Ploche ONE: Na mikroRNA-217 Funkcie ako potenciálny Suppressor nádoru u rakoviny žalúdka zacielením GPC5

abstraktné

rakovina žalúdka (GC) je jedným z najčastejších zhubných nádorov po celom svete. Objavujúce sa dôkazy ukázali, že aberantne expresie mikroRNA (miRNA) hrá dôležitú úlohu v progresii rakoviny. Avšak, len málo je známe o potenciálnej úlohe Mir-217 v GC. V tejto štúdii sme skúmali úlohu Mir-217 na proliferáciu GC buniek a invázie. Expresie MIR-217 sa down-regulované v GC buniek a ľudských tkanív GC. Presadzovaná expresie MIR-217 potlačený GC buniek proliferáciu a inváziu. Okrem toho, glypican-5 (GPC5), nová ocncogene, bol identifikovaný ako potenciálny cieľ MIR-217. Okrem toho zvýšená expresia MIR-217 poškodenie podpore GPC5 indukovanej proliferácie a invázie v GC buniek. Záverom, tieto zistenia ukázali, že mier-217 funguje ako nádorový supresor a inhiboval proliferáciu a inváziu buniek GC zacielením GPC5, ktorá by mohla v dôsledku toho slúžiť ako terapeutický cieľ pre pacientov GC

Citácia :. Wang H dong X, Gu X, Qin R, Jia H, J Gao (2015) Tento microRNA-217 Funkcie ako potenciálny Suppressor nádoru u rakoviny žalúdka zacielením GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10,1371 /journal.pone.0125474

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Čína

Prijaté: 10. októbra 2014; Prijaté: 24. marca 2015; Uverejnené: 22. júna 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

financovania: .. autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou ľudských malignít a druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete s odhadovaným jeden milión nových prípadov ročne [1-4]. Napriek nedávnej pokroky v diagnostických metód, chirurgické techniky a nových chemoterapeutických režimov, dlhodobá miera prežitia pre GC je stále pomerne nízka [5, 6]. U mnohých pacientov, GC je diagnostikovaná v pokročilom štádiu s rozsiahlou inváziou a lymfatické metastázy. Úspešné terapeutické stratégie sú obmedzené a úmrtnosť je vysoká [7]. Preto je naliehavo potrebné skúmať základné molekulárne mechanizmy, ktoré sú dôvodom rezistenciu voči liekom histologickú rôznorodosť a rozvoj metastáz identifikovať nové markery pre diagnostiku a liečbu GC.

mikroRNA (miRNA) sú malé, približne 22 -nucleotide, nekódujúca RNA, ktoré fungujú ako negatívne regulátory génov, ktoré kódujú proteín na posttranskripční úrovni [8, 9]. Väzbou na komplementárne sekvencie v 3'-nepřekládané oblasti (3'-UTR), ich cieľových mRNA, miRNA môže indukovať priamu degradácii mRNA alebo translačný inhibícia [10-13]. Pribúdajú dôkazy, ukázala, že miRNA sú zapojené do mnohých dôležitých biologických procesov, vrátane bunkovej proliferácie, diferenciácie, apoptózy, angiogenézy a imunitnej odpovede. Deregulácia miRNA môže viesť k aberantne expresie génu v rôznych ochorení, vrátane rakoviny žalúdka [14-16]. Avšak, chápanie role a funkcie miRNA v GC je stále v počiatočnom štádiu. Podobne role mnohých ďalších nenormálne vyjadrených miRNA vo vývoji GC sú stále neznáme.

znižujúce množstvo MIR-217 je častou udalosťou v rôznych druhov rakoviny, čo naznačuje jej významnú úlohu v tvorbe nádorov [17-19]. Avšak, len málo je známe o potenciálnej úlohe Mir-217 v GC. V tejto štúdii expresie MIR-217 bola znížená v bunkových líniách a tkanivách GC. Okrem toho, nižšia expresie MIR-217was spojené s pTNM fáze. Nadmerná expresia MIR-217 potlačená GC invázie buniek a proliferáciu. Okrem toho, luciferázy reportér test a western blot potvrdil, že mier-217might fungovať ako nádorový supresor v GC targetingGlypican-5 (GPC5).

materiáloch a metódach

Prehlásenie o Ethics

Všetci pacienti súhlasili s účasťou v štúdii a dali písomný informovaný súhlas. Táto štúdia a súhlas bola schválená etickou rady Inštitútu pridruženého Yanan nemocnice Kunming lekárskej univerzity a dodržiavanie Helsinskej deklarácie.

Tkanivové vzorky

vzoriek ľudského GC tkanív a spárovaný -adjacent nenádorových žalúdočné tkaniva, ktoré boli ďalej ako 5 cm od nádorov boli získané od 50 pacientov, ktorí podstúpili resekciu chirurgie na pridruženého Yanan nemocnice Kunming lekárskej univerzity. Čerstvé vzorky boli rýchlo zmrazený inliquid dusíka ihneď po resekcii a skladované pri -80 ° C. Všetky vzorky boli získané s informovaným súhlasom pacienta a boli histologicky potvrdené farbením hematoxylínom-eozín. Histologický grade karcinómov bola hodnotená podľa kritérií stanovených Svetovou zdravotníckou organizáciou. Žiadny z pacientov bola rádioterapiou alebo chemoterapiou pred operáciou. Charakteristiky pacientov sú uvedené v tabuľke S1.

Bunkové línie a bunková kultúra

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 a jeden normálny žalúdočné epiteliálne bunkové línie GES-1 (ako kontrola) boli zakúpené z ústavu biochémie a bunkovej biológie na Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Čína). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 boli propagované v médiu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a GES-1 bol propagovaný v Dulbecco modifikovanom Eaglovho média (Invitrogen). Všetky médiá bola doplnená with10% fetálnom hovädzom sérom. Bunkové línie boli kultivované pri 37 ° C vo zvlhčenom inkubátore 5% CO2.

extrakcie RNA a QRT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná zo zmrazených vzoriek (alebo buniek) za použitia TRIzolu ( Invitrogen) podľa návodu výrobcu. 1 ml RNA bolo použité na meranie expresie MIR-217 pomocou kvantitatívnej RT-PCR (QRT-PCR) s TaqMan miRNA reverznej transkripcie kit andtheTaqMan miRNA testu špecifických RT priméry pre mier-217 v súlade s pokynmi výrobcu (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expresia U6 bol použitý ako vnútorná kontrola. Real-time PCR bola vykonaná s 1 ml každého cDNA na Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) v duplikáty. Expresie MIR-217 bola definovaná na základe prahovej hodnoty cyklu (Ct), a relatívna hladiny expresie boli vypočítané as22 ^{- [(Ct MIR-217) - (Ct U6)] po normalizácii s odkazom na vyjadrenie U6 snrna [20, 21] (S2 tabuľka).}

Western blot

Celková bielkovina bola extrahovaná z mrazených vzoriek (alebo buniek) za použitia Total proteín Extraction Kit (keygen, Nanjing , Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Meranie koncentrácie proteínu bola vykonaná pomocou testu BCA Protein Kit (keygen). Western blot analýza bola vykonaná ako bolo opísané skôr [22]. Primárne protilátky použité pre western blot boli králičie polyklonálne anti-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), myšou monoklonálnou anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Cell transfekční

mir-217 napodobňovať, napodobňovať ovládanie (scramble), mier-217 inhibítor, kontrola inhibítor, pez-GPC5 a kontrolný vektor boli zakúpené od RiboBio (Guangzhou, Čína). Bunky HGC-27 boli nasadené na šiestich jamkové doštičky v 30% zhlukovania jeden deň pred transfekcia. Lipofectamine2000 (Invitrogen) bol použitý pre transfekciu plazmidu samostatne alebo spoločne s RNA oligonukleotidy.

luciferázy testy

buniek 8 x 10 ^{3 boli umiestnené do 96-jamkových doštičiek. Po 24-hincubation, zmes na 100 ng pLUC-3'-UTR, 5-pmol negatívna kontrola, Mir-217mimic sa kotransfekovány 20 ng Renilla do buniek za použitia Lipofectamine 2000 dvadsaťštyri hoursafter transfekcia, svetlušky a luciferázy Renilla aktivity boli merané s Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Účinnosť transfekcia bola normalizovaná kotransfekcí reportérovým vektorom Renilla.}

Bunková proliferácia

Cells (3000 /jamku) boli zhromaždené a schovať na 96-wellplates a inkubované pri 37 ° C po transfekciu. Po inkubácii po dobu 1 až 5 dní, aby bolo pridané médium z každej jamky 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japonsko), a doštičky boli ďalej inkubované po dobu ďalších 3 hodín pri teplote 37 ° C. Potom bolo médium nahradené 150 ml dimetylsulfoxidu (DMSO, Sigma-Aldrich) a absorbancia bola meraná pri 450 nm s použitím čítačky mikrotitračných doštičiek (východ). Skúška sa opakuje 3 krát so šiestimi replika.

Northern blot

Celková RNA bola izolovaná z každej tkaniva za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen Life Technologies) a Northernová bola vykonaná ako je popísané predchádzajúca [23] , Nasledujúce perfektné Hyb Plus hybridizácia pri 68 ° C, membrány boli vyvinuté a analyzované. Northern bloty hybridizované s 18S ribozomálnej RNA (rRNA) cDNA boli použité ako kontroly.

invázie buniek

invázie test bol vykonaný v troch opakovaniach pomocou Transwell invázne komory potiahnuté Matrigelem (BD, USA) ako je popísané v protokole výrobcu. Bunky boli transfekovány withmiR-217 mimiku, inhibítor alebo negatívne kontrolné oligonukleotid, kultivované po dobu 48 hodín, a prevedené na vrchole Matrigel potiahnutých invazívne komory v DMEM bez séra (1 x 10 ^{5 buniek na Transwell). bolo pridané DMEM s obsahom 10% fetálneho teľacieho séra do druhej komory. Po inkubácii po dobu 24 hodín, bunky, ktoré zostali v hornej časti filtra boli vydrhnutá vypnutie a bunky, ktoré migrovali k spodnému povrchu bola stanovená in90% alkoholu a následne kryštalickej fialovej farbením.}

Histológia

Histologická diagnóza bola podľa spôsobu žalúdočné biopsia triple-site. Tkanivá boli fixované cez noc v pufrovanom formalínu, vložené do parafínu, rezané na hrúbke 3 um a zafarbené hematoxylínom a eosínu (H &E). Farbenie

Štatistická analýza

Štatistické analýzy boli vykonané pomocou štatistického softvérového balíka SPSS 17.0. Experimenty boli opakované nezávisle aspoň trikrát, a údaje uvedené ako priemer ± SD. Súvislosť medzi Mir-217 a GPC5 bola analyzovaná pomocou Spearmanova korelačného testu. Porovnanie medzi skupinami pre štatistickej významnosti boli vykonané s Studentovho párového dva chvostom t-test alebo One-way ANOVA. P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

Výsledok

Expresia MIR-217 je downregulated v bunkových líniách GC

kvantifikovať hladinu expresie MIR-217 v štyroch ľudské bunkové línie GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) a GES-1 pomocou Northern blot (obr. 1A) Hladina expresie MIR-217 wasdecreased v bunkových líniách GC v porovnaní s GES-1. QuantitativeRT-PCR tiež ukázala, že expresia MIR-217 bola znížená na GC bunkových líniách (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) v porovnaní s GES-1, normálne žalúdočné epiteliálne bunkové línie (obr 1B ).

MIR-217 je downregulated v GC tkanivách

Kvantitatívny RT-PCR bolo vyšetrených MIR-217 expresie v 50 GC tkanív a ich spárovaných priľahlých noncancerous tkanív. Reprezentatívne histologické vlastnosti GC a jeho priľahlých spárované nenádorové tkaniva bolo znázornené na obr 2A. Medzi 50 nádorovom tkanive, 44 prípadov preukázaný pokles expresie MIR-217 v porovnaní so susednými normálne tkanive (88%, 44 50, obr 2B). Expresie MIR-217 bol v GC tkanivách nižšie ako v susedných nenádorové tkaniva (obr 2c). Okrem toho, nižšie hladiny MIR-217 expresie spojené s pTNM fáze GC pacientov (obr 2D).

MIR-217 inhibuje proliferáciu buniek a GC invázie

Expresia MIR-217was zvýšila v transfekované bunky HGC-27 za použitia MIR-217 (obr napodobňuje 3A) a znížil sa pomocou MIR-217 (obr inhibítor 3B). Proliferácia bola znížená v bunkách HGC-27 transfekované withmiR-217 má rovnakú funkciu ako v porovnaní s bunkami transfekovanými odrazil alebo neošetrené (obr 3C). Medzitým sa proliferácia bola zvýšená v HGC-27 buniek transfektovaných withmiR-217inhibitor v porovnaní s bunkami transfekovanými ovládania alebo neošetrené (3D) Obr. Invazivitě buniek transfekciou MIR-217 napodobenín bol znížený v porovnaní so skupinou buniek ťahanice skupín alebo kontrolných a Mir-217 inhibítor zvýšená invázie buniek v porovnaní so skupinou buniek ťahanice skupiny, alebo kontroly (obr 3E).

mir -217 posttranskripční znižuje GPC5 expresiu zamerala sa priamo na jeho 3'UTR

Analýza s využitím dostupných algoritmov naznačila, že GPC5 bol teoretický cieľový gén MIR-217 (obr 4A) [24]. Dokázať, že mier-217 priamo cielené na GPC53'UTR sme vykonali luciferázové testy reportéri gen. Ektopická MIR-217 zníženou aktivitou luciferázy v divokého typu génu spravodajcu GPC5 ale nie mutantný GPC5 3'UTR, čo ukazuje, že mier-217 priamo zameraná na GPC5 3 'UTR (obrázok 4B). Hladina mRNA GPC5 bola znížená po transfekciu s Mir-217 napodobňuje a zvyšuje po transfekciu s Mir-217 za použitia inhibítora QRT-PCR (obr 4C). V súlade s týmto výsledkom, schopnosť MIR-217 pre reguláciu expresie GPC5 proteínu bola overená metódou Western blot (obr 4D).

Obnova MIR-217 inhibuje GPC5 sprostredkovanú proliferáciu GC buniek a inváziu

Nadprodukcie GPC5 podporoval proliferáciu buniek a GC inváziu. Keď MIR-217 napodobňovať a pez-GPC5 boli kotransfekovány do HGC-27 buniek, MIR-217 expresie znížila proliferáciu a inváziu (obr 5A a 5C) GC buniek GPC5 indukovanej. Inhibícia GPC5 znižuje proliferáciu GC buniek a inváziu. Keď MIR-217 inhibítor a shGPC5 boli kotransfekovány do HGC-27 buniek, MIR-217 inhibítor podporoval proliferáciu a inváziu shGPC5-potláčaná buniek (obr 5B a 5D).

GPC5 je up-regulovaná v bunkových líniách GC a vzorky

expresie GPC5 bola vyššia u GC bunkových líniách (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45) v porovnaní s GES-1, normálne žalúdočné epiteliálne bunkové línie (obr 6A). Úrovne proteínovej GPC5 boli tiež vyššie u GC tkanivách ako v susedných noncancerous tkanivách s použitím western blot (obr 6B).

Diskusia

GC spôsobí, že takmer jeden milión úmrtí na celom svete ročne [25] , V poslednej dobe sa hromadia dôkazy naznačujú, že miRNA zohrávajú kľúčovú úlohu v patogenéze GC cez reguláciu bunkovej proliferácie, apoptózy, migrácia, invázia reklamy [26-28]. V tejto štúdii, Mir-217 sa často downregulated v ľudských bunkových líniách GC a tkanív a nižšiu úroveň Mir-217 bolo spojené s pTNM fáze GC. Ďalšie experimenty ukázali, že zvýšená expresia MIR-217 môže potlačiť GC migráciu a inváziu buniek. GPC5 bol identifikovaný ako priamy a funkčné cieľ MIR-217. Sme došli k záveru, že mier-217 sa zdá byť nový nádorový supresor v GC, a že downregulated Mir-217 môže prispieť k rozvoju a progresii nádoru u pacientov s GC. Zníženie expresie MIR-217 je častým udalosť v rôznych druhov rakoviny, naznačuje, že významnú úlohu pri vzniku nádorov [17-19]. Li a jeho kolegovia ukázali, že mier-217 sa down-regulované v jasných buniek karcinómu obličiek (ccRCC) v porovnaní s normálnou tkanív spárovaného [29]. Nižšia MIR-217 hladina expresie bola spojená s vyšším stupňami a stavu nádoru. V tejto štúdii, MIR-217 bolo často downregulated v GC. Je zaujímavé, že u pacientov s nižšou expresiou Mir-217 tendenciu mať pokročilejšie štádium TNM, čo naznačuje, že nízka expresia ofmiR-217was spojená s progresiou GC. Ďalšie štúdie ukázali, že nadmerná expresia MIR-217 potlačená GC invázie buniek a proliferáciu. Spolu s predchádzajúcimi výsledkami, tieto údaje naznačujú, že mier-217might hrajú kľúčovú úlohu v GC tkanivovej homeostázy a deregulatedmiR-217 by mohli prispieť k rozvoju žalúdočných neoplázie.

Ak chcete skúmať molekulárnej mechanizmus úlohu nádorového supresor Mir-217 v GC, použili sme luciferázy reportéri test a western blot potvrdiť, že GPC5 bol terčom Mir-217 v GC buniek. Ak chcete potvrdiť priamu reguláciu GPC5 Mir-217, použili sme GPC 3 'UTR reportérového vektora nesúci potenciálny MIR-217 väzobné miesto vo fluorescenčné reportér. Okrem toho, QRT-PCR a test western blot ukazuje, že nadmerná expresia MIR-217 inhibuje expresiu GPC. Glypicans sú rodina proteoglykánov, ktoré sú spojené s exocytoplasmic povrchu plazmatické membrány prostredníctvom glykozylové fosfatidylinozitol kotvy [30, 31]. Šesť glypicans boli identifikované u cicavcov (GPC1 až GPC6) [32, 33]. GPC5 je predovšetkým vyjadrená vo vývoji centrálneho nervového systému, končatín, obličiek, pľúc a pečene [34, 35]. Nedávne štúdie ukázali, že niektoré GPC, najmä GPC3 andGPC5, môže hrať dôležitú úlohu v regulácii progresie rakoviny [35, 36]. Napríklad Zhang
et al. ukázal, že GPC5 bol vysoko exprimovaný v Sace-M (high pľúc metastatické bunková línia) a v klinických vzorkách slín adenoidná cystickou karcinóm (SACC) prípadoch s pľúcnou metastázy [36]. Celková úroveň expresie GPC5 v klinických prípadov SACC s pľúcnou metastázy bola vyššia. Williamson et al. ukázal, že gén kódujúci GPC5was amplifikovaný v 20% pacientov s alveolárny rabdomyosarkom (RMS), a že táto glypican bol nadmerne exprimovaný u pacientov s RMS. Okrem toho, down-regulácia expresie siRNA GPC5 inhibujú rýchlosť proliferácie buniek RMS. Iná štúdia zistila, že vysoké hladiny expresie GPC5 predpokladá chudobné pooperačnej doby prežitia pre kuratívnu rešpektovaná pacientov s NSCLC, čo naznačuje hodnotu GPC5 ako molekulárne prognostický indikátor [35, 37]. V našej štúdii expresie GPC5 bola vyššia v bunkových líniách GC a hladiny proteínové GPC5 boli tiež v GC tkanivách vyššie ako v susedných nenádorové tkaniva. Inhibícia GPC5 znižuje proliferáciu GC buniek a inváziu. Obnova MIR-217 inhibuje GPC5 sprostredkovanú proliferáciu buniek a GC inváziu. Tieto výsledky ukázali, že mier-217might môže pôsobiť ako nádorový supresor rakoviny žalúdka u cielenie GPC5.

Na záver, táto štúdia preukázala, že mier-217was downregulated v GC tkanív a bunkových línií. Nízke hladiny expresie MIR-217 boli spojené s pTNM fáze pacientov. Ektopická expresia MIR-217 viedla na inhibíciu proliferácie buniek a GC invázie. Ďalšie vyšetrovanie odhalilo, že GPC5 bol potenciálnym cieľom MIR-217. MIR-217 môže slúžiť ako prediktor pre prognózu a terapeutický cieľ pre pacientov GC.

Podporné informácie
S1 tabuľku. Prehľad klinicko-parametrov u pacientov s karcinómom žalúdka
doi :. 10,1371 /journal.pone.0125474.s001
(DOCX)
S2 Tab. Primer sekvencie
doi :. 10,1371 /journal.pone.0125474.s002
(DOCX)

• Ploche ONE: microRNA-137 Prispieva k tlmený nádorového rakoviny žalúdka Human zacielením Akt2
• Ploche ONE: Analýza prežitie pacientov s Interval Cancer podstupujúcich Žalúdočné skríningu rakoviny endoskopicky