Ploche ONE: PFTK1 podporuje rakovina žalúdka Priebeh regulovaním množenia sa, migrácie a Invasion

abstraktné

PFTK1, tiež známy ako PFTAIRE1, CDK14, je nový člen Cdc2 súvisiacich serín /treonín proteínkinázy. Nedávne štúdie ukazujú, že PFTK1 je vysoko exprimovaný v rôznych malígnych nádorov, napríklad hepatocelulárneho karcinómu, rakoviny pažeráka, rakoviny prsníka, ktorý je zapojený do regulácie bunkového cyklu, nádory proliferáciu, migráciu a inváziu, ktorá ďalej ovplyvňovať prognózu nádorov. Avšak výraz a fyziologický význam PFTK1 v karcinómu žalúdka, zostávajú nejasné. V tejto štúdii sme analyzovali expresiu a klinický význam PFTK1 pomocou Western Blot v 8 škárovanie čerstvej nádorového tkaniva, žalúdočnej nontumorous žalúdočnej sliznice a imunohistochémia na 161 paraffinembedded plátky. Vysoká expresia PFTK1 korelovala so stupňom nádoru, lymfatických uzlín, rovnako ako Ki-67. Prostredníctvom mobilného počítanie Kit (CCK) -8 test, prietoková cytometria, tvorby kolónií, hojenie rán a transjamkových testy, in vitro štúdie preukázali, že nadmerná expresia PFTK1 podporoval proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo porazený PFTK1 viedlo k opačným výsledkom. Naše zistenia prvýkrát podporila že PFTK1 by mohli zohrávať dôležitú úlohu v regulácii proliferácie rakoviny žalúdka, migrácie a bude poskytovať novú sľubnú terapeutickú stratégiu na boj proti ľudskej rakoviny žalúdka

Citácia :. Yang L, Zhu J, Huang H, Q Yang, Cai J, Wang Q, et al. (2015) PFTK1 podporuje žalúdka Rakovina Progression regulovaním množenia sa, migrácie a invázie. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10,1371 /journal.pone.0140451

Editor: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Spojené štáty

Prijaté: 7. mája 2015; Prijaté: 25.září 2015; Uverejnené: 21.října 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená dotácií z Natural Science Foundation Číny (No. 81302285, 81402015) č

Konkurenčné záujmy :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú.

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtým najčastejším zhubným nádorom a druhou najčastejšou príčinou úmrtia súvisiace s rakovinou vo všetkých druhoch rakoviny po celom svete [1]. Je ťažké liečiť, ak sa zistí, v ranej fáze [2]. Vzhľadom na nedostatok špecifickosti, včasnej diagnózy rýchlosť je nízka a väčšina pacientov s karcinómom žalúdka, sú na strednej-neskorej fáze, kedy diagnóza. 40% až 60% pacientov s karcinómom žalúdka, rakovina žalúdka získal zvyšok prevádzky sa často pooperačné opakovania a metastáz, tieto charakteristiky vážne ovplyvniť dlhodobé prežitie u pacientov s rakovinou žalúdka [3,4]. Napriek veľkému rozvoju nových diagnostických a liečebných stratégií rakoviny žalúdka, presné molekulárne mechanizmy rakoviny žalúdka zostáva zle rozumieť. To znamená, že identifikácia molekulárnej mechanizmus počas progresie rakoviny žalúdka a metastázy môžu poskytnúť pacientom nové diagnostické a terapeutické stratégie.

PFTK1 (tiež známy ako PFTAIRE1, CDK14) je nový člen Cdc2-príbuzné serín /treonín proteín kinázy, ktorý je prvýkrát identifikovaný u myší nervového systému a je dôležitým regulátorom cyklin a bunkový cyklus [5,6]. Niekoľko štúdie boli vykonané, aby bolo možné určiť ich fyziologické funkcie, alebo biologický význam. Uvádza sa, že PFTK1 je vysoko exprimovaný v mozgu, pankreasu, obličiek, a vaječníkov. CDK sa viažu na špecifické cyklin pole pre vytvorenie funkčnej proteín kinázy komplexy a upravené v časti jeho subcelulárnu lokalizácia [7]. Napríklad, cyklin Y, nová membrána spojená s cyklin, interaguje s PFTK1 zvyšuje PFTK1 kinázovej aktivitu a regrutuje PFTK1 k plazmatické membráne [8]. PFTK1 interaguje s cyklin B2 ko-lokalizáciu v jadre v hepatocelulárny karcinóm [9]. Základné funkcie PFTK1 je označená ako kináza cyklin-dependentnej (CDK) regulačné progresiu bunkového cyklu a bunkovej proliferácie špecificky interagujúce s členmi cyklin proteínov, ako cyklin D3 (CCND3) cyklin Y (CCNY) a tvorí ternárny komplex s bunkového cyklu inhibítor p21, čím sa fosforyluje nádorového supresor Rb pre G1 /s prechodu [10]. Knockout cyklín Y v bunkových líniách gliomových je bunkový cyklus blokovaný v S období [11]. Cyklin Y interaguje s PFTK1 upraviť M fázy mitózy [12]. Tieto zistenia spoločne zapliesť, že PFTK1 môže pôsobiť ako nádorový promótor cez reguláciu bunkového cyklu. Medzitým sa niekoľko štúdií ukazujú, že PFTK1 má aj iné dôležité funkcie. PFTK1 moduluje oligodendrocyty diferenciáciu cez PI3K /Akt dráhy [13]. V poslednej dobe PFTK1 priznáva HCC pohyblivosť buniek cez zneškodnia aktínu viažuci motile potláčajúce funkciu TAGLN2 prostredníctvom fosforylácie [14]. PFTK1 sprostredkované fosforylácie umožňuje asociáciu CAD F-aktinových vlákien, čo má za následok zvýšenie polymerizácie aktínu stresových vlákien, čím podporuje migráciu a inváziu buniek v HCC bunkách [15,16]. Nadmerná expresia PFTK1 môže jej udeliť motile fenotyp v malígnych hepatocytov [9]. Po dohode s molekulárnym zistením, CCNY a /alebo PFTK1 sám môže aktivovať noncanonical Wnt signalizácie zlepšiť pohyblivosť buniek v HCC bunkách [17]. Všetky tieto štúdie naznačujú, že PFTK1 môže byť zapojený do bunkovej proliferácie a motility, však expresiu a význam PFTK1 do buniek karcinómu žalúdka sú stále nejasné.

V našej štúdii sme sa zamerali vykonať komplexnú analýzu PFTK1 expresie a jeho úloha v prognóza buniek karcinómu žalúdka. Skúmali sme expresiu PFTK1 a jeho súvislosť s klinickými charakteristikami a Ki-67 pomocou Western Blot a imunohistochemicky (IHC). Naša štúdia ukázala, že PFTK1 zvýšenú proliferáciu, migráciu a invazivitu buniek karcinómu žalúdka pomocou CCK-8, prietoková cytometria analýzy, analýzy tvorby kolónií, transjamkových testu, ovplyvnil expresiu príbuzných proteínov. Tieto nálezy boli hlásené najprv v rakovinových bunkách žalúdka a môže poskytnúť nový vhľad do vývoja experimentálnych terapií u karcinómu žalúdka.

materiáloch a metódach

Tkanivové vzorky

Sto šesťdesiat onú vzorky žalúdočné rakovina tkaniva a uzavreté priľahlé noncancer tkaniva boli vybrané z pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok v rokoch 2007 až 2013 na Ústave patológie nádoru nemocnice Nantong. Tieto tkanivá boli uchovávané pri -80 ° C a bezprostredne po chirurgickom odstránení. Pre histologické vyšetrenie, všetky vzorky žalúdočné tkaniva boli fixované v 10% pufrovanom formalínu a vložené do parafínu pre krájanie. Resekciou vzorky boli klasifikované podľa siedmeho vydania TNM klasifikácie pre rakoviny žalúdka [1] .Všetky klinicko informácie obsiahnuté vek, pohlavie, hĺbku infiltrácie, stav diferenciácie, lymfatických uzlín, nervy inváziu a TNM štádium. Schválenie odobratých tkanív na výskumné účely bola získaná z nemocnice na etická komisia Nantong nádoru. Podpísaný informovaný súhlas bol tiež získaný z každého pacienta. Hlavné klinické a patologické premenné boli zhrnuté v tabuľke 1.

Western blot analýza

test Western blot bola použitá na detekciu niektorých proteínov [18-20]. Po prvé, žalúdočné Caner tkanivá a bunky boli popraskané v lyzačním pufru (1 M Tris-HCl, pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% síran sodný (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% sodného deoxycholát, 10 ug /ml aprotinínu, 1 mM PMSF, 10 ug /ml leupeptinu) a potom sa odstredí pri 10000 x g počas 30 minút pre zber supernatantu. Supernatant bol zriedený v 2 x SDS nanášacieho pufra a varené. Ekvivalentné množstvo proteínov z každej vzorky boli podrobené elektroforéze 10% dodecyl síran sodný-polyakrylamidovom gélu (SDS-PAGE) a následne prevedené na na Polyvinylidénfluorid (PVDF) membránu (Millipore, Bedford, MA). Po tom, membrány boli blokované po dobu asi 2 hodín pri teplote miestnosti a potom inkubované cez noc pri 4 ° C s primárnymi protilátkami. Po premytí fosfátovým pufrom (PBS) s obsahom 0,1% Tween 20 trikrát, zakaždým po dobu 5 min, membrány sa potom inkubujú s chrenovou peroxidázou spojené IgG ako sekundárna protilátka pre ďalšie 2 hodiny pri teplote miestnosti. Membrány potom boli vyvinuté s použitím systémov detekcie ECL (zobrazovacie technológie, Ontario, Kanada). Protilátky použité v tejto štúdii zahŕňali: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-cyklin E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-katenin (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

Imunohistochemické analýzy

stručne povedané, tkanivové rezy boli zbavené vosku v xyléne a rehydratovaný cez odstupňovaných etanolu. Potom sekcie rozloží na 3% methanolického peroxidu po dobu asi 10 minút, aby sa blokovanie endogénnej peroxidázy. Od vysokého tlaku a teploty v autokláve, jeho imunoreaktivita bola zvýšená v 0,1 M citrátovom pufri po dobu 3 min. Tkanivové rezy boli inkubované s anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) a anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) po dobu 120 minút pri teplote miestnosti. V súlade s pokynmi výrobcu, po premytí vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (PBS), boli tkanivá inkubované s chrenovou peroxidázou konjugovanou anti-myšou Ig polyméru ako druhú protilátkou (Dako Envision kit,) počas 20 minút pri teplote miestnosti. Nakoniec sa rezy boli kontrastne zafarbené hematoxylínom, dehydrované, a namontovať živice držiaku. Pre kvantifikáciu PFTK1 a expresiu proteínu Ki-67, a to ako rozsah imunoreaktivity a intenzity boli vyhodnotené a skóroval. Päť vysoko výkonné pole bola vybraná náhodne pre každý úsek a najmenej 300 bunky boli počítané na poli. Pre štatistickú analýzu PFTK1, každý snímok bola hodnotená pomocou semikvantitatívny bodovacieho systému pre obe intenzity škvrny a percento pozitívnych nádorových buniek. Bunky boli hodnotené nasledovne: 1 (≤25% nádorových buniek zafarbených), 2 (26% až 50% nádorových buniek farbených), 3 (51% až 75% nádorových buniek farbených), 4 (76% -100% nádorové bunky morený). Pre vyhodnotenie hustoty: 1 slabé farbenie; 2 mierne farbenie; 3 silné farbenie. Potom sa násobí dvoma skóre a klasifikované do dvoch skupín: nízku expresiou a vysokou expresiu. Pokiaľ ide o štatistickú analýzu Ki-67, < 50% nádorových buniek sfarbených, ako nízku expresiou a ≥ 50% nádorových buniek sfarbených ako vysokú expresiu. Aby sa zabránilo technické chyby, farbenie bol opakovaný trikrát a boli získané podobné výsledky.

Bunkové kultúry a prechodná transfekcia

MGC803 a HGC27 boli žalúdočné bunkové línie, ktoré boli zakúpené z knižnice bunkovej čínskej akadémie vied. Obaja boli kultivované v RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). SGC7901 a GES1 boli ďalšie žalúdočné bunkové línie, ktoré boli láskavo poskytnuté Ústav patológie výskum Nantong univerzity. SGC7901 a GES1 boli kultivované v DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). Všetky médium boli vykonané s 10% fetálneho teľacieho séra (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) doplnenom 2 mM L-glutamínu, 100 U /ml penicilínu-streptomycín zmes (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), pri 37 ° C a 5% CO _{2. PFTK1 malé interferujúce RNA (siRNA) boli navrhnuté a syntetizované Shanghai génoch (Čína). Sírne cielenie PFTK1 sekvencie boli nasledovné: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. Flag-PFTK1 plazmid bol zakúpený od Shanghai génoch (Čína). Lipofectamine 2000 transfekční činidla (Life Technologies), bol použitý pre transfekciu buniek podľa inštrukcií výrobcu.}

prietokovej cytometrie

Po prvé, všetky bunkové línie žalúdočnej boli fixované v 70% etanolu cez noc pri -20 ° C C. Po druhé, po premytá citrát-fosfátovom pufri a PBS boli bunky inkubované s 1 mg /ml RNaseA počas 30 minút pri teplote 37 ° C. Potom boli bunky zafarbené 50 ug /ml propidium jodidu vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) -Triton po dobu ďalších 20 minút pri teplote 4 ° C. Nakoniec boli bunky analyzované pomocou prietokového cytometra Becton Dickinson BD FACScan (San Jose, CA) a CellQuest analytických programov akvizičných. Pokus bol vykonaný trikrát.

testy tvorby kolónií

MGC803 Bunky boli kultivované v šestijamkových kultivačných doštičkách (Corning, Corning New York), pri hustote 200 buniek /jamka po transfekciu PFTK1 #siRNA a Flag-PFTK1 v súlade s pokynmi výrobcu. Po dvoch týždňoch boli bunkové kolónie (≥ 50 buniek /kolónia) boli počítané farbením 0,5% kryštálovej violete.

testoch bunkovej proliferácie

MGC803 bunky, ktoré obsahovali bežné, transfekcia PFTK1 # siRNA a Flag-PFTK1 boli schovať na 96-jamkové bunkové kultúry klastrových doštičiek (Corning, Corning New York), pri hustote 2 x 10 ^{4 buniek /jamku v 100 ul kultúry, pestované cez noc. Podľa pokynov výrobcu, bunky boli merané pomocou komerčného CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko). CCK-8 činidla bolo pridané do každej jamky po dobu 2 h inkubácie pri 37 ° C. Absorbancia bola odpočítaná pri vlnovej dĺžke 450 nm pri automatickej čítačke doštičiek. Pokusy sa musia opakovať najmenej trikrát.}

hojenie rán test

MGC803 Bunky boli kultivované v šestijamkových kultivačných doštičkách (Corning, Corning New York) v hustote 5 x 10 ^{5 buniek /jamku a pestované do zhlukovania cez noc. Po transfekovány 48 hodín, boli bunky inkubované s médiom bez séra. Čiara sa poškrabal v Conflent vrstvy buniek s použitím koniec Fie o pipety 10 ml (čas 0) a bunky boli premyté PBS. Obrazy migrujúcich buniek boli postupne užívať po 24 h, 48 h pri uzavretí zranenej oblasti.}

Trans-no migračný test

Migrácia buniek test bol vykonaný za použitia transjamkových komory (8,0 lm veľkosť pórov , Costar, Cambridge, NY, USA). Asi 1 x 10 ^{5 buniek /ml boli vrúbľovať v horných komorách v médiu RPMI-1640 a bol pridaný do spodnej komory. Po 24 hodinách hornej bunky, ktoré neboli migrované boli odstránené a spodné bunky, ktoré boli migrované boli fixované paraformaldehydom a zafarbené kryštálovou violeťou. Počet migrujúcich buniek v 5 poliach bola počítaná na základe 200 x zväčšenie, a boli stanovené prostriedky pre každú komoru. Všetky experimenty boli opakované trikrát}

Trans-no invázie test

Migrácia buniek test bol vykonaný za použitia transjamkových komory (8,0 lm veľkosť pórov, Costar, Cambridge, NY, USA) .. BD MatrigelTM bazálny membrána Matrix bol pridaný do hornej komory po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C. Potom sa 500 ul média obsahujúceho chemostatický faktor sa umiestni do dolnej komory. Asi 1 x 10 ^{5 buniek /ml boli vrúbľovať v horných komorách pri teplote 37 ° C počas 24 h.Cells potom boli fixované paraformaldehydom a zafarbené kryštálovou violeťou. Všetky experimenty boli opakované trikrát.}

Štatistická analýza

Všetky štatistická analýza bola boli vykonávané pomocou SPSS Štatistiky 19 softvérový balík. PFTK1, Ki-67 expresie a patologickým rysy boli analyzované pomocou χ ^{2 test. Celkové Krivky prežitia boli vypočítané pomocou metódy Kaplan-Meier a boli testované pomocou log-rank testu. Multivariačný analýzy bolo analyzované pomocou Coxovho modelu proporcionálneho rizika pomeru rizika a jeho 95% interval spoľahlivosti boli zaznamenané pre každý marker. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SE, a P Hotel < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.}

Výsledky

PFTK1 je nadmerne exprimovaný v žalúdočných nádorových tkanivách

Uvádza sa, že PFTK1 je dôležitým cyklin-dependentný kináza, ktorá môže regulovať bunkový cyklus, ale výskum rakoviny žalúdka nebol nikdy neskúmal. Vzhľadom k tomu, sa zistilo, že nadmerná expresia PFTK1 v rakoviny pečene a rakoviny pažeráka v porovnaní s normálnymi tkanivami. Takže je zaujímavé analýzy expresie PFTK1 v žalúdočných nádorových tkanivách a jeho coorelation s jadrový antigén proliferujúce bunky (PCNA). Po prvé, sme skúmali expresiu PFTK1 v 8 párov žalúdočných nádorových tkanív a ich zodpovedajúce nontumorous žalúdočnej sliznice pomocou Western Blot. Ako je znázornené na obrázku 1, v porovnaní so susednými normálnych tkanivách, upregulace PFTK1 bola detekovaná vo všetkých ôsmich žalúdočné tkaniva v súlade s PCNA. S cieľom potvrdiť klinický význam PFTK1 v progresii rakoviny žalúdka, imunohistochemická (IHC) analýzy bol použitý pozorovať expresiu proteínu v PFTK1 161 žalúdočných rakovinových tkanív. Ako sa dalo očakávať, expresie PFTK1 a grade tumoru boli negatívny vzťah. PFTK1 mali významne vyšší expresiu v zle diferencovaných jedincov ako u dobre diferencovaných exemplárov, čo bolo v súlade s Ki-67. PFTK1 bol exprimovaný v bunkovej membráne, zatiaľ čo cytoplazma, Ki-67 predovšetkým v jadre. Výsledkom bolo to zobrazené na obr 2. Potom sme skúmali vzťah medzi PFTK1 a Ki-67 od Pearsonov korelačný koeficient. Môžeme vidieť na obrázku 3a, ktorý PFTK1 bol pozitívne spojená s Ki-67 (Pearsonovho y = 0,833, P Hotel <0,001).

PFTK1 je spojená s nežiaducimi klinickými charakteristikami a chudobné žalúdka nádoru prežitie

štúdie Klinická združenia pacientov bol preskúmaný pre analýzu korelácie PFTK1 s rakovinou žalúdka klinicko-funkcií medzi 161 tkanív. Tieto klinicko-patologické údaje boli uvedené v tabuľke 1. Vysoká expresia PFTK1 súvisela s stupňa nádoru ( P
= 0,009), hĺbku infiltrácie ( P
= 0,002), lymfatických uzlín ( P
= 0,000), rovnako ako Ki-67 ( P
= 0,000). Ale nebola žiadna korelácia medzi expresiou PFTK1 a iných klinických premenných, ako je vek, pohlavie, nervové invázie a TNM fáze.

Okrem toho, Kaplan-Meierova analýza bola použitá na analýzu spojenie medzi PFTK1 prejavu a 161 pacientov prežitie. Podľa krivky prežitia, vysoká expresia PFTK1 zrejme koreluje so zlou celkové prežitie, zatiaľ čo nízka expresia PFTK1 korelovala s lepšie celkové prežitie. A stredná doba prežitia a pomer rizika bol ukázal na obrázku 3B. Okrem toho univariantní analýza v žalúdočných rakovinových tkanív ukázala, že stupeň tumoru ( P
= 0,020), hĺbka preniknutia ( P
= 0,011), lymfatické uzliny invázie ( P
= 0,011), TNM stupeň (P = 0,031), PFTK1 výraz ( P
= 0,002) a Ki-67 expresie ( P
= 0,013) boli prognostické faktory celkového prežitia (Tabuľka 2 ). Analýza s mnohými premennými pomocou Coxovu modelu proporcionálneho rizika navrhol PFTK1 bolo nezávislé prognostické ukazovatele celkového prežitia pacientov ( P
= 0,048, tabuľka 3). Ak zhrnieme, naše výsledky ukazujú, že expresia PFTK1 je významne spojená s klinickými charakteristikami a zlé celkové prežitie.

Expresia PFTK1 v nontransfected a transfekciou buniek karcinómu žalúdka

PFTK1 je nadmerne exprimovaný v žalúdočných nádorovom tkanive, potom sme analyzovali expresiu PFTK1 v bunkových líniách, vrátane MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. Z obrázku 4A, expresiu PFTK1 v normálnej bunkovej línie žalúdočné GES1 bola nižšia ako v bunkových líniách žalúdočných MGC803, SGC7901, HGC27. Pre ďalšie štúdium funkcie PFTK1 do buniek karcinómu žalúdka in vitro,
MGC803 bunky boli transfekovány PFTK1-siRNA a SGC7901 bunky boli transfekovány Flag-PFTK1. Western blot bol použitý na meranie expresie PFTK1. Keď bol Flag-PFTK1 transfekciu SGC7901, PFTK1 mal vyššiu expresiu (obr 4B). Kým PFTK1-siRNA bol transfekován do MGC803, PFTK1-siRNAdosiahol najvyššieho porazený účinnosť v porovnaní s ostatnými PFTK1-siRNA (obr 4C). Takže sme vybrali Flag-PFTK1 a PFTK1-siRNA, aby aj naďalej tieto experimenty.

PFTK1 môže podporovať bunky migrujú a invazívne in vitro

Uvádza sa PFTK1 nadmerná expresia môže zvýšiť CAD fosforylácii a zvýšiť CAD viazať F-actins, ktoré podporujú hepatocelulárneho karcinómu buniek migrácii [16]. Vzhľadom na to, že PFTK1 bol spojený s lymfatických uzlín invázie v roku vzoriek s karcinómom žalúdka, sme študovali, či PFTK1 by mohli mať vplyv žalúdočné rakovinové bunky migráciu a inváziu. Hojenie rán testu a transjamkových testy ukázali, že migrácia Flag-PFTK1 buniek bola významne zvýšila v porovnaní s kontrolnými bunkami. Naopak, migrácia PFTK1-siRNAbunky boli v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr 5a a 5b) znížená. Ďalej Matrigelové invázie Testy tiež preukázali, že zvýšenie expresie z PFTK1 podľa transfekciu Flag-PFTK1 mohol posunúť invazívne schopnosť, a porazený z PFTK1 mohla zmierniť invazívna schopnosť rakovinových buniek žalúdka (obr 5c). Celkovo možno povedať, mohli by sme dospieť k záveru, že PFTK1 podporovať migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka.

Vyjadrenia PFTK1 podporovať proliferáciu žalúdočných rakovinových buniek

Podľa výsledkov vyššie uvedených, PFTK1 bol pozitívne koreluje s PCNA, Ki-67 expresie a grade tumoru, ktoré boli bunky proliferačnú marker. Analyzujeme rolu PFTK1 na reguláciu proliferácie schopnosti. Po prvé, MGC803 bunky boli transfekovány PFTK1-siRNA, Flag-PFTK1 a boli stanovené CCK-8 testu. Nadmerná expresia PFTK1 preukázané, že zvýšenie žalúdočné bunky tempo rastu ako kontroly, zatiaľ čo Vyradenie PFTK1 ukázala, opačný výsledok (obr 6A). V súlade so zvyšujúcou rýchlosť rastu buniek po PFTK1 nadmernou expresiou, Test kolónie tvoriace tiež ukázala, že by sa mohol zvýšiť tvorbu kolónií. A Vyradenie PFTK1 ukázal rovnaký výsledok s CCK-8 testu (obr 6B). Nakoniec sme skúmali proliferačnej mechanizmus PFTK1 pomocou prietokovej cystometrické analýzy a dáta naznačujú, že viac buniek karcinómu žalúdka boli nájdené v S fáze v prítomnosti ektopické PFTK1, rakovinové bunky menej žalúdka boli nájdené v S fáze v transfekciu s PFTK1- siRNA(obr 6C). Aby sme to zhrnuli, tieto dáta ukázali, že PFTK1 podieľala na reguláciu bunkového cyklu zrýchlením G0 /G1 -s prechod.

Signál dráha PFTK1 pri podpore proliferácie a migrácie

Pre ďalšie štúdium mechanizmu ktorý PFTK1 regulované žalúdočné rakovinové bunky proliferáciu, migráciu, inváziu, sme sa rozhodli pre detekciu related proteín zmenil westernovým prenosom, kedy PFTK1 bol nadmerne vystavený alebo porazený v MGC803. Ako bolo oznámené, PFTK1 mohol aktivovať noncanonical Wnt signalizácie v hepatocelulárneho karcinómu [17]. Wnt signalizácie súvisela s šírením nádory a migrácie. Upregulace PFTK1 čiastočne aktivovaný Dvl2, Naked1, MMP2 a zvýšenej expresiu regulátor bunkového cyklu cyklin E, ale nemení Dvl1, p-katenin. A čo viac, sme zistili, že vyraďujúce endogénne PFTK1 expresie by mohla znížiť Dvl2, Naked1, MMP2 cyklin E výraz, ale nemení Dvl1, p-katenin (obr 7).

Diskusia

Byť jeden z najvyšších výskytov rakoviny na svete, 5-ročné prežitie rakoviny žalúdka je nižšia ako 20% -25% v USA, Európe a Číne kvôli ľahké relapsu a vysokou mierou metastáz v pooperačnej [2]. Infekcia Helicobacter pylori, zmena onkogénnych a tumor supresorových génov, regulácia bunkového cyklu a aktivácia telomerázy sú spojené s rakovinou žalúdka [21]. Abnormálne regulácia bunkového cyklu vo vývoji rakoviny žalúdka bola predmetom výskumu v posledných rokoch. Presné a prísna regulácia bunkového cyklu závisí od viacerých faktorov vrátane kontroly bunkového cyklu závislé kinázy (CDK), bunkového cyklu proteín (cyklin) a závislé kinázy inhibítory bunkového cyklu (CKIS). Každý, kto je oboznámený s 11 klasickými CDK (CDK1-11), PFTK1 ako závislé kinázy nového bunkového cyklu nie je zistený spolu a spojenie medzi PFTK1 a rakoviny nie je moc, a to aj v karcinómu žalúdka [22].

PFTK1 bol pôvodne nájdený v nervovom systéme krýs [23]. PFTK1 moduluje oligodendrocyty diferenciáciu cez PI3K /Akt dráhy [13]. Najnovšie výskumy uvádzajú, že PFTK1 je up-regulovaná v ľudskej rakoviny pažeráka, hepatocelulárny karcinóm a spolupracovníkov s rastom nádoru, migráciu a inváziu [14,24]. V našej štúdii sme skúmali, či je expresia PFTK1 bol zapojený do žalúdka rakovinových buniek množenia sa, migrácie a invázie. Najprv sme preukázali, že PFTK1 vyjadrený vyššie v žalúdočných rakovinové tkanive ako v okolitých tkanivách nontumor vo Western Blot, že v súlade s výsledkami v iných zhubných nádorov (obrázok 1). Následne, imunohistochemické vyšetrenie ukázala vysokú expresiou PFTK1 súvisela s grade tumoru, hĺbka infiltrácie, lymfatických uzlín, rovnako ako Ki-67 v 161 žalúdočné rakovinové tkanive. Tieto zistenia vyzvaní PFTK1 môže mať vplyv na žalúdočnú proliferáciu a migráciu rakoviny. Kaplan-Meierova analýza ukázala, že PFTK1 predvídať zlé celkové prežívanie (obr 3b). Analýza s mnohými premennými pomocou Coxovu modelu proporcionálneho rizika navrhol PFTK1 bolo nezávislé prognostické ukazovatele celkového prežitia pacientov. S cieľom ďalšieho pochopenie regulačný účinok na PFTK1 žalúdočných bunkách, MGC803 bunky boli transfekovány PFTK1-siRNA, Flag-PFTK1 in vitro
(obr.4). Obrázok 6 ukázal PFTK1 mohol podporovať proliferáciu CCK-8, stanovenie tvoriacich kolónie. V rovnakej dobe, PFTK1 zvyšuje premenu fázy G1-S podľa prietokovej cytometrie, ktorý sa zhoduje s nálezom PFTK1 v hepatocelulárneho karcinómu [10]. Cyklin E je jedným z dôležitých regulačných faktorov v priebehu transformácie G1-S fáze a cyklin E proteín by mohol definujú ako prognostický faktor u pacientov s karcinómom žalúdka, [25]. Je zaujímavé, že hladina PFTK1 bola zvýšená po transfekciu s Flag-PFTK1 consistented s PCNA, MMP2 a cyklin E (obr 7).

Okrem toho sme tiež preskúmalo, či PFTK1 by mohli ovplyvniť bunky migrácie a invázie schopnosti tým, hojenie rán test a transwell testy. Výsledky ukázali, že nadmerná expresia PFTK1 by mohla zlepšiť bunky migráciu a inváziu, ktorý by mohol byť v dôsledku zmeny smeru prúdenia za PFTK1 signálnych dráh (obrázok 5). Ako bolo uvedené v hepatocelulárny rakoviny, PFTK1 a /alebo CCNY by sama o sebe aktivovať nekanonický Wnt signalizácie spôsobujúce buniek migráciu a inváziu [17]. Wnt dráhy súčasťou kanonickej Wnt /β-katenin a non-kánonický Wnt signalizačná cestu (Wnt /Ca ^{2+ a Wnt /PCP). Wnt signalizácie spôsob, ako hral dôležitú úlohu v rozvoji rakoviny a regulovaného proliferáciu buniek, migrácia a invázia [26]. Následne sme zistili, že expresia proteínov β-katenin, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 a Naked1 boli pozitívne korelované s PFTK1 a kánonické Wnt /β-katenin príbuzné proteíny beta-cateninu, Dvl1 sa nezmenila (obr 7). Z vyššie uvedeného, ​​preto sa špekuluje, že PFTK1 môže podporovať migráciu a inváziu cez regulačné nekanonický Wnt signalizácie. A boli tu aj články výzva non-kanonické Wnt signalizácie podporuje migrácie a invázie schopnosť rakovinových buniek žalúdka [27,28].}

Stručne povedané, výraz PFTK1 výrazne sa zvýšil v ľudských nádorových tkanív žalúdka. Nadmerná expresia alebo porazený z PFTK1 transfekcia s Flag-PFTK1 alebo PFTK1-siRNAzrejme ovplyvnená žalúdočné rakovinové bunky množenia sa, migrácie a invázie. Naše výsledky v prvom poskytne nové dôkazy o PFTK1 v rozvoji rakoviny žalúdka a dodávky laboratórneho základ pre klinickú liečbu. Ale ďalšie štúdie sú potrebné na pochopenie presný mechanizmus PFTK1 ovplyvnenie proliferácie, migrácie a invázie schopnosť buniek karcinómu žalúdka.

• Ploche ONE: Detekcia a charakterizácia metastatický nádorových buniek v mesogastriu žalúdočných pacientov s rakovinou
• Ploche ONE: Diétne Fat Príjem a riziko rakoviny žalúdka: Meta-Analysis of pozorovacích štúdií