Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: microRNA-410 Potláča migrácie a invázie zacielením MDM2 v žalúdku Cancer

abstraktné

Karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších malignít u nádorov vo východoázijských krajinách. Určenie presných prognostických markerov a účinných terapeutických cieľov je dôležité pri liečbe rakoviny žalúdka. microRNA (miRNA) hrajú dôležitú úlohu pri vzniku nádorov. Avšak, mechanizmus, ktorým miRNA regulujú žalúdočné nádorových metastáz zatiaľ nejasné. V tejto štúdii sme zistili, že hladiny Mir-410 v karcinómu žalúdka a bunkových línií boli oveľa nižšie ako v normálnej kontroly, v danom poradí, a nižšiu úroveň Mir-410 bola významne spojená s lymfatických uzlín. Transfekcia MIR-410 napodobňuje môže významne inhibovať bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu v HGC-27 žalúdočných nádorových bunkových línií. Na rozdiel od toho Vyradenie MIR-410 mal opačný účinok na bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu. Navyše sme tiež zistili, že MDM2 bola negatívne regulovaná Mir-410 na posttranskripční úrovni, pomocou špecifického cieľového miesta s 3'UTR luciferasovou reporterového testu. MDM2 bola nepriamo úmerná expresiu Mir-410 v žalúdočnej rakovinové tkanive, a nadmerná expresia MDM2 v Mir-410-transfekciou buniek karcinómu žalúdka účinne zachránil inhibíciu bunkovej proliferácie a invázie spôsobené MIR-410. Tak, naše zistenia naznačujú, že mier-410 sa choval ako nový nádorový supresor zacielením génu MDM2 a inhibuje žalúdočné rakovinové bunky množenia sa, migrácie a invázie. Výsledky tejto štúdie prispela k súčasnej pochopeniu týchto funkcií Mir-410 v karcinómu žalúdka

Citácia :. J Shen, Niu W, M Zhou, Zhang H, Ma J, Wang L, et al. (2014) microRNA-410 Potláča migrácie a invázie zacielením MDM2 v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 9 (8): e104510. doi: 10,1371 /journal.pone.0104510

Strih: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Spojené štáty |

prijatá: 6. mája 2014; Prijaté: 09.07.2014; Uverejnené: 19.srpna 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Anhui zemská Natural Science Foundation (. NO 1208085QH169) http://220.178.98.52/zrkxjj/. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Rôzne stratégie boli použité na liečbu rakoviny žalúdka (GC), ktorý je štvrtá najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí rakoviny na svete [1], [2]. Väčšina pacientov GC je diagnostikovaných v štádiu III alebo IV, a miera lymfatických uzlín je vysoká [3], [4]. V súčasnej dobe pacienti s neskorej fáze GC sú s celkovým 5 rokov svoje prežitie appoximately 20% [5]. Pre nich, to je veľmi klinickú hodnotu pre ďalšie objasnenie molekulárnych mechanizmov zapojených do GC metastáz a pre identifikáciu nových markerov pre diagnózu, prognózu a liečbu pre pacientov s GC.

microRNA (miRNA) sú malé nekódujúca RNA z ~ 22 nukleotidov v dĺžke, ktoré regulujú expresiu svojich cieľových mRNA prostredníctvom transláciu mRNA alebo štiepením [6]. Ktoré sú zapojené do dôležitých biologických procesov, vrátane vývoja a diferenciácie [7], [8]. Dysregulácia miRNA je v korelácii s hrajú dôležitú úlohu v rozvoji a progresii rakoviny tým, že reguluje bunkovú proliferáciu, diferenciáciu a apotosis carcinogesis [9], [10]. Aberantne expresie miRNA alebo mutáciami génov miRNA boli dobre skúmané u mnohých typov nádorov vrátane lymfómov, pľúc, pankreasu, leukémie, prsníka, hrubého čreva a rakoviny pečene [11] - [15]. Avšak role miRNA v GC aj naďalej do značnej miery neznámy.

Predchádzajúca štúdia skúmala úlohu MIR-410 v niekoľkých druhov rakoviny. Gattolliat et al [16] .demonstrated, že expresia MIR-410 bol významne spojený s bezpríznakového prežitie non-zosilnený priaznivé neuroblastómu. Ďalej, Chen v el [17] preukázali, že expresia MIR-410 bola znížená v ľudských gliómov a nútenej expresie Mir-410 vo bunky gliómu silne inhibuje proliferáciu buniek, invázia sprostredkované zacielenie v trhovom hospodárstve. Okrem toho, Chien et al [18] zistili, že mier-410 negatívne regulovaný pRb /E2F dráha priamo cielenie CDK1, ktorý bol onkogén u karcinómu prsníka. Avšak úloha Mir-410 v GC stále zostáva nejasný. V tejto štúdii sme preukázali, že zníženie expresie MIR-410 je charakteristický molekulárnej zmeny v GC a skúmala účinok modulovaných hladiny Mir-410 na fenotypmi GC bunkových línií. Tiež sme ukázali, že mier-410 môže fungovať ako onkogén priamo zacielenia MDM2.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Všetci títo pacienti súhlasili s účasťou v štúdii a dali písomný informovaný súhlas. Obe tieto štúdie a súhlas boli schválené etickou rady zemskej nemocnice Anhui a dodržiavanie Helsinskej deklarácie.

Ľudské vzorky

Human GC a ich zodpovedajúce non-nádorové žalúdočné vzorky boli odobraté v čase chirurgickej resekcii zo zemskej nemocnice Anhui od roku 2008 do roku 2009. písomný informovaný súhlas bol získaný pred odberom. Jedna časť bola stanovená 10% formalínu na histopatologické diagnostiky, a druhý bol okamžite snap-zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované pri teplote -196 ° C v tekutom dusíku až do bola extrahovaná RNA. Využitie ľudských tkanív bol schválený Clinical Research etickou komisiou Anhui provinčné nemocnice.

bunkovej kultúre

SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 a HEK293T bunky boli zakúpené od Šanghaja ústavu biochémie a bunkovej biológie na Chinese Academy of Sciences. Žalúdočné epitelu-1 buniek (GES) bol získaný z Shanghai Ruijin nemocnice Shanghai Jiaotong University School of Medicine. SGC-7901, HGC-27, MGC-803, MKN-45 a GES boli udržiavané v RPMI 1640 a HEK293T bola udržiavaná v médiu modifikovanom médiu Dulbecco Eagle. Médium bolo doplnené 10% fetálnym hovädzím sérom. Bunky boli inkubované pri 37 ° C vo vlhkej komore s obsahom 5% oxidu uhličitého.

Plazmidy a transfekciu buniek

MIR-410 napodobňovať /inhibítor a kontroly boli získané od RiboBio (Guangzhou, Čína). Bunky HGC-27 boli nasadené na šiestich jamkové doštičky v 30% zhlukovania jeden deň pred transfekcia. Transfekcia s Mir-410 mimických /inhibítora alebo kontroly bola vykonaná s použitím Lipofectaminu 2000 činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Transfekční komplexy boli pripravené v súlade s pokynmi výrobcu.

QRT-PCR

QRT-PCR, celková RNA bola extrahovaná z buniek s činidlom TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverzný transkripcie bola vykonaná s PrimeScript RT reakčnej zostave s gDNA gumou (Takara) podľa inštrukcií výrobcu. Expresie MIR-410 bola overená zmeneného stemloop RT-PCR so špecifickými RT a PCR primery. U6 snRNA bola použitá ako vnútorná kontrola. RT reakcie boli vykonávané za použitia RNA frakcia sa Promega RT Kit po protokolu výrobcu. Podmienky PCR boli vykonané denaturáciu DNA pri 94 ° C po dobu 4 minúty, nasledované 40 cyklami amplifikácie: 94 ° C počas 40 s, 52 ° C počas 40 s, 72 ° C počas 40 sekúnd pre zber dát. Kvantitatívne PCR bola vykonaná na ABI 7500 termocykléra (Applied Biosystems) s použitím SYBR Premix Ex Taq (Perfektný v reálnom čase) súpravy (Takara, Japonsko) podľa inštrukcií výrobcu.

Cell Test proliferácie

celkom 10 4 buniek na jamku bolo umiestnených do 96-jamkových doštičiek pred transfekcia a kultivované po dobu 24 h za normálnych podmienok. Potom boli transfekovány napodobňovať alebo inhibítorom MIR-410 anti-MIR-410 spolu s párovými negatívne kontroly. Bunková proliferácia bola hodnotená pomocou mobilného počítanie Kit 8 (Dojindo, Tokio, Japonsko) podľa protokolu výrobcu.

Migrácia buniek a invázie test

Pre testy migrácie, 5 x 10 4 bunky boli pridané do hornej komory vložky (BD Bioscience, 8-um veľkosť pórov). Pre inváziu testoch, 5 buniek bolo pridané do hornej komory vložky potiahnuté Matrigelu (BD Bioscience), 1 x 10. V oboch testoch, boli bunky v médiu bez séra a médiu obsahujúcom 10% FBS v dolnej komore slúžil ako chemoatraktantu. Po niekoľkých hodinách inkubácie, bunky, ktoré neboli migrujú alebo prenikajú cez póry boli starostlivo zničený vatou. Potom inserty boli zafarbené 20% metanolu a 0,2% kryštalickej fialovej, zobrazený, a počítal s IX71 inverzného mikroskopu (Olympus).

Western blot analýza

Proteíny boli separované na SDS-polyakrylamidovom gélu a prenesené na nitrocelulózové membránu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membrána bola blokovaná 5% netučného mlieka a inkubované s králičie anti-MDM2 monoklonálna protilátka (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) a myší anti-b-GAPDH monoklonálna protilátka (1: 10000 , Sigma). Proteíny boli detekované chemiluminiscenčný rozšírenými činidiel (Pierce, Rockford, IL, USA).

Luciferase reportér test

HEK293T bunky boli umiestnené do 96-jamkových doštičiek. Po 24 hodinách inkubácie sa zmes na 100 ng pLUC 3'UTR, 5 pmol negatívna kontrola, Mir-410 sa napodobniť kotransfekovány 20 ng.

Renilla do HEK293T buniek s použitím Lipofectamine 2000 štyridsaťosem hodín po transfekciu, svetlušky a luciferázy Renilla aktivity boli merané s Dual-Luciferase Reporter systému (Promega, Madison, WI, USA). Účinnosť transfekcia bola normalizovaná kotransfekcí reportérovým vektorom Renilla.

Štatistická analýza

Dáta bola prezentovaná ako priemer ± smerodajná odchýlka na najmenej troch experimentov. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou SPSS 15.0. Jednosmerný analýzy variance (ANOVA) a Student t-testom boli použité na štatistické analýzy. Hodnota p. ≪ 0,05 bola považovaná za označujú štatistickú analýzu

Výsledok

Expresia MIR-410 bolo významne down-regulované v GC bunky a tkanivá

Aby bolo možné posúdiť úloha Mir-410 v GC, sme hodnotili expresie Mir-410 v GC bunkové línie, tkanivá a ich spárovaných normálnych tkanivách pomocou kvantitatívnej RT-PCR. Zistili sme, že hladiny MIR-410 boli často down-regulované v bunkových líniách GC v porovnaní s GES. Obrázok 1B ukazuje, že hladiny MIR-410 boli down-regulované v GC tkanivách v porovnaní s tými, u zodpovedajúcich normálnych tkanivách. Priemerná úroveň expresie v karcinómu tkanivách (kombinácia), bol významne vyšší v porovnaní s ich susednými nenádorových tkanív (Obrázok 1C). Tiež sme ukázali, že expresia Mir-410 v metastázy GC tkanivách bola nižšia ako v non-metastázy tkanivách (obr. 1D).

MIR-410 inhibovala proliferáciu GC buniek, migrácie a invázie

hladiny MIR-410 boli v GC buniek, ktoré boli transfekovány s Mir-410 a napodobňuje hladiny Mir-410 boli znížené, ktorí boli liečení inhibítorom MIR-410 (obr. 2A) výrazne zvýšil. Up-regulácia proliferácia MIR-410 inhibovala GC buniek; Naproti tomu Vyradenie MIR-410 mal opačný účinok na proliferáciu buniek (obr. 2B). Okrem toho, transwell test a test invázie ukázali, že migrované a invázie buniek transfektovaných s Mir-410 napodobňuje sa dramaticky znížila v porovnaní s kontrolou a neošetrených buniek. Tiež sme ukázali, že migrované a invázie buniek transfektovaných s inhibítorom Mir-410 sa dramaticky zvýšila v porovnaní s kontrolou a neošetrených buniek. (Obr. 2C a D).

MIR-410 priamo cielené MDM2 v GC

Ako predpovedal PicTar, tam bol komplementarita medzi moje-MIR-410 a MDM2 3'-UTR (obr . 3A). Preukázať, že mier-410 reguluje priamo MDM2, ktorý je zamestnaný sme reportéri systém dual-Luciferase. Zistili sme, že ko-expresie MIR-410 významne potlačil FIREL Luciferase reportérového aktivitu divokého typu MDM2 3 'UTR, ale nie mutantný 3'UTR (obr. 3B). Zvýšená expresia MIR-410 redukuje expresiu MDM2 mRNA a proteínu (obr. 3C a D).

Nadmerná expresia MDM2 inpaired MIR-410 indukovanú inhibíciu invázie do GC buniek

Vykonali sme záchrannej experimenty transfekcia 3'UTR-negatívne MDM2 spolu s Mir-410. Ako sa dalo očakávať, transfekcia s pcDNA3.1-MDM2 zmierniť zníženie MDM2 výsledkom MIR-410 napodobniť liečby (obr. 4A). V zhode s expresiou cieľových proteínov, transfekcia s pcDNA3.1-MDM2 zmierniť inhibíciu amplifikácie buniek (obr. 4B) a zvýšenie invazívnych buniek (obr. 4C) je dôsledkom MIR-410 napodobovať liečby.

MDM2 sa nepriamo vyjadril s Mir-410 v GC

Pre ďalšie objasnenie vzťahu medzi Mir-410 a MDM2 expresiu v primárnych vzoriek, sme najprv detekovaný MDM2 v bunkových líniách GC. Ako je znázornené na Obr. 5A a 5B, mRNA a proteínu MDM2 bola oveľa Higer v bunkových líniách 4 GC než v GES. Tiež sme zistili, že expresia MDM2 v GC tkanivách bola významne vyššia ako v zodpovedajúcich susedných normálnych tkanivách (obr. 5c). Rozptyl plot a korelačný analýza Pearson ďalej zistené, že expresia MIR-410 sa v negatívnej korelácii s úrovňou cieľového proteínu vo vzorkách GC (obr. 5d). Tieto údaje naznačujú, že znížená expresia MIR-410 bol spojený s zvýšenej hladiny Mdm2 vo väčšine pacientov GC.

Diskusia

miRNA konali ako dôležité regulátory génovej expresie na post -transcriptional úroveň a regulujú celý rad fyziologických a vývojových procesov [6], [19], [20]. Montážne dôkazy naznačujú, že zmeny v expresii miRNA prispievajú k patogenéze najviac ľudských nádorov, ktoré môžu pôsobiť buď ako onkogény alebo nádorových supresor [21], [22]. V poslednej dobe, akumuláciu dáta ukazujú, že miRNA sú zapojené do mnohých dôležitých biologických udalostí, ako je napríklad tvorbe nádorov a nádorových metastáz [23], [24]. V tejto štúdii sme skúmali biologickú úlohu Mir-410 v ľudskom GC vzniku nádorov. Naše výsledky ukazujú, že mier-410 bol často down-regulované v ľudskej GC a že jeho down-regulácia bola významne spojená s klinickom štádiu a lymfatických uzlín. Presadzovaná expresie MIR-410 by mohlo zvýšiť proliferáciu, migráciu a inváziu do GC buniek línie in vitro. Ďalej sme zistili, MDM2 putativní nádorový supresorový gén, ako priamy funkčný cieľ MIR-410. Pokiaľ je nám známe, toto je prvá štúdia, aby preskúmala úlohu Mir-410 v GC, a naše výsledky ukazujú, že mier-410 sa choval ako nový onkogén v GC.

Deregulácia MIR-410 je častý udalosť v rôznych druhov rakoviny, čo naznačuje, že mier-410, môže hrať dôležitú úlohu pri vzniku nádorov a progresii nádoru. Gattolliat a jeho kolegovia ukazujú, že expresia MIR-410 bola významne spojená s bezpríznakového prežitie non-zosilnený priaznivým neuroblastómu [16]. Ďalej, Chen [17] zistili, že mier-410 expresie bola znížená v ľudských gliómov a nútenej Mir-410 expresie v bunkách gliomových silne inhibuje proliferáciu buniek, invázia sprostredkované zacielenie v trhovom hospodárstve. Avšak, nebola hlásená expresie a funkcie Mir-410 vo vývoji GC. V tejto štúdii sme identifikovali expresie Mir-410 v rôznych bunkových línií a GC GES pomocou QRT-PCR. Expresie MIR-410 bol vo všetkých štyroch bunkových líniách v porovnaní s GC v GES výrazne zvýšil. Okrem toho, výsledky získané z klinického GC tkaniva tiež potvrdila, že mier-410 sa down-regulované v GC tkanivách v porovnaní s non-párových rakovinové okolitého tkaniva, čo naznačuje jeho možné zapojenie v onkogénne transformácie a nádorových metastáz. Následne sme potvrdili, že inhibícia MIR-410 významne podporoval GC bunkovej proliferácie, migrácie a invázie in vitro.

Ďalej sme skúmali molekulárnej mechanizmus fundamentálnu úlohu Mir-410 a identifikovaný MDM2 ako priama funkčná downstream cieľ Mir-410 v GC buniek. Bioinformatika prístupy, ktoré boli použité na predpovede cieľov miRNA, upozornila na zápas vysoký semien voľnú energiu v dobre zachovaných miRNA-väzobné miesto a cieľových mRNA, ale špecifickosť naďalej problémom pri definovaní cieľov mnohých miRNA. Tak, nadmerné expresie miRNA by down-regulujú expresiu cieľového proteínu. Komplementárne sekvencie MIR-410 je identifikovaný v 3 'UTR MDM2 mRNA. Ďalej sme preukázali, že mier-410 sa priamo zameriava na 3 'UTR MDM2, zatiaľ čo jeho zvýšená expresia bola spojená s potlačením aktivity luciferázy. Okrem toho významné down-regulácie v úrovni proteínu MDM2 bola pozorovaná po MIR-410 nadmernej expresie, čo naznačuje, posttranskripční regulácia MDM2 pomocou zacielenia na jeho 3 'UTR. Tieto výsledky ukazujú, že mier-410 môže fungovať ako nádorový supresor čiastočne sprostredkované potlačením expresie MIR-410 vo vývoji GC.

MDM2 je onkogén, ktorý bol prvýkrát objavený v lokuse amplifikovaný dvojitým minút chromozómov v tumorigénny myšou bunkové línie (3T3-DM) [25]. Hlavnou funkciou MDM2 je, že inhibujú p53 biologickú aktivitu tým, že blokuje transkripčný aktivitu proteínu p53 a podporovať degradáciu proteínu p53 [26] - [28]. Vysoké hladiny MDM2 zníženie hladiny proteínu p53 a môže zmierniť funkciu p53, čo zvýšilo riziko rakoviny a /alebo zrýchleného tvorbu nádorov a progresie [29]. Onkogénu MDM2 hrá dôležitú úlohu v progresii rakoviny [30]. Nadmerná expresia MDM2 v nádorových bunkách indukovanú proliferáciu buniek, inhibuje apoptózu buniek [31]. Niekoľko štúdií ukázalo, že zvýšená expresia MDM2 bola spojená so zlou prežitie a bol užitočný prediktívne faktor pre zlou prognózou u ľudí s hepatocelulárnym karcinómom a karcinómov prsníka [32], [33]. Navyše nedávne štúdie preukázali, že MDM2 bol exprimovaný vo vyšších hladinách v GC tkanivách ako v non-rakovinové žalúdočnej sliznice, a MDM2 expresia bola spojená s patologickým funkcií u pacientov liečených iba s operáciou [34], [35]. Okrem toho, Vyradenie MDM2, alebo nadmerná expresia JWA má synergický účinok na potlačenie žalúdočnej proliferácie nádorových buniek a migrácia [35]. Avšak mechanizmus, ako MDM2 bola zvýšená expresia je stále neznámy. Tieto výsledky ukazujú, že schopnosť Mir-410 na cieľovej MDM2 môže poskytovať jeden taký mechanizmus post-transkripčné kontrolou MDM2.

V súhrne, naše výsledky ukázali, že mier-410 bol významne down-regulované v GC buniek a tkanív. Presadzovaná expresie MIR-410 zvýšenú proliferáciu GC buniek, migrácie a invázie prostredníctvom priameho cielenia MDM2. Tieto zistenia naznačujú, že toto nové MIR-410 osi /MDM2 poskytuje nový pohľad na základné mechanizmy nádorových metastáz, a potláčanie expresie Mir-410 môže byť potenciálne terapeutické stratégie pre liečbu GC v budúcnosti.

podporné informácie
Tabuľka S1.
patologickým charateristics pacientov s GC
DOI: 10,1371. /journal.pone.0104510.s001
(DOCX)
Tabuľka S2.
Primer sekvencie
doi :. 10,1371 /journal.pone.0104510.s002
(DOCX)

Other Languages