nachádza na konci 3 ' CAG
PAI, kóduje jediný známy bakteriálne onkoproteínov, ČAGA, ktorý je translokovaný do hostiteľských buniek podľa T4SS po bakteriálnej pripevnenie k žalúdku. Akonáhle je vo vnútri hostiteľskej bunky, ČAGA tyrozínu je fosforylovaná členov kináz rodiny Src, Abl a a interaguje s mnohými intracelulárnej efektory, čo vedie k aktivácii následných signálnych molekúl [8]. V klinických štúdiách, ČAGA
-pozitívnych kmene boli trvalo spojené s ťažším žalúdočné vredy a zápalu, a malý podiel jedincov vyvinie rakovina žalúdka [9]. Avšak, neboli objasnené mechanizmy, z ktorých vychádza združenia ČAGA s rakovinou.

proteomiky sa ukázal ako sľubný technologickej platformy pre racionálne identifikáciu biomarkerov a nových terapeutických cieľov pre choroby a stanovenie základných mechanizmov karcinogenézy [10]. Avšak, väčšina z dôležitých proteínov detekovaných proteomiky in vitro neboli potvrdené in vivo v klinických vzorkách.

DNA metylácie a demetylácie hrá dôležitú úlohu v rozvoji a progresii rakoviny blokovaním väzby transkripčných faktorov DNA a je sa vyskytuje takmer výhradne v promótorom génu CPG ostrovov [11-13]. Medzi orgány, žalúdok vykazuje najvyššiu frekvenciu abnormálne ostrove CPG metylácie, prípadne H
. pylori
sprostredkovanú [14-16]. Hoci štúdie metylácie DNA sa zvyšuje, génovej metylácie stavy vyvolané H
. pylori
zatiaľ nie sú jasné.

V tejto práci sme sa zamerali na identifikáciu špecifickej proteíny spojené s H
. pylori
infekcie pomocou porovnávacej proteomiky a charakterizovať génovú expresiu a CPG ostrovné metylácie týchto proteínov v žalúdku rakovinových tkanív a buniek.

Materiály a metódy

ľudských tkanív

Ľudské tkanivá boli získané z chirurgických vzoriek od 30 pacientov s karcinómom žalúdka a uzavreté priľahlé nádorové tkanivá a metastáz lymfatických uzlín v Kuej-jang Medical Hospital, Guiyang Číne, v období od januára 2009 do júna 2010. diagnózy boli potvrdené dvoma patológmi. Medzi pacientmi, 23 boli muži a 7 boli ženy. Pacienti boli vo veku od 38 do 77 rokov. Dvadsaťdva pacienti mali črevnú typu adenokarcinóm a 8 mali difúzny typu adenokarcinóm. Protokol štúdie bol schválený etickou komisiou Guiyang lekárske nemocnice, a všetky subjekty uvedené písomný informovaný súhlas.

Bunková kultúra

Ľudská bunková línia karcinómu žalúdka AGS (ATCC CRL-1739TM) a SGC-7901 bunky boli zakúpené priamo od American Type Culture Collection (ATCC) a Cell Bank of Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína), v uvedenom poradí, a pasážovania po dobu kratšiu ako 3 mesiace v našom laboratóriu po obdržaní. Bunky boli kultivované v Roswell Park Memoriál Institute (RPMI) 1640, doplnenom 10% teplom inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom, 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu (Gibco, Grand Island, NY, USA) pri teplote 37 ° C v zvlhčenej inkubátora s 5% CO 2.

H
. pylori
kultúra

H
. pylori
kmeň NCTC11637 (ATCC 43504, dar od čínskeho Centra Helicobacter pylori
kmeň riadenia a konzervácie, Peking, Čína), čo je ČAGA
pozitívne, bola pestované v selektívnom médiu na agar Columbia s obsahom 10% fetálneho teľacieho séra a H
. pylori
Selective Supplement (Oxoid Ltd., Anglicko) pri teplote 37 ° C za mikroaerobní podmienok.

Cell infekcie H
. pylori

AGS a SGC-7901 bunky (5 x 10 5) boli vrúbľovať do 6-jamkové doštičky po dobu 24 hodín a infikované H
. pylori
počas 6 h a 12 h pri násobnosti infekcie (MOI) 1: 100, 1: 500 a 1: 1000, v danom poradí. Bunky boli infikované po dobu 12 hodín pri MOI 1: 1000 s H
. pylori
varí po dobu 15 minút ako kontroly.

Konštrukcia expresného vektora pcDNA3.1 / ČAGA

DNA bola extrahovaná z H
. pylori stroje a plnej dĺžke ČAGA
sekvencia bola syntetizovaná pomocou PCR a klonované do pMD18-T plazmidov pre konštrukciu pMD18-T / ČAGA
. ČAGA
gén bol identifikovaný sekvenovaním (GQ161098). pMD18-T / ČAGA
bol štiepený reštrikčnými enzýmami Pst
I a Bam HI stroje a ČAGA
bol ligován do pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA), ku konštrukcii eukaryotické expresné vektor pcDNA3.1 / ČAGA
. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1.

transfekciu buniek s pcDNA3.1 / ČAGA

SGC-7901 bunky boli inkubované po dobu 12 hodín v 6-jamkových dosky pre získanie 80% konfluentní bunky. Bunky potom boli transfekovány v súlade s pokynmi výrobcu. Po 48 hodinách boli bunky rozdelené v pomere 1:10 do nových 6-jamkové doštičky a inkubované po dobu ďalších 24 hodín a potom sa udržuje v selektívne Zeocin obsahujúce (250 ug /ml) štandardným médiu po dobu 2 týždňov, kým nedošlo k vytvoreniu klonu. Bunky transfekované prázdnym vektorom pcDNA3.1 /Zeo (-) boli použité ako kontroly

extrakcie proteínov a western blot

Proteínové extrakty boli pripravené resuspendováním bunkových peliet v RIPA pufri alebo homogenizácii 200. mg tkaniva v pufri RIPA. Celkom 30-50 ug proteínového extraktu sa podrobí SDS-PAGE gélu, prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (Millipore, Billerica, MA, USA) a prenesené cez noc s myšou monoklonálnou anti-ČAGA protilátkou (1: 800, SC-28368), myšou monoklonálnou anti-fosfotyrosinové protilátky (PY99, 1: 300, SC-7020), králičie polyklonálne anti-beta aktínu protilátky (1: 500, ab189073), králičie polyklonálne anti-LDH protilátkou (1: 350 , ab125683), myšou monoklonálnou anti-DLD (1: 800, SC-376890), králičie polyklonálne anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), myšou monoklonálnou anti-ATP syntázy protilátkou (1: 300, ab54880), králičie polyklonálne anti -kalmodulin anbody (1: 250, ab208911), králičie polyklonálne anti-RanGAP protilátkou (1: 200, ab92360), králičie polyklonálne anti-p64CLCP protilátkou (1: 300, ab28722), králičie polyklonálne anti-kalretikulin protilátky (1: 350, AB4) a myšou monoklonálnou anti-glyceraldehyd-3-fosfát -dehydrogenase protilátka (GAPDH, 1: 8000) od Santa Cruz (CA, USA), abca (Cambridge, UK) a CangChen (Shanghai, Čína), respektíve 5% BSA v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku a 0,01% Tween-20. Sekundárne protilátky konjugovanej s peroxidázou (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) boli použité a vyvinuté s chemiluminiscenčná činidlá ECL Plus pomocou Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Kvantifikácia západných Blot bola vykonaná pomocou Množstvo jednom software. Každý experiment bol vykonávaný 3-krát, a je zobrazený reprezentatívny výsledok.

extrakcie bielkovín a dvojrozmernú gélovou elektroforézou

Bunkové pelety boli rozpustené v bunkovej lyzačním pufri cez noc pri teplote 4 ° C, a proteín sa vyzráža tromi objemy ľadovo chladného acetónu inkubáciou pri teplote 4 ° C po dobu 2 hodín. Potom boli vzorky centrifugovány pri 20000 otáčkach za minútu po dobu 30 minút a pelety boli resuspendované v lyzačním pufri buniek a uloží sa pri teplote 4 ° C cez noc.

celkom 800 ug proteínu sa upraví na objem 250 ul roztokom rehydratácia a izoelektrickým zameraním (IEF) bola vykonaná za použitia zaostrovacieho systému Ettan IPGphor II izoelektrické (Amersham Biosciences) podľa inštrukcií výrobcu. Protokol pre IEF 300 V for1 h, 500 V po dobu 2,5 h, 1000 V po dobu 2 hodín; 8000 V po dobu 8 hodín, 60 KVH (spolu).

Po dokončení IEF prúžky IPG (Amersham Biosciences) sa ekvilibruje v rovnovážnom pufri po dobu 15 minút a umiestni sa na 12% SDS-PAGE gélu pre dvoj- dimenzionální elektroforéza na 30 mA /gél. Výsledný gél SDS-PAGE bola stanovená v 20% TCA po dobu 30 minút a potom zafarbené koloidným Coomassie G-250 [5].

Proteínové škvrny na gélu boli skenované a analyzované automaticky. Rozdielne exprimovaný proteín škvrny boli potvrdené Imaging Hlavné 2D 5,0 analytického softvéru (Amersham Biosciences). Student t-test bol vykonaný pre kvantitatívnu analýzu 2D gély. Diferenciálnej expresie špecifického proteínu bola definovaná ako zmena ≥2-krát v mieste optickej hustoty medzi oboma sadami uzavreté v duplikátoch. Diferenciálnej škvrny potom boli vyrezané z SDS-PAGE géloch pre bližšie identifikáciu pomocou LC-MS /MS.

extrakcie RNA a kvantitatívnej RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná z 50 mg tkaniva a spracuje sa s DNázy i (RNase-free). Tieto gény boli zosilnené pomocou SYBR Green (Applied Biosystems, Austrália). Hypoxantín-guanín fosforibozyl ( HPRT
) bol použitý ako kontrola normalizácia a relatívnej hladiny mRNA boli vypočítané porovnávacie C metóda t pomocou Step-one softvér (Applied Biosystems, Austrália) [8]. Každá vzorka bol testovaný trikrát a výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. Primery použité sú uvedené v tabuľke 1.

extrakcie DNA a analýza metylácie CPG ostrovov

DNA bola izolovaná z buniek a modifikované hydrogensiričitanovú sodným za použitia EZ DNA metylácie-Gold Kit ™ (Zymo Research, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Promotorových CPG ostrovy boli predpokladané použitie softvéru Metyl Primer Express a amplifikovaný z bisulfitového modifikovanej DNA pomocou PCR za použitia nasledujúcich postupov: denaturácia pri 96 ° C počas 10 minút, nasledovalo 40 cyklov denaturácie pri 94 ° C počas 40 sekúnd, teplotná hybridizácia pri 60 ° C ° C počas 40 sekúnd a predĺženie pri 72 ° C počas 40 sekúnd, s konečným predĺžením pri 72 ° C počas 10 min. Amplifikované PCR produkty boli klonované do vektorov pMD19-T a sekvencovaní. Okrem toho, DNA izolovaná z nádorového tkaniva bola použitá na detekciu H
. pylori
16S rRNA
gén a ČAGA
gen. Tieto sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 2.

Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SD. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou softwaru SPSS 15.0. Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) a t test bol použitý na analýzu dát. P
. ≪ 0,05 (obojstranné) bol považovaný za významný

Výsledky

Zavedenie ČAGA do nádorových buniek žalúdka

Keďže ČAGA zo H
. pylori
je kritickým faktorom virulencie v rozvoji a progresii rakoviny žalúdka, ČAGA bola zistená v karcinómu žalúdka bunkových línií pomocou RT-PCR a westernovým prenosom po infekcii SGC-7901 a AGS buniek s H
. pylori stroje a transfekcia SGC-7901 buniek ČAGA
-vector. ČAGA proteín sa začali objavovať v pomere buniek pre baktérie 1: 500 v kultivovaných bunkách na 6 hodín, a obsah bol najvyšší v pomere 1: 1000 v 6 hodín (Obr 1A a 1B). Avšak, fosforylovaný ČAGA bola pozorovaná v bunkách v pomere 1: 500 po kultivácii po dobu 12 hodín, a najvyšší obsah bol pozorovaný u buniek v pomere 1: 1000 po 6 hodinách kultivácie. ČAGA mRNA a proteín boli pozorované aj u stabilne ČAGA
-overexpressing SGC-7901 bunky (obr 1C a 1D). Tieto údaje naznačujú, že ČAGA bol úspešne zavedený do troch bunkových línií a fosforylované.

Identifikácia proteínov v diferenciálnych buniek karcinómu žalúdka

Potom, čo boli bunky infikované H
. pylori
po dobu 6 hodín pri MOI 1: 1000 alebo transfekovány ČAGA
-vector, je proteomická technika bola použitá na vytvorenie šesť dvojrozmerná elektroforéza (2-DE) mapuje z troch bunkové línie a ich príslušné kontroly (obrázok 2), a 135 diferenciálnej škvrny bolo zistené, z ktorých 73 bolo up-regulované a 62 boli down-regulované. Ten rozdiel škvrny spoločný pre všetky tri bunkové línie boli identifikované pomocou LC-MS /MS a overených westernovým prenosom, vrátane 6 up-regulované proteíny: beta-aktínu, LDH, DLD, PRPF19, ATP syntázy a kalmodulin (CAM), a 4 down-regulované proteíny, ako je RanGAP, P64 cLCP, P43 a kalretikulin (tabuľka 3 a obr 3A).

H
. pylori
infekcie podporuje expresiu diferenciálnych bielkovín v žalúdku rakovinových tkanív

, pretože H
. pylori kolonizuje
selektívne ľudský žalúdok aktivovať sadu patologických procesov, génovej expresie 10 diferenciálnych proteínov v 30 vzoriek rakovina žalúdka u ľudí bola hodnotená pomocou kvantitatívnej RT-PCR. Z týchto 10 génov, expresia β-aktínu
LDH
DLD
PRP19 stroje a CaM
v karcinómov žalúdka a /alebo metastatický lymfatické uzliny boli up-regulovaná v porovnaní s peri-rakovinové tkanivá, zatiaľ čo expresia RanGAP
bola down-regulované. A podobne, sa 6 proteíny boli abnormálne vyjadrené v rovnakých tkanivách (obr 3B a 3C). Neboli žiadne významné rozdiely v expresiu iných génov.

H
. pylori
kolonizácie v žalúdočných rakovinových tkanív bola meraná pomocou detekcie 16S rRNA
gén a ČAGA
gén H
. pylori
pomocou PCR. H
. pylori
bola prítomná u 20 z 30 vzoriek (pozitívna sadzba 67%), a všetky H
. pylori
kmene sú ČAGA
pozitívne. Hladiny mRNA beta-aktínu
LDH
DLD
PRP19 a Cam
boli vyššie u H
. pylori
-pozitívnych tkaniva ako v negatívnych vzoriek (3D obrázok).

H
. pylori
indukuje aberantne metylácie DNA v žalúdočnej rakovinové bunky

V troch bunkových línií, produkty PCR o CPG ostrovov vyššie uvedených génov bolo úspešne dosiahnutá po pôsobení bisulfitového a sekvenovania. V týchto génov, LDH
DLD stroje a CAM
gény boli demetylovaný na promótor -2325, -1885 a -276 lokalít, respektíve a RanGAP
gén bol veľmi methyluje na promótor -570 a -170 miesta (obr.4).

Diskusia

Kumulatívny dôkazy nasvedčujú tomu, že H
. pylori
infekcie je dôležitým faktorom pre H
. pylori
-associated žalúdočných ochorení a že Čaga je podporovať faktorom pre rakovinu žalúdka [17,18]. konštruované sme tri experimentálne bunkové línie, vrátane dvoch žalúdočných rakovinových bunkových línií infikovaných H
. pylori
( ČAGA
+) a rakovina žalúdka bunkové línie s nadmernou expresiou ČAGA
, a zistila, že Čaga sa začali objavovať v bunkách 6 h po infekcii a pre až do 12 hodín. Následne fosforylovanej ČAGA začali objavovať, v súlade s injekciou a následné fosforylácie ČAGA do žalúdočného epitelu u T4SS o H
. pylori
po infekcii ľudskej žalúdočnej sliznice. Fosforylovaný ČAGA aktivuje downstream signálnych dráh a hrá patologickú úlohu. Pozorovali sme tiež ČAGA v bunkách stabilne transfekciou ČAGA
-vector. Tieto údaje potvrdzujú úspešné konštrukcia z troch experimentálnych bunkových línií.

Proteomics bol použitý na štúdium vzťahu medzi H
. pylori
infekcie a ochorenia žalúdka, a mnoho rozdielne exprimované proteíny boli identifikované [19-22]. Avšak, združenia týchto proteínov ČAGA a ich expresie v ľudských nádorových tkanivách žalúdka zostávajú nejasné. Získali sme celkom 135 diferenciálnych škvŕn z troch bunkových línií, z ktorých 73 bolo up-regulované a 62 boli down-regulované. Desať diferenciálnej škvrny boli spoločné pre všetky tri bunkové línie, vrátane 6 up-regulovaných proteínov (beta-aktínu, LDH, DLD, PRP19, ATP syntázy, a CAM) a 4 down-regulované proteíny (P64 CLCP, RanGAP, P43 a kalretikulin) , prejavu a 10 proteínov "boli overené westernovým prenosom v týchto bunkových línií. Tieto proteíny sa zúčastňujú energetického metabolizmu, kostra Prešmykač, spracovanie pre-mRNA, prenos signálu, a ďalšie bielkoviny úzko súvisí s rozvojom a progresiu mnohých ľudských rakovín [23,24]. Sme kvantitatívne detegovať expresiu génov kódujúcich tieto proteíny 10 v ľudských nádorových tkanivách žalúdka, ktorá odhalila, že β-aktínu
, LDH
, DLD
, PRP19 stroje a CaM
boli dôsledne vysoko vyjadrené a RanGAP
sa zle vyjadril v oboch rakovinových tkanív a /alebo metastatických lymfatických uzlín v porovnaní s peri-rakovinové tkanivá. Aberantne expresie týchto proteínov bola tiež overená pomocou Western Blot v karcinómu žalúdka a metastatických lymfatických uzlín. Ďalej sme zistili, že ČAGA
+ H
. pylori
kolonizovaná v 20 z 30 rakovinových tkanív žalúdka a podporoval alebo inhibuje expresiu týchto génov in vivo.

LDH a DLD sú úzko koreluje s energetického metabolizmu. Porucha metabolizmu energie je považovaná za dôležitý faktor pre rozvoj a progresiu rakoviny. Na rozdiel od normálnych buniek, rakovinové bunky vykazujú zvýšenú závislosť na glykolýzy s dostatočného prístupu kyslíka, nazývaný aeróbne glykolýzy. Veľké množstvo kyseliny pyrohroznová, finálny produkt dráhy, sa prevedie na kyselinu mliečnu podľa LDH, propagáciu glykolýzy a energetického metabolizmu nerovnováhu [25]. Kyselina mliečna môže tiež znížiť pH bunkovej mikroprostredie, čím sa zvyšuje neovaskulárnou reakcia na angiogenézu faktorov na podporu metastáz nádorových buniek [26,27]. V súlade s našimi výsledkami, LDH
bol vysoko exprimovaný v rakovinových tkanivách vo 61,8% pacientov s rakovinou žalúdka; Pacienti s LDH nadmernou expresiou mal kratšie prežívanie v porovnaní s pacientmi s nízkou expresiou [28]. Kim et al
. [29] zistilo, že DLD
expresie sa zvyšuje s progresiou nádoru, čím poskytuje viac energie pre rast nádorových buniek. Preto je vysoká expresia LDH a DLD je kľúčovým faktorom pre rozvoj a progresiu rakoviny žalúdka a H
. pylori
infekcie podporuje expresiu týchto dvoch génov v tkanivách karcinómu žalúdka.

Beta-aktínu, kľúčovou súčasťou cytoskeletu, udržuje štruktúru, pohyb a delenie buniek je za normálnych podmienok. β-aktínu
abnormálne exprimovaný u mnohých chorôb [30]. PRPF19 proteín sa predpokladá, že fungujú v zostrihu pre-mRNA. Ubikvitinace z PRPF19 by mohlo viesť k poškodeniu DNA, a abnormálne opravy DNA je významnou príčinou vzniku nádorového ochorenia [31]. Kalmodulin je vápnik viažuci proteín, ktorý reguluje veľa signálnych dráh, a tým sa podieľa na bunkovej proliferácii, mitózy a génovej transkripcie. Kalmodulin podporuje bunkovú proliferáciu pečeňových nádorov v kombinácii s PI3K a prechodu z G1 do S fázy v kombinácii s cyklin E [32]. Inhibítor kalmodulinu zatýkaním buniek vo fáze G1, že inhibujú bunkové delenie [33]. V súlade s týmito výsledkami sme zistili, že H
. pylori
sa môžu podieľať na vzniku karcinómu žalúdka tkanív tým, že indukujú vysokú expresiu týchto troch proteínov.

Okrem toho sme pozorovali down-reguláciu RanGAP
génu rakovinové tkanivá s H
. pylori
infekcie. RanGAP je proteín GTPázu aktivujúce. Po hydrolýze GTP na GDP GTPáza, aktívne RanGTP prestane byť aktívny RanGDP, čo vedie k blokáde bunkovej signalizácie na inhibíciu progresie rakoviny [34]. Rovnako tak sa znížila RanGAP aktivita indukovaná ubikvitinace podporuje rozvoj rakoviny [35].

DNA metylácie môže vyvolať abnormálne expresiu génu. H
. pylori infekcie
zvýši úrovne metylácie niektorých génov a výsledky v karcinogenéze žalúdočnej sliznice [36,37]. Metylácie DNA sa zvyčajne objavuje v CPG ostrovy promotorov génov. Zistili sme, metylačného statusu CPG ostrovov týchto génov v postavených bunkových línií a zistil, že LDH
, DLD stroje a CAM
gény boli demethyluje na promótorom -2325, -1885 a -276 miesta, v danom poradí, a RanGAP
gén bol veľmi methyluje na promótorom -570 a -170 miestach, v súlade s vysokou expresiou LDH
DLD stroje a CaM
gény a nízky výrazom RanGAP
génu u karcinómu žalúdka tkanivách s ČAGA
+ H
. pylori
infekcie.

Na záver, tieto výsledky naznačujú, že H
. pylori
infekcie, cez ČAGA translokáciu, môže vyvolať aberantne metylácii týchto génov vedie k dysfunkčné génovej expresie v žalúdočných rakovinových tkanivách a bunkách. Naše výsledky poskytujú nové chápanie molekulárnej patogenéze rakoviny žalúdka s H
. pylori
infekcie. Budúce štúdie bude skúmať účinky týchto pozmenených metylácie vzorov na patogenéze rakoviny žalúdka v klinických vzorkách.

Poďakovanie

Ďakujeme čínske centrum v Helicobacter pylori
kmeňa management a konzervácia za poskytnutie H
. pylori
NCTC11637 a Dr Yang Wenxiu a Wu Jiahong pre technickú pomoc.

Other Languages