Ploche ONE: NMe2 Znižuje množenia sa, migrácie a invázie žalúdočné nádorových buniek k obmedzeniu Metastasis

abstraktné

Karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších zhubných nádorov a má vysokú mieru metastáz. Predpokladáme, že NMe2
(nukleozid difosfát kináza 2), ktorý bol predtým považovaný za anti-metastatického génu, hrá úlohu v invazivitě buniek karcinómu žalúdka. Za použitia tkaniva čipovej technológie a imunohistochémia sme preukázali, že NMe2 expresia bola spojená s úrovňou diferenciácie buniek karcinómu žalúdka a ich metastázy do lymfatických uzlín. Ak je NMe2
génový produkt bol nadmerne vyjadrený; in vitro
stabilný transfekcia, bunky z BGC823 a MKN45 bunkových línií karcinómu žalúdka znížil výskyt proliferácie, migrácie a invázie cez kolagénu matrix, čo naznačuje, inhibičnú aktivitu NMe2 v propagáciu a invázie karcinómu žalúdka. NMe2 by teda ťažká ako marker rizika pre žalúdočné rakoviny invazívnosti a potenciálny nový cieľ pre génovú terapiu pre zvýšenie alebo vyvolanie NMe2 expresiu

Citácia :. Liu YF, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, L Zhang, et al. (2015) NMe2 Znižuje množenia sa, migrácie a invázie do žalúdka nádorových buniek k obmedzeniu metastáz. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10,1371 /journal.pone.0115968

Akademický Editor: Jian Cao, Stony Brook University, Spojené štáty

prijatá: 18. apríla 2014; Prijaté: 03.12.2014; Publikované: 20. februára 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie: Táto štúdia bola podporovaná programom podporuje pre Chang-Jiang učencov a inovačného výskumného tímu na University (PCSIRT: IRT1137) a základný výskum fondov na stredoeurópskych univerzít (lzujbky-2013-ct06). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo príprave tohto rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Rakovina zostáva ako hlavnú príčinu úmrtí, čo predstavuje 14,1 miliónov nových prípadov a 8,2 milióna úmrtí v roku 2012 [1]. Očakáva sa, že počet nových prípadov sa zvýšila o 70% na celom svete 22 miliónov počas nasledujúcich dvoch desaťročí [2]. Rakoviny v pľúcach, žalúdka, pečene, hrubého čreva a prsia majú najvyššiu úmrtnosť [3]. Žalúdočné rakovinové bunky môžu priamo šíriť do okolitých orgánov (miestne invázia), ako slinivky, priečneho tračníka, pečene a sleziny, ako aj na vzdialených lymfatických uzlín, pľúc a kostného tkaniva. Kým je dve rôzne patologické procesy, miestne invázie a vzdialené metastázy sú prepojené kde bývalý často podporuje a propaguje druhej. Genetickej mutácie a ich nenormálne výrobky sú kľúčové pre umožnenie charakteristickými znakmi a rakovinových buniek pre proliferáciu, odolnosť k apoptóze, miestne invázie, metastázy, imúnny úniky, angiogenézy a reakcie na poškodenie DNA. NME
(nukleozid difosfát kináza 2 alebo nemetastázujúce Cells) predstavuje skupinu génov nádorových reguláciu s rakovinou spojené a /alebo.

NME
sa skladá z rodiny 10 génov, ktoré sú tiež známe ako NM23
génov [4] a bolo spájané s potlačenie metastázy rakoviny a invázie na lokálnej tkaniva [5]. Medzi členmi tejto génové rodiny, NME1 stroje a NMe2
boli rozsiahle študované pre ich činnosť rakovinou potlačenie. NMe2
, ktorý je mapovaný na chromozóme 17q21 [6,7], kóduje B podjednotku nukleozid-difosfát (NDP) kinázy [4]. Jeho produkt bol hlásený na inhibíciu metastáz rakoviny prsníka a melanómu; a k zníženiu jeho expresie bola v korelácii s väčším metastatického potenciálu týchto nádorov [8,9]. Avšak, NMe2
zvýšená expresia bola tiež spojená so zlou prognózou pre neuroblastóm a osteosarkóm [10,11]. Okrem toho NMe2
gén nebol koreloval s metastázami endometria hepatocelulárneho karcinómu štítnej žľazy a [12-14]. Tieto zjavne v rozpore dáta naznačujú, že NMe2 môžu mať rozdielne účinky na rôzne typy nádorových buniek a ich schopnosť lokálne napádať okolité tkanivá a metastázovať do vzdialených orgánov.

Z dôvodu týchto rôznych NMe2 aktivít na rôzne typy rakoviny, sme analyzovali tkaniva chirurgicky odstrániť od pacientov s rakovinou žalúdka a spojené expresiu NMe2 v týchto tkanivách s ich patologickými vlastnosťami. Tento patologický štúdia bola doplnená o in vitro
experimentoch, kde sme skúmali mieru množenia sa, migrácie a invázie buniek karcinómu žalúdka, ktoré boli stabilne transfekována ľudskou NMe2
cDNA pre zvýšenú expresiu svoj produkt , Tieto in vitro
pokusy sú určené pre pochopenie invazívnosť nádorových buniek, ktoré exprimujú rôzne úrovne NMe2.

Materiály a metódy

Táto štúdia bola schválená etickou komisiou pre vykonávajúci výskum ľudského Lanzhou University, School of Medicine. Pacienti alebo ich opatrovníci predpokladu, že ich písomný informovaný súhlas pred tým, než prijatí do štúdie.

Tissue imunohistochémia

Analyzovali sme NMe2 výraz v rakovinou žalúdka a priľahlých normálneho tkaniva chirurgicky odstránené z 139 pacientov hospitalizovaných v armáde oblastné nemocnice v meste Lanzhou v rokoch 2011 až 2012. žiadni pacienti liečení chemoterapiou alebo rádioterapiou pred chirurgickým zákrokom. Tieto chirurgicky odstránené rakovinové tkanivá boli spracované pre hematoxylínom a eosínu (HE) farbenie. Stručne povedané, vosk modul bol prerazený 42 clony otvory (6 × 7 otvory /čipov) každé 2 mm. Tkanivové bloky boli zakotvené v týchto otvorov (jedna vzorka /diery). Tento vosk modul bol potom rezy tak, aby tkaniva z 40 pacientov bolo možné skúmať súčasne na jedinom snímke s cieľom zabezpečiť jednotnosť škvŕn. Pre kontrolu, prvý a posledný diery boli vložené s tkanivom z non-rakovinové pečeň a obličky, resp. NMe2 expresia bola detekovaná s použitím komerčného kitu imunohistochémia (Beijing ZSGB Biotechnology Co, Ltd.) s králičie anti-ľudské protilátky NMe2 (1: 300 riedenie, Beijing Biosyntéza Biotechnology Co, Ltd.) podľa návodu výrobcu. Hladiny expresie NMe2 boli numericky zaznamenal, ako je uvedené v tabuľke 1, patológom, ktorý bol oslepený k klinickej informácie z týchto pacientov sa.

Bunková kultúra a transfekcia cDNA

Bunky z BGC823 a MKN45 žalúdočných rakovinové bunkové línie boli zakúpené z čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Bunky v BGC823 línie boli pôvodne z 62-ročného muža s zle diferencovaného adenokarcinómu žalúdka a tie v línii MKN45 odvodený od metastatické hmotnosti pečene z 62-ročného japonské ženy s nediferencovanej adenokarcinóm brucho. Bunky z oboch línií mala Zvyškové množstvá NMe2 expresie a sú preto ideálne pre štúdium vplyvu zvýšenej expresie tohto génu produkt na buniek karcinómu žalúdka in vitro
.

Bunky boli kultivované v DMEM médium (Sigma, St. Louis, MO, USA) obsahujúcim 10% plodové teľacie sérum (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd., Hangzhou, Čína), pri 37 ° C s 5% CO _{2 a 95 % vzduchu. Na 70-80% zhlukovania, tieto bunky boli transfekovány cDNA pre ľudský NMe2
génu, ktorý bol klonovaný do pcDNA3.1 vektora (Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, Čína), za použitia Lipofectamine 2000 ako nosič DNA (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Bunky stabilne exprimujúce NMe2 (označované ako NMe2) boli vybrané pestovaním transfekciou buniek v médiu DMEM obsahujúcom 1 mg /ml G418. Kontrolné bunky boli transfekovány vektorom pcDNA bez toho aby bolo NMe2
inzert cDNA (označované ako falošný) a podstúpil rovnaký výber. Un-transfekované rodičovskej bunky boli skúmané aj ako základných ovládacích prvkov. Nadmernú expresiu NMe2 bola určená pomocou RT-PCR pre kvantifikáciu úrovne NMe2
mRNA a tým imunoblotu transfektovaných bunkových lyzátov za použitia polyklonálne protilátky NMe2 (1 :. 100 riedenie, Beijing Biosyntéza Biotechnology Co, Ltd),}

izolácie RNA a RT-PCR

Celková RNA bola izolovaná z transfektovaných a netransfekovaných buniek za použitia komerčného izoláciu RNA kit (Takara Biotechnology, Dalian, Liaoning, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. RNA (2 ug) z každej vzorky bola reverzne transkribovaných s použitím PrimeScript RT Kit po protokolu výrobcu. Komplementárna DNA spätne prepisuje z RNA extrahované z týchto buniek bola amplifikovaná pomocou Taq polymerázy s použitím nasledujúcich primerov pre NMe2
cDNA: 5'-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 '(dopredu) a 5'-GGTCTCCCCAAGCATCACTC-3 "(vzad). Glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) bol tiež amplifikovaný ako kontrola s použitím nasledujúcich primerov: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '(dopredu) a 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3' (reverzný). Amplifikačnej reakcia bola zahájená denaturáciou DNA pri teplote 95 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 30 cyklov denaturácie templátu pri 94 ° C po dobu 1 minúty, nasadnutie primérov pri 60 ° C počas 1 min a predlžovanie primérov pri 72 ° C po dobu 1 minúty. NMe2 zvýšená expresia bola kvantitatívne definovaná ako nárast NMe2
mRNA dvojnásobný alebo väčší od základnej čiary stanovenej simulovanej transfekciou buniek.

Imunofluorescenčný farbenie NMe2
výrobku

Bunky stabilne prenesené s NMe2
cDNA a vektora vozidlá boli nanesené na krycie sklíčka a ponechané rásť až do zhlukovania. Boli dvakrát prepláchne ľadovo chladným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfáty (PBS), fixované v 4% paraformaldehydu v PBS po dobu 15 minút, permeabilizovány 0,5% Triton X-100, a inkubované s 1% hovädzieho sérového albumínu (BSA) po dobu 30 min pre blokovanie nešpecifickej väzby. Bunky boli potom inkubované s králičie protilátkou proti ľudskému NMe2 (1: 100, Beijing Biosyntéza Biotechnology) po dobu 24 hodín pri 4 ° C s následnou inkubáciou s FITC-konjugovanou sekundárnou protilátkou (1: 100, Beijing Biosyntéza Biotechnology) po dobu 1 hodiny , Všetky protilátky boli nariedia v PBS obsahujúcom 1% BSA. Jadrá bola kontrastne zafarbený s DAPI (1: 100 v PBS, 10 minút pri izbovej teplote).

bunkového cyklu analýza

bunky stabilne exprimujúce NMe2 a kontrolné bunky v kultúre boli spojené a fixované 70% ľadovo chladného etanolu s teplotou 4 ° C počas 24 hodín, premyje sa dvakrát ľadovo chladným PBS, a potom sa spracuje s RNázou a (20 ug /ml) počas 30 minút pri teplote 37 ° C. Boli inkubované s propidium jodidom (10 ug /ml konečná koncentrácia), v tme po dobu 30 minút pri izbovej teplote pred analýzou prietokovou cytometriou pre DNA ploidii.

Colony-formácie test

transfekciou a kontrolné bunky boli kultivované pri počiatočnej hustote 1000 buniek na 100 mm kultivačné misky v kompletnom DMEM médiu po dobu až 4 týždňov. Potom boli zafarbené metyl fialovú. Všetky bunkové kolónie, ktoré boli väčšie ako 2 mm v priemere (obsiahnuté ≥ 50 buniek) boli počítané v troch oddelených nádobách a sú vyjadrené ako stredná hodnota ± SEM. Za účelom overenia dát, sa tiež počíta životaschopné bunky, ktoré boli kultivované po dobu až 96 hodín. Stručne povedané, rodičovskej BCG823 a MKN45 bunky a bunky, ktoré boli stabilne transfekované buď ľudskou NMe2
cDNA alebo vektora vozidla (PC-DNA 3,1) boli schovať v hustote 2 x 10 ^{4 buniek /ml. Boli oddelené 48-96 hodín po počiatočnom očkovaní s 1% trypsínu a centrifugován pri 1600 x g. Bunkové pelety boli resuspendované v PBS a inkubované s 0,04% trypánovej modro po dobu 3 min. Prežívajúce bunky boli spočítané na hemocytometru.}

Testy pre migráciu buniek

dve komplementárne testy boli vykonané na meranie vplyvu expresiou NMe2 na rýchlosti migrácie buniek. Prvá z nich bola skúška hojenie rán, kde boli bunky nanesené na 6-jamkové doštičky a nechali sa rásť na ≥ 95% zhlukovania. Potom, čo dvakrát premytie buniek PBS, sterilné pipety tip bol použitý k poškrabaniu monovrstvy buniek (4-5 paralelné škrabance /doska). Bunky boli opäť premyté PBS, vyfotografovaná označiť poškriabaný stopy, a inkubujú sa s 2,5 ml média DMEM bez séra. Na východiskovej rýchlosti migrácie buniek, poškriabaný oblasť bola čiastočne pokrytá bunky migrovali do poranenej oblasti 24-48 h po poškodení, čo má za následok menšiu bezbuněčném oblasti. Pretože tento test hojenie rán je semi-kvantitatívne výsledky boli ďalej potvrdené migračným testu bunkovej Transwell. Stručne povedané, 6 x 10 ^{5 buniek suspendovaných vo 500 ul média bez séra obsahujúceho 0,1% BSA boli umiestnené v Transwell (BD Biosciences), ktorý bol umiestnený v 24 jamkové doske. Spodná komora obsahovala 500 ul kompletného DMEM médiu. Bunky sa nechali rásť v hornej komore po dobu 24 hodín na uľahčenie migrácie buniek z hornej komory do dolnej komory. Na konci tejto inkubačnej doby sa membrána v hornej komore sa stanovila 4% paraformaldehydu po dobu 30 minút, premyje sa destilovať vodou, a vysuší sa na vzduchu. Bunky na opačnej strane komory (transmigrated) boli zafarbené 0,1% metyl-fialové (Dade-Behring, Newark, DE) počas 30 minút, premyté, a pri pohľade v up-pravý mikroskopu (x 400, Nikon). Migrácia buniek bola definovaná ako počty buniek na membráne v 5 náhodných polí recenzie.}

Test invázie buniek

transjamkových komôr boli potiahnuté typu potkania chvost I fibrilárna kolagén [15] po dobu 30 minút pri teplote 37 ° C. Prebytočná tekutina sa odstráni a tvarovaný komory boli suší sa na vzduchu po dobu 1 hodiny v sterilnom prostredí. Bunky boli suspendované v 500 ul média DMEM bez séra s obsahom 0,1% BSA do konečnej hustoty 6 x 10 ^{5 a nanesené na kolagénové matrice v Transwell, ktorý bol umiestnený v 24 jamkové doske. Spodná komora obsahovala 500 ul kompletného DMEM médiu. Bunky zostal na povrchu membrány boli opatrne odstránené po 24 hodinách bunky boli schovať a membrána bola fixované a zafarbené pre bunky, ktoré transmigrated cez kolagénové matrice na opačnej strane transwell membrány.}

štatistickej analýzy

Všetky údaje boli analyzované pomocou štatistického programu SPSS 20.0. Kvantitatívne hodnoty boli vyjadrené ako priemer a SEM. Tieto štatistické analýzy boli použité v štúdii: Fisherovho exaktného testu alebo testu chí-kvadrát pre definujúce vzťah medzi expresiou NMe2 a patologické charakteristiky nádorových tkanív; Jedným zo spôsobov, ANOVA pre porovnanie medzi skupinou rodičovských buniek a buniek transfektovaných buď vektorom vozidla alebo človeku NMe2
cDNA; a Pearson analýza pre koreláciu medzi NMe2 prejavu a diferenciácie a metastázovaniu rakovinových buniek.

Výsledky

Združenie NMe2 prejavu s histologické charakteristike rakoviny žalúdka

Zhromaždili sme preparátu z 139 pacientov s adenokarcinómom žalúdka. Tabuľka 2 uvádza demografické informácie o týchto pacientov a histologické charakteristiky nádorových tkanív z týchto pacientov. NMe2 výraz bol slabý alebo nie je detekovaný v zle diferencované tkanivá, ale bol intenzívny dobre diferencované tkaniva na úrovni porovnateľnej s priľahlou normálnou tkanive (obr. 1). Vysoká úroveň expresie NMe2 bolo spojené s výrazne zníženou rýchlosťou metastázy do lymfatických uzlín ( p
= 0,038), ale nie s veľkosťou primárneho nádoru a hĺbky rakoviny invázie. Pearson korelačný analýza ukázala, že NMe2 expresia bola nezávisle spájaná s mierou diferenciácie buniek (r = 0,436, p
= 0,000) a rozšíril do miestnych lymfatických uzlín (r = -0,281, p
= 0,001, tabuľka 1).

Vplyv NMe2 na proliferáciu buniek karcinómu žalúdka v kultúre

Ak chcete ďalej skúmať pridružení NMe2 výrazu s patologickými vlastnosťami nádorových buniek žalúdka, sme študovali bunky z BGC823 a MKN45 rakoviny žalúdka liniek, čo vyjadrené NMe2 slabo na úrovni, v porovnaní so zle diferencované tkaniva karcinómu (obr. 1). Tieto bunky boli transfekovány s ľudskou NMe2
cDNA pre zvýšenú expresiu NMe2, ako kvantitatívne meria zvýšením NMe2
mRNA (kvantitatívne RT-PCR) a NMe2 proteínového produktu (fluorescenčnou, obr. 2 ).

a potom skúmaná ako expresiou NMe2 rast regulované buniek meraním DNA ploidii a tvorbu kolónií týchto buniek. Zistili sme, žiadny rozdiel v DNA ploidii medzi bunkami, ktoré nadmerne exprimujú NMe2 a tie netransfekovanými a falošne transfekované bunky z oboch línií (tabuľka 3 a S1 obr.), Čo naznačuje, že zvýšenie expresie NMe2 nemal žiadny vplyv na bunkových cyklov. Avšak, NMe2-exprimujúce bunky mali významne zníženú schopnosť tvoriť kolónie v kultúre v porovnaní s sham transfekciou a netransfekovaných buniek (Obr. 3). Toto pozorovanie boli potvrdené výsledky z metódy bunkovej počítania (obr. 3C)

Vplyv NMe2 o migrácii a invázii buniek

Ďalej sme vyhodnotili schopnosť NMe2-expresiou buniek migrovať z dôvodu smerový migrácie je dôležitým predpokladom pre inváziu rakovinových buniek do okolitého tkaniva. Táto smerová migrácia bola skúmaná pomocou testu na hojenie rany, ktorý meria rýchlosť migrácie buniek do oblasti poranenia vytvorenej ostrým predmetom. Ako je znázornené na Obr. 4A a 4B, je šírka poškodenej oblasti po 48 hodín v kultúrach, bola u NMe2
-transfected bunky ako pre non-transfekované a falošne transfekované bunky. Pomalého prechodu bola nájdená v bunkách z oboch bunkových línií, čo naznačuje, že bunky so zvýšenou expresiou NMe2 prenesené oveľa pomalšie. Pretože tento hojenie rán testu je semi-kvantitatívne, tiež kvantitatívne merať rýchlosť migrácie buniek pomocou testu Transwell. V súlade s testom hojenie rán, NMe2 exprimujúce bunky prenesené na ~ 50% non-transfekované alebo falošne transfekciou buniek (obr. 4).

Zníženie migráciu buniek by mohla znížiť schopnosť týchto buniek napadnúť okolité tkanivá. Vyšetrovať túto možnosť, meriame invázie nádorových buniek do kolagénové matrice v dobre zavedené teste Transwell komory. BGC823 bunky, ktoré nadmerne exprimovaný NMe2 výrazne znižuje ich schopnosť napádať kolagénovú matricu 60% netransfekovanými a falošne transfekované bunky (Obr. 5). Rýchlosť invázie bol podobne znížená MKN45 bunkách transfekciou s NMe2
cDNA v porovnaní s rodičovskými bunkami a tie transfekovány vektorom vozidla (viď obr. 5).

Diskusia

sme skúmali vzťah medzi expresiou a charakteristík karcinómu žalúdka v tkanivách chirurgicky odstránených z pacientov NMe2 a v kultivovaných bunkách z dvoch známych rakovinou žalúdka línií. Štúdia je nevyhnutné, pretože NMe2
bol pôvodne identifikovaný ako prvý metastáz supresorového génu, ale jeho schopnosť blokovať rakoviny lokálnu inváziu a metastázovaniu vzdialený Zdá sa, že bunky špecifické pre typ Medzi rakoviny, ktoré boli doteraz študované [8- 14]. Napríklad analýza 35 pacientov s karcinómom štítnej žľazy papilárne a 11 metastatických lymfatických uzlín vykazovali významne zníženú hladinu NME1
mRNA v metastatických lymfatických uzlinách, vzhľadom k tomu, NMe2
mRNA nebola zmenená v pôvodných nádorov a lymfatických uzlín [14], čo svedčí o rozdielnych rolí NME1 a NMe2 v rakoviny invázii a metastázovaniu. Metaanalýza 278 pacientov s rakovinou hrubého čreva, 177 s rakovinou prsníka, 137 s rakovinou vaječníkov a 77 s rakovinou pľúc tiež zistilo zníženie úrovne expresie v NMe2 karcinómom v porovnaní s rakovinou nemetastázujúce [17]. Avšak, aj napriek negatívne asociácie medzi NME1 /NMe2 prejavu a rakoviny invázie do miestnej lymfatickej uzliny a endometria infiltrácie, NME výraz nebolo spojené s TNM skóre a diferenciáciu vnútromaternicového membrány karcinómu a rakoviny krčka maternice [16]. Tu ponúkame niekoľko radov dôkazov, ktoré NMe2 obmedzuje proliferáciu, migráciu a inváziu do extracelulárnej matrix rakovinových buniek žalúdka.

Po prvé, je nájdený vyššiu úroveň NMe2 expresie v dobre diferencovaný a menej invazívne tkaniva rakovinu žalúdka chirurgicky odstránené pred chemoterapiou a rádioterapiou vo veľkom súbore pacientov (tabuľka 1 & obr. 1). Metastázy rakoviny miestnych lymfatických uzlín sa častejšie vyskytujú v nádorovom tkanive, ktorá mala nízku úroveň NMe2 expresie a tento vzájomný vzťah medzi NMe2 prejavu a diferenciácie /metastázy v týchto tkanivách pacientov zostáva po tom, čo boli dáta rozdelení podľa veku, pohlavia sa veľkosť primárneho nádoru a hĺbkou invázie (tabuľky 1 a 2,). Tieto zistenia sú v súlade s nedávnou správou, ktorá sa viaže NMe2 väzbovú faktora 2 v jadre pre zníženie telomerasové aktivity [37], čo naznačuje Mechanistický vzťah medzi expresiou NMe2 a prežitie nádorových buniek telomér opakovanie.

Po druhé, skúmané účinky nadmernou expresiou NMe2 o miere množenia sa, migrácie a invázie do extracelulárnej matrix in vitro
buniek z oboch dobre preskúmaných žalúdka bunkových línií karcinómu BGC823 a MKN45 [18-21]. Transfekcia s človekom NMe2
cDNA za následok dvojnásobné alebo vyššej úrovni NMe2 expresie v týchto bunkách v porovnaní s mock transfekciou buniek (obr. 2). Tento NMe2 nadmerná expresia neovplyvnilo DNA ploidii (tabuľka 3), ale výrazne spomalila tvorbu kolónií týchto buniek (obr. 3), čo naznačuje, že nadmerne exprimujúce NMe2 oneskoruje prechod od replikáciou DNA k mitóze. Tento výsledok je v súlade s predchádzajúcimi správami, že NMe2 nemá vplyv na rast kultivovaných nádorových buniek a nie je spojená s veľkosťou primárneho karcinómu implantovaného do zvierat [22-27]. Avšak, to je v rozpore so správami, ktoré NMe2 podporuje [28,29] alebo zníži [30] šírenie iných typov rakovinových buniek. Presné dôvody pre rozpor je potrebné ešte ďalej skúmaná, ale tieto dáta naznačujú, bunkové účinky typovo špecifické na NMe2
génu v patogenéze rakoviny.

Po tretie, na rozdiel od minimálny vplyv na proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, nadmerná expresia NMe2 za následok výrazné zníženie migrácie a invázie buniek prostredníctvom kolagénové matrice ako je ukázané v troch rôznych, ale vzájomne sa doplňujúcich testoch (obr 4 &Gamble. 5). Naše údaje podporujú skoršie zistenia podobné inhibičné účinky na rakovinu prsníka [8], rakovina ústnej dlaždicových buniek [28] a melanómu buniek [9], aj keď výnimky boli znovu uvedené v hepatocelulárny [13,29] a kolorektálny karcinómy buniek [31]. Je Zostáva určiť, či za zníženej migráciu a inváziu NMe2-nadmernou expresiou buniek sú dôsledkom zníženej schopnosti týchto buniek k proliferácii.

Naše výsledky možno identifikovať rakovinové bunky žalúdočné ako citlivé na viac ako-vyjadril NMe2, ale kritickou otázkou zostáva, čo reguluje tieto rôzne aktivity NMe2 medzi rôznymi typmi nádorových buniek. Jeden potenciálny mechanizmus, je to, že aktivita je závislá na NMe2 hore a následné molekúl, ktoré interagujú s NMe2 v danom type buniek. už skôr bolo zistené niekoľko molekúl k interakcii alebo regulovať NMe2, ako je EGFR, c-ErbB-2
, c-ErbB-3 stroje a sex receptora steroidu v ovariálnych karcinómov [32]. Plakoglobin bola hlásená k interakcii s NMe2, aby podporovali jeho expresiu v bunkách z ľudského jazyka spinocelulárneho karcinómu [33]. NMe2 bolo tiež zistené, že interakcia s MDM2 (Mouse double minút 2 homológov), k zníženiu motility buniek karcinómu obličiek [34]. MDM2 je E3 ubiquitin-Ligas proteín a slúžia ako negatívne regulátor p53 nádorového supresor. Vzťah medzi NMe2
gén a gény myc
rodine sa zdá byť zložitejšie. Produkty NME1 stroje a NMe2
gény boli navrhnuté byť po prúde C- myc
regulačné dráhy [7] a podieľa sa na down-reguláciu Cdc42 funkcie u neuroblastómu [35]. NMe2 je tiež hlásená k interakcii s G-quadruplex DNA v nukleázy hypersenzitívne prvku c-myc
promótor pre indukciu c-myc expresie [36]. Prístup systém biológie skúmať tieto špecifické cesty namiesto jednotlivých molekúl môže byť požadované, aby pitvať rolí NMe2
génu a jeho produktu v rôznych typov rakoviny.

V súhrne sme preukázali, že nadmerná expresia NMe2 znižuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka do bunkovej matrix in vitro
. V dôsledku toho, NMe2 expresia je spojená s dobre diferencované a menej invasitve histológie karcinómu žalúdka. Tieto výsledky naznačujú, že NMe2
gén a jeho produkt môže slúžiť ako potenciálny marker pre predikciu invazivitu karcinómu žalúdka a tiež ako terapeutický cieľ, ktorý môže byť up-regulované prostredníctvom génovej terapie.

Podporné informácie
S1 obr. Účinok NMe2 nadmerné expresie na žalúdočné rakovinové bunky bunkového cyklu.
DNA ploidii buniek transfekciou NMe2
cDNA bola analyzovaná prietokovou cytometriou s použitím komerčné zostavy v súlade s pokynmi výrobcu. Panely A-C boli pre rodičovských BCG823 bunky a tie transfekovány s NMe2
cDNA alebo vektora. Panely D-F boli pre MKN45 buniek s rovnakými ošetrenie
doi :. 10,1371 /journal.pone.0115968.s001
(DOC)

• Ploche ONE: transkripčných faktorov a microRNA-Čo-Regulované Gény v rakovina žalúdka invázie u Ex Vivo
• Ploche ONE: klinický význam a Rizikové faktory solitérne metastáz do lymfatických uzlín v rakoviny žalúdka