Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Identifikácia a charakterizácia CXCR4-pozitívnej rakoviny žalúdka Stem Cells

abstraktné

Difúzne typ solídne nádory sú často zložené z vysokého podielu zriedka proliferujúcich (tj spiace) nádorových buniek, silne indikujúce zapojenie nádorových kmeňových buniek (CSCS) aj keď difúzna typ rakoviny žalúdka (GC) pacienti majú zlú prognózu z dôvodu vysokej častá rozvoju peritoneálnej šírenia (PD), je obmedzená len známe, že PD-spojené CSCS a účinnosti CSC- zacielenie terapia v difúznej typu GC. V tejto štúdii sme založili vysoko metastatické GC bunkové línie od in vivo
výberu určeného pre obohatenie GC buniek PD-spojené. O microarray analýzy sme zistili, CXC typ receptor chemokínu 4 (CXCR4) môže byť nový marker pre vysoko metastatických SKSK, pretože CXCR4-pozitívne bunky môžu rásť ukotvenie-nezávisle na sebe, iniciovať nádorov u myší, byť odolný proti cytotoxického liečiva, a produkujú diferencované dcérou buniek. V klinických vzoriek, tieto CXCR4-pozitívne bunky boli nájdené nielen z neskorej tvorbu metastáz etape (karta ascitu), ale tiež skoršej fáze (peritoneálnej výplach). Okrem toho liečba transformujúci rastový faktor beta posilnili protirakovinový účinok docetaxelu prostredníctvom indukcie diferenciácie buniek /asymetrického bunkového delenia žalúdočných CSCS CXCR4-pozitívny aj v stave nečinnosti. Z tohto dôvodu, induktory diferenciácie prísľubom pre získanie maximálneho terapeutického výsledku z bežne dostupných liekov proti rakovine napriek opakovaným cyklovanie CSCS

Citácia :. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, K Yanagihara, Nishimura T, et al. (2015) Identifikácia a charakterizácia CXCR4-pozitívnej rakoviny žalúdka kmeňových buniek. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10,1371 /journal.pone.0130808

Editor: Masaharu Seno, Okayama University, Japonsko

prijatá: 18. februára 2015; Prijaté: 25. mája 2015; Uverejnené: 25. júna 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory. Všetky dáta microarray boli uložené v databáze kompatibilný Miami, GEO; prístupové číslo GSE53276

Financovanie :. Táto práca bola podporená v rámci Národný inštitút biomedicínskom inovácie (pre Advanced Research k liekom Mining program ID10-41), ministerstva zdravotníctva, práce a sociálnych vecí Japonska (pre tretie komplexné 10-ročnej stratégie na kontrolu rakoviny H22-007), National Center fondu Cancer výskum a vývoj (25-a-6, 26-a-3). Dr. T Fujita, M Tamaoki a T Nishimura sú príjemcami výskumného Resident Fellowship z Nadácie pre podporu výskumu rakoviny v Japonsku

Konflikt záujmov: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je jednou z hlavných príčin úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete. Histopatologicky, GC možno rozdeliť do dvoch hlavných kategórií: črevnej typu a difúzneho typu. Črevné typu GC prevláda vo vysoko rizikových geografických oblastiach a rozvíja cez niekoľko postupných etapách vrátane Helicobacter pylori
( H
. pylori
) -associated atrofická gastritída, črevné metaplázia (IM) a dysplázia. Naopak difúzna typu GC, čo predstavuje polovicu všetkých pacientov GC, má širokú geografickú distribúciu a rozvíja aj zo H
. pylori
-zdarma, morfologicky normálne žalúdočnej sliznice, bez atrofickej gastritídy, alebo rýchle a difúzneho typu GC sa môže líšiť od črevného typu ako geneticky a fenotypovo [1-5]. Na rozdiel od klesajúcej výskyt črevnej typu, prevalencia difúzneho typu je údajne zvyšuje po celom svete [6]. Prognóza pre pacientov GC pokročilých difúzna typu je naďalej zlá za posledných desať rokov kvôli vysokej miere peritoneálnej šírenia (PD) (78%) v porovnaní so situáciou črevnej typu (45%) [7]. Najmä pacienti s typom Bormann IV GC majú extrémne zlú prognózu, a to aj v prípade, že prijaté multidisciplinárny liečbu [8]. Z tohto dôvodu adresovania PD je naliehavá otázka pre zlepšenie prognózy pacientov s difúznou typu GC.

difúznu typu GC sú typicky charakterizovaný rozsiahlym stromálnych fibróza so zlou prekrvenie a vzácne proliferačného ( i
. e
. spiace) rakovinové bunky, čo vedie k podstatnému terapeutickej odpor. Z hľadiska chemoterapia, transformujúci rastový faktor beta (TGF-beta) je myšlienka prispieť k agresívnemu progresii cez epiteliálne-mezenchymálnych prechodu a indukuje fibrózu [9]. Avšak, TGF-β tiež inhibuje bunkovú proliferáciu, indukuje apoptózu, a sprostredkováva diferenciáciu epitelových buniek, čo naznačuje, že zložky s TGF-β signálnych dráh majú aktivitu nádoru potlačujúci v epiteliálnych nádorov [10, 11]. Aj keď nahromadili dôkazy ukázali, že je rozhodujúcu úlohu TGF-p v rakovinových kmeňových buniek (CSC) biológia, je obmedzené množstvo informácií o svojej úlohe v difúznej typu GC.

Bolo zistené, že každá populácia nádorových buniek zobraziť funkčné heterogenity vyznačuje osobitnými proliferácie a diferenciácie kapacity rôznych typov nádorov [12]. Účet pre také nádoru heterogenity, boli navrhnuté dva modely: klonálnej vývoj modelu [13] a model CSC [14]. Tento model získal širokú pozornosť, pretože poskytuje rozumné vysvetlenie odolnosť voči konvenčné chemo- a rádioterapia, kde kľudové alebo pomaly-cyklistické SKSK prežili, a vedie k prípadnému relapsu ochorenia [15-17]. Preto terapeutické stratégie zamerať CSCS sú nevyhnutne potrebné odstrániť reziduálne choroby a v snahe zabrániť nielen vo GC, ale aj ďalších typov rakoviny. Okrem toho sa súčasnými vhľad do bunkových mechanizmov karcinogenézy je metastatické potenciál nádorových buniek je pripočítaný SKSK, ktoré môžu klonovo iniciujú tvorbu nádorov u vzdialených miest [18 19]. Aj keď bola navrhnutá celá rada povrchových molekúl, ako CSC markery v širokej škále ľudských nádorových ochorení, nedošlo k žiadnej identifikačný znak pre PD-spojené SKSK v GC [20-23]. Na identifikáciu takých značiek, sme zvažovali predstavu, že funkčne a geneticky heterogénne nádory majú spoločné a vnútorné mechanizmy údržby nádoru podľa kontextu daného mikroprostredie. V dôsledku toho sme predpokladali, že SKSK by mali byť definované funkčne dobre overených testoch, ako je in vivo
transplantáciu. V difúzne typu GC, sme sa najprv zamerali na pobrušnice špecifické kolonizáciu buniek a obohatil PD-spojený CSCS opakovanými in vivo
výberov [24, 25]. Tu sme zistili, CXC typ receptor chemokínu 4 (CXCR4) môže byť marker pre PD-spojené žalúdočné SKSK a preukázané, že TGF-β zlepšuje účinnosť protinádorových liečiv indukciou /asymetrického delenia bunkovej diferenciácie buniek v CXCR4 + populácie CSC aj vo spiacim stave.

materiáloch a metódach

Klinické vzorky

Klinické vzorky boli poskytnuté štátnej nemocnici Cancer Center (Tokyo, Japonsko) po obdržaní písomný informovaný súhlas od každého pacienta a po schválení National Cancer Center Institutional Review Board (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

bunkových línií a primárnych kultúrach

ľudskou GC bunkové línie, HSC-60 bola stanovená pomocou spolupracovníkom s použitím postupu, ako bolo opísané skôr [26]. Vysoko peritoneálnej-metastatické bunková línia, 60As6 vznikla z HSC-60 za použitia ortotopické tkaniva implantáciu do SCID /SCID myší, ako je stručne nasledovné: xenografted nádor HSC-60 buniek transplantovali do steny žalúdka myši. opakované sme šesť cyklov nádorových buniek úrodu ascitických a ortotopické inokulácii týchto buniek. Tieto dve bunkové línie boli udržiavané v médiu RPMI-1640 doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra. Máme tiež založila dva luciferázy expresiou bunkových líniách (HSC-60Luc a 60As6Luc). Šesť ďalších GC-odvodené bunkové línie (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 a KATO III) boli udržiavané za rovnakých podmienok. Z týchto šiestich, HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, a 58As9 boli stanovené podľa vyššie uvedeného postupu [27, 28], a KATO III bol získaný z American Type Culture Collection. Pre primárne kultúry, bunky boli zhromaždené z peritoneálnymi výplachu a ascitu pacientov (NSC-16C, NSC-20C, a NSC-22C) a kultivované v k médiu RPMI-1640 doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra.

microarray analýza

Celková RNA 60As6, 60As6Luc, HSC-60 a HSC-60Luc buniek bola izolovaná suspendovaním buniek v lyzačním pufri ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japonsko) a následne izopropanolu zrážkami. Vykonali sme microarray analýzy dvakrát pomocou ľudského genómu U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Tieto postupy boli vykonané podľa protokolov dodávateľov. Čipy boli skenované pomocou skenera GeneChip 3000 (Affymetrix) a dáta boli analyzované Microarray Suite verzie 5.0 s nastavením analýzy Affymetrix predvolené a globálne mierky ako metóda normalizácie. Zväčšený priemer Cieľ intenzity každého poľa sa ľubovoľne nastaviť do 1000. Všetky dáta microarray bolo uložené do kompatibilnej databázy Miami, GEO; prístupové číslo GSE53276. U 2-násobné zmeny, 684 génov boli vybrané ako špecifických génov pre 60As6 a 60As6Luc buniek a 1150 gény boli vybrané pre HSC-60 a HSC-60Luc buniek.

Pokusy na zvieratách

Six -week-stará žena C.B17 /ICR-SCID (SCID /SCID) myší (CLEA Japan, Japonsko) boli chované pri teplote miestnosti 12 h svetlo /tma dennom cykle. Myši boli udržiavané pri špecifických podmienkach bez patogénov a za predpokladu, sterilná potrava, voda a klietok. 1 x 10 4-1 x 10 6 nádorových buniek sa suspenduje v 1 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a potom sa vstrekuje do brušnej dutiny za použitia 26 1/2 ihlou. Myši boli zvážené a merané raz týždenne. Humane Endpoint kritériá zahrnuté významné akumuláciu brušných ascitu, dýchavičnosť, piloerekcia, anémia, alebo stratu hmotnosti viac ako 10% pôvodnej hmotnosti. Všetky pokusy boli vykonávané v súlade s etickými smernicami Medzinárodnej asociácie pre štúdium bolesti a boli schválené Výborom pre etiku vo pokusov na zvieratách z National Cancer Center. Dôraz bol kladený na minimalizáciu počtu a akékoľvek utrpenie zvierat používaných pri pokusoch.

RT-PCR

Celková RNA bola izolovaná suspendovaním buniek v ISOGEN lyzačním pufri s následným izopropanolu zrážkami. Semi-kvantitatívnej RT-PCR bola vykonávaná v lineárnom rozsahu od 25 do 30 cyklov za MUC5AC
, CXCR4
, CXCR7
, CXCL12
LGR5
TGFBR1
TGFBR2 stroje a ACTB
s použitím nasledujúcich primerov: 5'-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 'a 5'-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 'pre MUC5AC
, 5'-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3' a 5'-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3 'pre CXCR4
, 5'-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3' a 5'-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3 'pre CXCR7
, 5'-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 'a 5'-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3' za CXCL12
, 5'-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 'a 5'-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3' za LGR5
, 5'-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 'a 5'-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3' pre TGFBR1
, 5'-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 'a 5'-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3' pre TGFBR2 stroje a 5'-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 'a 5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3' za ACTB
.

imunocytochemie

Nepriama fluorescenčné imunocytochemie bola vykonaná pre CXCR4, MUC5AC a Smad2 /3 z buniek pestovaných v sklíčka 4-jamkových komôr. Bunky boli fixované v 4% paraformaldehydu pri teplote miestnosti po dobu 20 minút. Po trikrát premytí v PBS (-), ktoré boli inkubované s anti-human CXCR4 monoklonálne protilátky (R &D Systems, Minneapolis, MN), anti-humánne MUC5AC protilátka (Santa Cruz Biochemistry, Santa Cruz, CA) alebo anti ľudský Smad2 /3 protilátky (BD Biosciences, Bedford, MA), nasledovala inkubácia s 1: 1000 riedenie oslie anti-myšou Alexa 488-konjugovanej sérum (Invitrogen, Grand Island, NY) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Jadrá bunky boli zafarbené s 4 ', 6-diamidínov-2-fenylindolu (DAPI) dihydrochloridu (Invitrogen, Carlsbad, CA). U bunkové línie testu, radené jediný CXCR4 + malé bunky boli zafarbené podľa CellTracker Green (Invitrogen) pri pátraní po životaschopné bunky.

prietokovej cytometrie a bunkové triedenie

60As6 bunky (1 x 10 6 buniek) boli spoločne inkubované počas 30 minút pri 4 ° C s nasledujúcimi protilátkami: APC anti-human CD184 (CXCR4) (IgG2a, klon 12G5), alebo APC myší IgG2a, k izotypovo kontroly získané z BioLegend ( San Diego, CA). Mŕtve bunky boli značené pomocou propidium jodidu a vylúčené z analýzy. V bunkovej triedenia sa CXCR4-pozitívne a negatívne CXCR4-subpopulácia boli purifikované s použitím bunkového triedičky JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japonsko), a boli analyzované pomocou softwaru FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Na analýzu bunkového cyklu boli bunky prenesené na médiu bez séra počas 5 dní, a následne sa zožne 0,05% trypsín-EDTA a potom suspendovaný vo chladnej 80% etanolu. Po upevnení cez noc pri -20 ° C boli vzorky premyté v PBS (-) a inkubované v 500 ul PI /RNázy Farbenie pufra (BD Pharmingen, San Diego, CA) na 1 x 10 6 buniek po dobu 30 minút pri pri izbovej teplote pred analýzou. Prietoková cytometria bola vykonávaná s použitím FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ) a analyzované pomocou softvéru FlowJo.

Anchorage Rast nezávislý bunková skúška

Mäkká test tvorby kolónií agar bola vykonaná pomocou CytoSelect 96-jamkové testovacie Cell Transformácia Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) podľa návodu výrobcu. V stručnosti, 5 x 10 3 CXCR4-pozitívne alebo CXCR4-negatívne malé bunky boli suspendované v DMEM obsahujúcom 0,4% topenia Agarose a 10% FBS a nanesú na 1% nízkotajícím agarózy obsahujúci DMEM a 10% FBS. Po inkubácii buniek počas 5 dní pri teplote 37 ° C v 5% CO 2, boli bunky lyžovanie a detekované CyQuant GR farbivom. Fluorescencia tvorby kolónií buniek sa odpočítala Multifunkčná Microplate Reader (Tecan, Safire Mannedorf, Swizerland) pri vlnových dĺžkach excitácie /emisie z 485/520 nm.

Invasion test

invázie buniek sa stanoví za použitia BD BioCote invázie tumoru Assay System (BD Biosciences) podľa inštrukcií výrobcu. Stručne povedané, 4 x 10 5 60As6 buniek médiu bez séra boli vrúbľovať do hornej komory systému. Spodná jamky boli naplnené médiom s 10 ng /ml SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po 24 hodinách inkubácie sa bunky v hornej komore boli odstránené a bunky, ktoré napadli cez membránu Matrigel boli zafarbené farbivom Diff-Quick (BD Biosciences) a počítané manuálne.

Caspase test

na 60As6 bunky boli pripravené v 96-jamkové doštičke (5 x 10 3 buniek /jamku). Test kaspázy 3/7 sa vykonáva za použitia kaspázy-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI) na 24 hodín po pridaní rekombinantného TGF-β1 (240-B, R &D systems), do bunkovej kultúry v koncentráciu 2 ng /ml.

rastových testoch bunkovej

pre stanovenie IC 50 hodnoty proti docetaxelu (DOC), a to ako HSC-60 a 60As6 bunky boli kultivované v prítomnosti 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tokyo, Japan) počas 4 dní pri teplote 37 ° C v 5% CO 2 a následne bežným testom MTT. Pre validáciu kombinovanú liečbu s Doc a TGF-beta, všetky 60As6 buniek a 2 primárne kultúry (NSC-16C a -22C) sa pripraví v 6-jamkové doštičky (1 x 10 5 buniek /jamka) a následne liečba s Doc (2,5 nM) a TGF-D1 (0 alebo 2 ng /ml) po dobu 72 hodín pri teplote 37 ° C v 5% CO 2. Bunky boli zafarbené trypánovej modrej a počítal s TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA).

Štatistická analýza

Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± SE a analyzované za použitia nepárová t-test. Prijatá Hladina významnosti bola p Hotel < 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) bol použitý pre všetky štatistické analýzy.

Výsledky

Fenotypové rozdiely medzi rodičovskými HSC-60 buniek a vysoko tumorigénny Subline 60As6 buniek

pri riešení problému difúzna typu GC-spojený PD z hľadiska molekulárnej a bunkovej biológie, sme založili veľmi peritoneálnej-metastatické bunkové línie, 60As6, z odvodené bunkové línie difúzna typu GC, HSC-60, a to prostredníctvom in vivo
výbery pozostávajúce z ortotopické naočkovaní nádorových buniek a izoláciu tých vysoko metastatické z ascitu imunodeficientných myší [25]. Hoci zdvojnásobenie čas týchto dvoch bunkových línií bola porovnateľná (30 hr pre HSC-60 a 31 h pre 60As6) in vitro
, 60As6 bunky tvorené viac nádorové uzlíky rýchlejšie po intraperitoneálnej inokuláciou myší. Stredná doba prežitia bola 167 dní po implantácii 5 x 10 6 HSC-60 bunky, zatiaľ čo implantácie s rovnakým počtom 60As6 buniek viedla k pozoruhodnej tvorbe krvavé ascitu a stredná doba prežitia bola iba 28 dní. Kotvenie-nezávislosť môže byť požadované pre prežitie voľných nádorových buniek v peritoneálnej dutine a pre kolonizáciu. V teste tvorby kolónií, 60As6 bunky tvoril oveľa viac kolónií v porovnaní s HSC-60 buniek (S1 Obr), ktorá ukazuje, že 60As6 má vysokú schopnosť rastu na ukotvenie nezávislý. overená sme chemorezistenci tiež známy ako hlavný vlastnosť CSCS. Bunky boli kultivované v prítomnosti docetaxelu (DOC), ktorý je často zamestnaný protirakovinový liek na liečbu pacientov s GC. 60As6 ukázal 6-krát vyššia IC 50 hodnotu Doc v porovnaní s tým HSC-60 (52 nM a 8,4 nM) (S2 Obr). Tieto dáta ukazujú, že 60As6 získal vysoký chemorezistentním fenotyp. Okrem toho, morfológia HSC-60 buniek, ktorý bol charakterizovaný plochou a veľké, vzhľadom k tomu, že z 60As6 buniek bola čiastočne plávajúce a malá, čo je podobná morfológii často pozorované pre CSCS (S3) Obr. Ďalej sme skúmali lipidov raftov lokalizáciu pomocou cholera toxín B podjednotka (CtxB) ako lipid plti markeru, pretože to už bolo popísané, že lipidové raft klastre boli obohatené v krvotvorných kmeňových bunkách [29]. Hromadenie žiarivkové trubice CtxB bol pozorovaný u 60As6 bunkách, ale nie v HSC-60, čo naznačuje ďalšie CSC-ako vlastnosť pre bývalé buniek (S3 obr).

Aby bolo možné posúdiť biologické rozdiely medzi HSC-60 a 60As6 buniek, sme v porovnaní profilov génovej expresie podľa microarray analýzy (S1 tabuľka). Down-regulácia troch žalúdku povrchových bunkových diferenciačných markerov ( MUC5AC
, MUC1 stroje a TFF1
) a niektoré cytokeratiny boli nájdené v 60As6. Naproti tomu niekoľko kmeňových buniek markerov ( LY75
CD44
GPNMB stroje a CXCR4
) boli up-regulované v tejto bunkovej línie. Výraz profil ukazuje, že 60As6 má silnú mezenchýme fenotyp, ktorý je charakteristický pre epitelových CSCS buniek odvodených.

Ďalej sme skúmali expresiu mRNA ako typické diferenciácie značky MUC5AC
[3 , 4] a metastáz spojené receptor chemokínu CXCR4
[30] pomocou RT-PCR. V súlade s výsledkami microarray, MUC5AC stroje a CXCR4
mRNA ukázala vzájomne sa vylučujúce výraz v HSC-60 a 60As6 (obr 1A). Chemokiny SDF-1 kódovaný CXCL12
je známe, že sa viažu CXCR4 a jeho príbuzný receptor CXCR7 [30]; Avšak, mRNA CXCL12 stroje a CXCR7
boli v oboch bunkových línií neidentifikuje. Expresie oboch MUC5AC a CXCR4 bola tiež potvrdená na úrovni proteínu imunocytochemické farbenie (obrázok 1B). Tak, tieto výsledky ukazujú, že bunky HSC-60 prístav viac diferencovaných buniek, než je tomu v 60As6 bunky, ktoré sú prevažne zložené z nediferencovaných buniek. Dohromady všetky tieto CSC podobné charakteristiky 60As6 ukazujú, že nediferencovanej subpopulácia s vysokou nádorového bujnenia a drogovej odolnosti mohla byť účinne obohatené z rodičovských buniek počas in vivo
výberov.

Identifikácia a charakterizácia žalúdočných CSCS v 60As6 a primárnych kultivovaných bunkách

Ďalej sme skúmali úlohu CXCR4 v bunkách difúznej typu GC pre PD. Ako je znázornené na obr 1A, receptor CXCR4
bol vysoko exprimovaný v 60As6 v porovnaní s HSC-60, zatiaľ čo ich ligandu CXCL12 /SDF1
nebola v oboch. Je však potrebné uviesť, že tento ligand je známe, že je exprimovaný v peritoneálnych mezoteliálnych buniek [31] a fungovať ako chemokiny na vyvolanie vzdialených metastáz prostredníctvom interakcie s rakovinových buniek exprimujúcich CXCR4 [30]. Preto sme skúmali, či CXCR4 by mohlo slúžiť ako marker pre identifikáciu PD spojená s CSCS. Expresie CXCR4 na 60As6 bunkách bola analyzovaná fluorescenciou aktivované triedenie buniek (FACS analýza). V závislosti na CXCR4 prejavu a smerovaného rozptylu vzor, ​​60As6 bunky vykazovali heterogénnosť pozostávajúce z troch rôznych subpopuláciách: I. CXCR4 + malých buniek (15%), II. CXCR4 - malé bunky (65%) a III. CXCR4 - veľké bunky (20%) (obr 1Ci). Bunky potom boli oddelené, aby sa jednotlivých subpopuláciách s čistotou I: 97%, II: 99%, a III: 54%, v danom poradí (obr 1Cii-1Civ). Nízka triedenie čistota CXCR4 - velkobuněčný subpopulácie III bol spôsobený kontamináciou s agregované CXCR4 - malé bunky (obr 1Civ, black-boxoval panel). Medzi týmito tromi podskupín, len CXCR4 - velkobuněčný subpopulácie obsahoval MUC5AC + diferencované bunky (obr 1Civ, tri vonkajšie panely). O sledovanie bunkového rastu v úrovni jednotlivých buniek, bolo zistené, že CCR4 - malé bunky množili, vzhľadom k tomu, CXCR4 - veľké bunky nepodstúpil bunkové delenie, aj 3 dni po kultivácii (obrázok 1D a S4 Obr). Tieto nálezy naznačujú, že CXCR4 - malé bunky sú prechodné zosilňovacie bunky, zatiaľ čo CXCR4 - veľké bunky sú terminálne diferencovaných buniek

Po vytriedení dve subpopulácie (I a II), analyzujeme. smena populácie buniek (obrázok 2A); po 7 dňoch kultivácie. CXCR4 + malé bunky, ktoré zodpovedajú subpopulácii generované Aj sami, CXCR4 - malé bunky, a CXCR4 - veľké bunky (11%, 62% a 21%, v uvedenom poradí), zatiaľ čo CXCR4 - malé bunky, zodpovedajúce podskupine II boli schopné vyvolať predovšetkým na seba (80%) s niekoľkými veľkými bunkami (17%) a veľmi málo CXCR4 + malých buniek (2%). Tieto výsledky naznačujú, že CXCR4 + malé bunky majú diferenciačný potenciál a vyrábať CXCR4 - veľké bunky možno prostredníctvom fáze CXCR4 -. Malé bunky v schéme diferenciácie buniek

Ďalej CXCR4 + malá jediná bunka produkovala kolóniu obsahujúcu MUC5AC + diferencované bunky po 7 dňoch v kultúre (obr 2B). Toto zistenie bolo podporené bunkové línie testu v kombinácii s farbením živých buniek a imunozbarvení MUC5AC (Obr 2C). Okrem toho, CXCR4 + malé bunky boli preukázané, že exprimujú vysoké úrovne LGR5
, ktorý je známy ako marker žalúdočného epitelu kmeňových buniek umiestnených na žľazy normálne sliznice [32] (Obr 2D ).

Ďalej sme potvrdil ukotvenie nezávislosť a schopnosť nádoru-začatí na dve malé bunkové subpopulácie (i a II). V teste tvorby kolónií, CXCR4 + malé bunky tvoril oveľa viac kolónií než CXCR4 - malé bunky (obr 3A). Sériová riedenie experimenty intraperitoneálnom očkovaním imunodeficiencie myšiach ukázal, že CXCR4 + malé bunky tiež vlastnil vyššiu karcinogénny schopnosť (vývoj nádoru v 4/5 a 1/5 myší upon naočkovanie 10 5 a 10 4 bunky, v uvedenom poradí) v porovnaní s CXCR4 - malých buniek (1/10 a 0/10 myší nasledujúcich 10 5 a 10 4 bunky, príslušne) (obr 3Bi). Pozoruhodne, všetkých päť myší s tumorom po inokulácii CXCR4 + malé bunky mali viac nádorové uzlíky (obr 3Bii), a začala rozvíjať krvavé ascites počas 3 týždňov (obr 3Biii).

Okrem difúzny typu GC bunkové línie sme tiež skúmali úlohu CXCR4 v klinickej vzorke (NSC-20C): primárne kultúru, vzniknutá z ascitu GC pacienta difúzna typu s PD. V RT-PCR a imunologické experimentoch bolo potvrdené, že primárna kultúra expresné CXCR4
ale nie CXCR7
(obrázok 3C). Dôležité je, že CXCR4 + malé bunky zoradené od NSC-20C vlastnil oba repopulating schopnosť (obr 3Di a 3Dii) a schopnosť formácie vysoký kolónií (obr 3Diii).

Zapojenie CXCR4 /SDF CXCR7 /-1 os PD

v ďalších šiestich difúzny typu GC odvodené bunkové línie (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9 a KATO III), sme ďalej skúmané vzťah medzi stav expresie receptorov /dvoch CXCL12 SDF-1 (CXCR4 a CXCR7) a hromadenie ascites u myší naočkovaných nádorových buniek intraperitoneálne. Experimenty RT-PCR bolo zistené, že dve GC bunkové línie (HSC-39 a KATO III) vysoko exprimovaný CXCR4
(obr 4A). Okrem toho oba tieto xenografted myši mali viac nádorových uzlín a akumulované ascitu (obr 4B). Na rozdiel od toho ďalšie dve bunkové línie (HSC-44 a HSC-58) nepreukázala žiadne alebo veľmi nízka expresie CXCR4, jeden alebo niekoľko peritoneálnej nádoru uzlík a nehromadili ascitu (obr 4B). Tiež sme potvrdili hromadenie ascitu v inom vysoko peritoneálnej-metastatického sublinii 58As9 (odvodený z HSC-58), ktorý výslovne CXCR7
na vysokej úrovni, ale nie CXCR4
. Jeden výnimočný prípad bol 44As3 odvodený od HSC44, ktorá mala viac nádorové uzliny a akumulované ascites bez vyjadrenia oboch CXCR4 stroje a CXCR7
. Celkovo sme zistili vysokú koreláciu medzi úrovňou expresie CXCR4
alebo CXCR7 stroje a agresívne fenotyp v siedmich z ôsmich bunkových línií s výnimkou 44As3.

v klinickej praxi peritoneálnej výplach cytológie (CY) poskytuje dôležité prognostické informácie pre pacientov GC, pretože môže odhaliť "semeno" PD pred jeho makroskopickým prejavom. Dokonca aj v prípadoch, bez PD (P0), CY-pozitívnych pacientov má zlú prognózu [33], čo naznačuje, že pomerne málo metastatické CSCS sú prítomné v peritoneálnej výplach týchto pacientov. Preto sme skúmali ďalšie prítomnosť CXCR4 + GC buniek v peritoneálnymi výplachu od pacientov bez klinických prejavov ascites. CXCR4
mRNA bola detekovaná vo zriedka premývacie v 9 z 10 CY-negatívnych pacientov; však, mRNA bola detekovaná v pranie pri 19 34 CY-pozitívnych pacientov (obr S5A). Tiež sme potvrdili prítomnosť CXCR4 a cytokeratin dvojito pozitívnych malé GC buniek na mezoteliálnych buniek dlažobné kocky v tvare pripojených k povrchu kultivačné misky v krátkom časovom horizonte (7 dní) kultúra ascitu pacienta (obr S5B). V našich experimentoch peritoneálnej mesothelial bunky zvyčajne zmizla v dlhodobej kultúry po asi jeden mesiac. V takom dlhodobé kultúry, sme tiež zistil prítomnosť nejakého CXCR4- alebo CXCR7-vysoko pozitívne GC buniek, ktoré vykazovali charakteristiky epitelové, mezenchýme prechod, vimentin (VIM) pozitívna (šípka hlavy pri S5C obr), ale cytokeratin (PAN )-negatívna. Z tohto dôvodu, CXCR4 + GC bunky sú prítomné v malígnym ascitom a to nielen v počiatočnej fáze peritoneálnej šírenia (P0 /CY +), ale aj vo viacerých postupných fázach charakterizovaných zjavné akumulácie ascitu. Stručne povedané, vyššie uvedené experimentálne a klinický dôkaz naznačuje, že časť CXCR4 + alebo CXCR7 + GC bunky majú potenciál pre tvorbu metastáz peritoneálnej.

Ďalej sme skúmali funkčné úlohu CXCR4 signálne dráhy v PD. Expresia CXCL12
/ SDF-1
v ľudskej a myší peritoneálnej mezotelem bola potvrdená pomocou RT-PCR (obr 5A). Preto sa skúmala zapojenie CXCL12 /SDF-1 na bunkovú inváziu. Ako je znázornené na obr 5B, je počet invazívnych 60As6 buniek bola výrazne zvýšená o SDF-1, čo ukazuje, že tieto bunky majú schopnosť chemotaxiu SDF-1. Lentivirovým Zhrnieme vyvolané Vyradenie CXCR4 v 60As6 atenuovaný SDF-1 sprostredkovanú inváziu, ale nemá vplyv na tvorbu nádorov uzlíkov do peritoneálnej dutiny myší (nie je znázornené). Okrem toho, nútené CXCR4 expresiu v rodičovskej bunkovej línie HSC-60 nikdy zvýšila tumorigeničnosti (nie je zobrazený). Celkovo vzaté, naše údaje naznačujú, že CXCR4 sa podieľa na väzbe k pobrušnice, ale nie v tvorby nádoru uzlíka.

prostredníctvom interakcie medzi CXCR4 Ukázali sme, schematicky procesy priame PD z steny žalúdka u pacientov s pokročilým GC + alebo CXCR7 + CSCS a SDF-1-vyjadrovať pobrušnice (obr 5C). V prvom kroku metastáz je CXCR4 + CSCS boli prístrešok zo steny žalúdka do peritoneálnej dutiny. Následne sa tieto bunky pripojiť k bazálnej membrány (BM) peritonea v reakcii na mezotelu odvodené chemoatraktantu SDF-1 a kolonizovať tvoriť uzliny. Tieto udalosti sa vyskytujú na mnohých miestach po peritoneálnej povrchu, čo vedie k blokáde čerpadla-funkcie a k hromadeniu ascitu.

TGF-β podporuje diferenciáciu buniek /asymetrické delenie buniek z CXCR4 + žalúdočné CSCS

TGF-β bolo hlásené, že znižujú bočné populáciu asi GC bunkových línií difúzna typu [34]. Preto sa skúmalo, či TGF-β má potenciál zmeniť charakteristiky CXCR4 + difúzny typu GC buniek. Najprv sme skúmali úrovne expresie TGF-beta receptory 60As6 bunkách a primárnych kultúrach GC odvodené z dvoch nezávislých pacientov (NSC-16C a -22C). RT-PCR experimenty ukázali, že obidva gény receptora TGF-β ( TGFBR1 stroje a
TGFBR2) vyjadrená vo všetkých týchto buniek (Obr S6). Tiež sme skúmali lokalizáciu Smad2 /3, pretože tieto transkripčné faktory sú široko známe, že sa hromadia v jadrách v reakcii na aktiváciu TGF-beta signalizáciu. Ako je znázornené na obr 6AI, nukleárna akumuláciu Smad2 /3 bola zistená v 60As6 buniek po 30 minútach ošetrení s 2 ng /ml TGF-p.

Ďalej sme skúmali, ako CXCR4 + GC bunky ovplyvnená aktivácia TGF-beta signalizáciu. RT-PCR experiment ukázala pokles CXCR4
mRNA v 60As6 pôsobením TGF-p (obr 6Aii). Prietoková cytometria analýzy ukazujú, že liečba TGF-β znížiť CXCR4 + malé bunky z 6,3% na 0,4% a na zvýšenie CXCR4 - veľké bunky z 17,1% na 43,2% (obr 6B). V súlade s nárastom terminálne diferencovaných buniek, kaspázy 3/7 v populácii celých buniek bol aktivovaný TGF-p liečby (obr 6C). Z tohto dôvodu TGF-β môže mať potenciál vyvolať CXCR4 + CSCS na terminálne diferencovaných buniek. Ďalej sme skúmali účinok TGF-p v kľudových bunkách 60As6, pretože SKSK sa predpokladá, že existujú v nečinnom stave pod hypovaskulární stavu. Po vyčerpaní v sére počas 5 dní, CXCR4 + malé bunky zvýšiť až na 42% (obr 6Di).

Other Languages