Ploche ONE: Twist1 podporuje rakovina žalúdka bunkovej proliferácie prostredníctvom up-regulácia FoxM1

abstraktné

Twist-related proteín 1 (Twist1), tiež známy ako trieda Základné helix-loop-helix proteín 38 (bHLHa38) , bol zapletený do určovania a rozlišovanie bunkové línie. Predchádzajúce štúdie preukázali, že Twist1 expresie je up-regulovaná v rakovinou žalúdka s chudobnými klinické výsledky. Okrem toho Twist1 sa navrhuje, aby sa zapojili do progresie ľudskej rakoviny žalúdka. Avšak, jeho biologické funkcie zostávajú z veľkej časti nepreskúmané. V tejto štúdii sme sa ukázať, že Twist 1 nadmerná expresia vedie k významnému up-regulácia FoxM1, ktorý hrá kľúčovú úlohu v progresii bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdka. Na rozdiel od toho Vyradenie Twist 1 znižuje FoxM1 expresie, čo naznačuje, že by mohol byť FoxM1 priamym transkripčný cieľ Twist 1. Na molekulárnej úrovni, sme ďalej ukazujú, že Twist 1 mohol viazať na oblasti promotora FoxM1, a následne získavať P300 pre vyvolanie FoxM1 mRNA transkripcie. Preto sú naše výsledky odhaliť predchádzajúce nezistenej Twist 1 /FoxM1 regulačné dráhy, čo môže pomôcť pochopiť mechanizmy žalúdočné šírenie rakoviny

Citácia :. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 podporuje rakovina žalúdka bunkovej proliferácie prostredníctvom up-regulácia FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, United States of America

prijatá: May 31, 2013; Prijaté: 03.09.2013; Uverejnené: 24.októbra 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov: .. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

epitelu-mezenchymálnych-prechod (EMT) je proces, v ktorom epitelové bunky strácajú polaritu a z bunky do bunky, adhéziu, a prejsť výraznou remodeláciu cytoskeletu [1,2]. Súbežný so stratou epitelu bunkovej adhézie a cytoskeletálnych komponentov, bunky podstúpi EMT získajú expresiu mezenchymálnych komponentov a migračnej fenotyp [2,3].

Niekoľko kľúčových indukujú EMT sú transkripčné faktory vrátane Twist 1, Snail a Slug, ktoré potláčajú E-cadherinu výraz [4,5]. Twist1 patrí k základnému helix-loop-helix rodiny transkripčných faktorov [6]. Spočiatku, Twist1 bolo navrhnuté, že sú nevyhnutné pre vývoj mesodermally získaných tkanív, vrátane svalov a osteogénny bunkových línií [7,8]. Následné štúdie preukázali, že Twist 1 podporuje EMT a hrá kľúčovú úlohu v metastáz v niekoľkých nádorových modeloch [9,10]. Expresia Twist 1 sa tiež podieľa na podpore metastáz a invazívnych patologických podtypov v niekoľkých typov karcinómu [11]. Z tohto dôvodu, Twist 1 bolo navrhnuté, aby onkogénne vlastnosti. Napríklad zvýšená expresia Twist v rabdomyosarkom inhibuje Myc-indukovanú apoptózu a zasahuje do potlačenie p53 nádoru [12]. Up-regulácia Twist je spojená s malígnou transformáciou v T-bunkového lymfómu [13]. Nútené expresia Twist vyvoláva odpor ľudských nádorových buniek na lieky, ktoré inhibujú tvorbu mikrotubulov [14].

Avšak, účinok a mechanizmus Twist génu na proliferáciu karcinómu žalúdka zostáva objasnený. Nedávne štúdie ukázali, že Twist1 je up-regulovaná v žalúdočných s rakovinou spojené fibroblastov so zlými klinickými výsledkami [15]. Okrem toho, down-regulácia génu Twist 1 potláča proliferáciu buniek karcinómu žalúdka tým, že negatívne reguluje AP-1 aktivitu, ktorá vedie k expresii cyklin D1 klesajúci [16]. V tejto práci, boli použité dve bunkové línie karcinómu žalúdka na skúmanie účinkov a mechanizmus Twist 1 génu na proliferáciu buniek.

Materiály a metódy

Cell Culture

Four epiteliálne bunkové línie (NCI-N87, AGS, HGC-27 a MGC80-3) odvodené od karcinómu žalúdka boli získané z American Type Culture Collection (USA). Bunky boli kultivované v DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (Gibco, Beijing). Kultúry boli udržiavané pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére s 5% CO _2.

malé interferujúce RNA, extrakcia RNA a analýza v reálnom čase

Bunky boli schovať do 6 jamkové doštičky potom transfekovány 50 nM siRNA oligo zameraný na ľudské Twist 1 (Dharmacon, USA). Sírne molekula špecifická pre zelený fluorescenčný proteín (GFP), bola použitá ako negatívna kontrola. Celkové RNA boli extrahované z buniek TRIzolu činidlá, a reverzné transkripcie boli vykonané Takara RNA PCR kit (Takara, Čína) podľa protokolu výrobcu. Za účelom kvantifikácie prepisy záujmových génov, real-time PCR bola vykonaná za použitia SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japonsko) o Light Cycler 480 (Roche, Švajčiarsko).

Prechodné transfekcia luciferázy a testy

promótor Human FOXM1 bol amplifikovaný zo šablóny v ľudskej genómovej DNA a vloží do pGL4.15 základnej vektora (Promega). Mutant Twist1 väzba motív bol generovaný za použitia mutagenézy PCR kitu (Toyobo) s primerom (mutačné miesta podčiarknuté): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'a reverznej primer doplnkom. Všetky prechodné transfekcia boli vykonané Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Šanghaj), podľa inštrukcií výrobcu. Pre luciferázové reportéri test, bunky boli nasadené na 24jamkové doštičky a transfekovány s uvedenými plazmidy. 48 hodín po transfekciu, Luciferase aktivity sa merali za použitia duálneho Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-Imunoprecipitácia

Bunky boli zozbierané, resuspendované v lyzačním pufri obsahujúcom 50 mM Tris HCl (pH 3 /7-5 /7), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) a inhibítory proteázy. Lyzáty boli inkubované s 2,5 ug p300 alebo IgG cez noc pri teplote 4 ° C. Pridá proteínové guličky A za ďalšie 4 hodiny. Guličky, ktoré obsahujú imunitný komplexy boli premyté 1 ml ľadovo chladného lyzačného pufra štyrikrát. Zrazeniny boli denaturovaný v géle Laemmli (zaťaženie) pufri pri teplote 95 ° C počas 10 minút.

Western Blot

Bunky boli zozbierané trypsinizací, lyžovanie v Laemmliho pufri, denaturované počas 10 minút pri teplote 80 ° C C, a rozdelené na SDS /PAGE géloch. Po-chémiou boli membrány blokované v PBS /0,1% Tween-20 s 7,5% netučného sušeného mlieka, a primárne protilátky boli inkubované v PBS /0,1% Tween-20 s 0,1% -5% netučného sušeného mlieka. Protilátky namierené proti Twist 1, FoxM1 boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-P300 a GAPDH protilátky boli získané od abca Company (USA). Anti-p21, p27, cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2, cyklin E a E-cadherinu protilátky boli od Cellsignaling (USA).

chromatínu Imunoprecipitácia (Chip) test

chromatínu immunoprecipitation ( Chip) testovacie súpravy boli použité (Upstate, USA). V stručnosti, bunky boli fixované 1% formaldehydu a ďalej sa spracovávajú za použitia čipu, skúšobné súpravy je Upstate. Rozpustná chromatínu bol imunoprecipitována s anti-Twist 1 a IgG protilátok. Po čistení sa vzorky DNA boli kvantifikované pomocou kvantitatívnej real-time PCR s použitím primerov štýlov ako proximálna oblasť ľudského FoxM1 promótorom.

Štatistická analýza

Všetky dáta sú uvádzané ako stredná ± SEM. Štatistické rozdiely boli stanovené pomocou dvojstranného t-testu. Štatistická významnosť je zobrazený ako * (P 0,05), ** (P < 0,01) alebo *** (P < 0,001).

Výsledky

Vplyv Twist1 na žalúdočné proliferáciu nádorových buniek

Na prvý, aby preskúmala funkčné úlohu Twist 1 v bunkovej proliferácii, my transdukovány NCI-N87 alebo AGS bunky s adenovírusy, ktoré obsahujú Twist 1 alebo prázdnym vektorom (obrázok 1a a 1b). V súlade s predchádzajúcimi štúdiami expresie E-cadherinu, biomarker EMT postupu [4,5], sa down-regulované Twist 1 nadmernej expresie (obr S1A-1B). Okrem toho, Twist 1 nadmerná expresia viedla k výraznému zvýšeniu počtu buniek všetkých testovaných buniek (obr 1C a 1D). Dôsledne, bromdeoxyuridin (BrdU) Analýza tiež potvrdila, že nadmerná expresia Twist 1 podporoval proliferáciu buniek (Obr 1E a 1F). Okrem toho, Twist 1 exprimujúce bunky mali významne nižšie percento buniek v G0 /G1 fáze a zvyšuje percento buniek v S fáze, v porovnaní s prázdnym vektorom transfekované bunky (obrázok 1G-1 H).

Ďalší , NCI-N87 alebo AGS bunky boli transfekovány malé interferujúce RNA (siRNA), v ktorých Twist 1. siRNA oligo ukázalo sa účinné Twist 1 vyraďujúce v týchto dvoch bunkách, v porovnaní s GFP siRNA-transdukovaných buniek (Obrázok 2A-2D). V dôsledku toho, down-regulácia Twist 1 viedla k výraznému poklesu počtu buniek a proliferáciu v týchto bunkách (obrázok 2E-2H). Navyše, umlčanie Twist 1 významne zvýšilo percento buniek v G0 /G1 fáze a znížilo percento buniek v S-fáze (obr 2I-2J). A to najmä v porovnaní sme proliferačnú aktivitu NCI-N87 a AGS buniek s alebo bez transfekciu prázdnym vektorom GFP alebo siRNA. Naše výsledky naznačujú, že ani prázdny vektor alebo GFP siRNA vplyv na bunkovej proliferácie aktivitu (obr S2A). Okrem toho, že rast schopnosť buniek exprimujúcich vyššie hladiny Twist 1 (NCI-N87 a AGS bunky) je relatívne vyššia než ostatné (HGC-27 a MGC80-3 buniek) (obr S2C). Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú, že Twist 1 by mohlo byť významnou pozitívna regulácia žalúdočné proliferácie rakovinových buniek.

Twist1 ovplyvňuje expresiu regulátorov bunkového cyklu

Ako Twist 1 podporoval proliferáciu buniek, sme sa zaoberali jej funkcie na expresiu génov, ktoré regulujú G1 /s prechod, vrátane CDK inhibítorov p21 ^{Cip1, p27 Kip1, regulátor CDK cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 a cyklin E. Výsledky z reálnom time PCR a western blotting analýza v NCI-N87 buniek navrhol, že expresia p21 Cip1, p27 Kip1 boli downregulated zatiaľ čo cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 a cyklin E hladiny boli up-regulované v Twist 1-transfekciou buniek v porovnaní s prázdnym vektorom transfekované bunky (obrázok 3A-3B). Podobné výsledky boli tiež pozorované v AGS bunke (3C-3D), ďalej potvrdzuje, že Twist 1 môže mať vplyv na proliferáciu buniek karcinómu žalúdka. Dôsledne, porazený Twist 1 zvýšil p21 Cip1 a p27 Kip1 výraz, zatiaľ čo znížená cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 a cyklín E expresie v NCI-N87 a AGS buniek (Obrázok 4A-4D).}

Twist 1 priamo zameriava na transkripčný faktor FoxM1 do buniek karcinómu žalúdka

Predchádzajúce štúdie ukázali, že niektoré transkripčné faktory môžu regulovať rad génov súvisiacich s bunkovým cyklom, vrátane p21 ^{Cip1, p27 Kip1 a cyklín B1. Preto sme analyzovali potenciálny transkripčné faktory, ktoré sa podieľajú na regulácii bunkovej proliferácie. Z piatich testovaných transkripčných faktorov, boli nájdené len FoxM1 byť významne zvýšená v NCI-N87 buniek s nadmernou expresiou Twist 1 (obrázok 5A-5B). Indukcia FoxM1 sa pozoroval aj u AGS bunkách (obrázok 5C-5D). Okrem toho FoxM1 expresie bola znížená v týchto bunkových vyčerpanom Twist 1 (obrázok 6A-6D), čo naznačuje, že FoxM1 by mohol byť terčom Twist 1.}

Twist 1 upregulates FoxM1 vyjadrenie prostredníctvom náboru P300

Ďalej sme sa zamerali na molekulárnej mechanizmus Twist 1 regulácia FoxM1 transkripcie. Sekvenčné analýza ukázala, že oblasť promotora génu ľudského FoxM1 obsahoval potenciálny Twist 1 väzobné miesto (medzi -357 a -352 bp) (obrázok 7A). Luciferázy správa test ukázal, že transkripčný aktivitu promótorom FoxM1 divokého typu bol dramaticky up-regulovaná pomocou Twist 1, vzhľadom k tomu, transkripčný aktivita bola zrušená v promótorom nesúci mutáciu v Twist-1 väzobných miest (obrázok 7B). Okrem toho, Chip testy ukázali, že Twist 1 mohol jednoznačne viazať na FoxM1 promótor (obrázok 7c). Ak chcete zistiť, či je potrebné indukcia FoxM1 tým Twist 1 pre svoj proliferačnej efekt, sme vykonávali experimenty s FoxM1 Knockdown pomocou siRNA oligonukleotidov v NCI-N87 buniek (Obrázok S3A-S3B). V dôsledku toho je siRNA zachránil bunky z proliferačnej účinok Twist 1 nadmernej expresie (obr S3C). Dôsledne, funkcia Twist 1 na úrovni expresie regulátorov bunkového cyklu boli tiež zvrátiť FoxM1 siRNA oligonukleotidov (obr S3D), čo naznačuje, že FoxM1 je vyžadovaná pre rolí Twist 1 v rakovinových bunkách žalúdka.

Ako transkripčný faktor, Twist 1 môže prijímať koaktivátory na reguláciu expresie cieľového génu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že p300 by mohli pôsobiť ako koaktivátoru pre mnoho transkripčných faktorov. Preto sme sa skúmalo, či P300 môže byť koaktivátor pre Twist 1 regulácia FoxM1 prejavu. Ako je znázornené na obrázku 7D, Twist 1 mohli byť v interakcii s p300 podľa coimmunoprecipitation. Transkripční aktivitu promótorom FoxM1 sa ďalej stimulovaná ko-transfekciu P300 a Twist 1 (obr 7e). Navyše sme ďalej zrušený P300 expresie pomocou siRNA oligonukleotidov v NCI-N87 buniek (Obrázok 7f). Ako sa dalo očakávať, Twist 1 indukovaná FoxM1 expresie bola výrazne zaoblené tým tichom p300 (obr 7G-7). Vyššie uvedené údaje ukázali, že Twist 1 stimulovaná FoxM1 výraz prostredníctvom náboru transkripčných koaktivátoru komplexov vrátane p300.

Diskusia

V súčasnej štúdii, naše výsledky naznačujú, Twist 1 ako kritický regulátor žalúdočných progresie rakoviny. To je navrhnuté niekoľko radov dôkazov. Po prvé, Twist 1 nadmerná expresia podporuje, zatiaľ čo jej nedostatok inhibuje proliferáciu buniek, ako je ukázané pomocou BrdU a analýzy bunkového cyklu. Po druhé, Twist 1 ovplyvňuje gény expresiu modulátory bunkového cyklu, vrátane CDK inhibítory p21Cip1, p27Kip1, CDK regulátor cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 a cyklin E. Po tretie, Twist 1 priamo zvyšuje aktiváciu FoxM1 expresie na transkripčný úrovni, a to prostredníctvom nábor P300. Navyše, knockdown endogénneho FoxM1 expresie zoslabuje proliferačnej účinok Twist 1, čo naznačuje, že je nevyhnutné, aby FoxM1 rolí Twist 1 vo buniek karcinómu žalúdka.

U dospelých, Twist 1 je predovšetkým vyjadrená v progenitorových buniek vrátane osteoblastov, Myogénne, odontoblastic a myelomonocytární línií, udržanie ich nediferencovaného stavu [17]. Okrem toho, Twist1 je tiež dôležitým regulátorom mnohých ďalších biologických procesov, vrátane vývoja mezenchýme a hnedej metabolizmu tukov. Napríklad, Twist1 sa predpokladá, že inhibuje diferenciáciu osteoblastov tým, že negatívne regulačné Runx2 [17]. Okrem toho, Twist-1 je selektívne exprimovaný v tukovom tkanive, interaguje s PGC-1 a, k potlačeniu mitochondriálnej metabolizmus a odpájaní. V dôsledku toho, transgénne myši s nadmernou expresiou Twist-1 v tukovom tkanive sú náchylné k vysokým obsahom tuku-diétou indukovanej obezity, zatiaľ čo jej heterozygotnou knockout myší sú odolné proti obezite [18]. Okrem toho, Twist 1 jadrová expresie bol tiež pozorovaný u non-nerakovinové epitelu, čo naznačuje, že Twist 1 môže mať fyziologickú úlohu v normálnych bunkách [19]. Následné štúdie preukázali, že Twist 1 expresie koreluje so silnými invazívne, ako aj zlou prognózou u rakoviny epitelu. V karcinómu žalúdka, nedávna správa ukázala, nadmernú expresiu génu Twist 1 je častejšia u karcinómu tkanivách difúznej typu s vysokou N-cadherin génovej expresie [20]. Avšak, žiadna definitívne výsledky ukázali Twist podporuje šírenie rakoviny žalúdka. Naše zistenia navrhovanej Twist pravdepodobne podporoval žalúdočné proliferáciu nádorových buniek, za použitia testov BrdU do obchodného registra. Okrem toho, FoxM1 bol prvýkrát identifikovaný ako nový transkripčný cieľ Twist 1.

FoxM1 viaže promotorové oblasti s preferencií pre [TAAACA] rozpoznávacie sekvencie konsenzu, aj keď s nižšou afinitou ako ostatné forkhead proteíny [21]. Jeho expresia je obmedzená na proliferujúcich buniek, a vylúčené z kľudových a terminálne diferencovaných buniek. Riadi expresiu génov potrebných pre G1 /S a G2 /M prechodu a je nevyhnutný pre vstup a mitotickej progresii, zabezpečiť zachovanie stability chromozóme [22,23]. Amplifikácia FoxM1 génu bola opísaná u mnohých nádorov, ako je karcinóm pankreasu, rakoviny prsníka a hepatocelulárneho karcinómu [24-27]. V karcinómu žalúdka, FoxM1 expresie je up-regulovaná, a jeho inhibícia vedie k bunkovej starnutie, ktorý je aspoň čiastočne závislá na p27 kip1 [28,29]. Navyše k jeho pozitívnu úlohu v proliferácii buniek, FoxM1 bolo preukázané, že hrajú úlohu v iných procesoch súvisiacich s rakovinou, ako je invázia a metastáz [30]. Jeho expresia hladiny koreluje so zlou prognózou a metastáz u rôznych nádorov, vrátane karcinómu žalúdka [31], čo naznačuje možnosť použitia FoxM1 ako prognózy a /alebo diagnózy marker. Vzaté dohromady, FoxM1 je sľubným a atraktívny cieľ pre terapiu rakoviny. Preto je dôležité pochopiť, ako sa FoxM1 regulovaná s cieľom navrhnúť lepšie terapeutické prístupy.

FoxM1 expresie je prísne regulovaná a to ako na úrovni mRNA a bielkovín. Jeho množstvo sa zvyšuje pri vstupe do S-fázy, vrcholy počas G2 a M, a je degradovaná počas mitotického výstupu. Podobne, jeho transkripčný aktivita je prísne regulovaná v priebehu bunkového cyklu o viac miestach fosforylácie rôznych kináz a fosfatáz jej protichodných, dosahuje svoju maximálnu aktivitu v G2 fáze bunkového cyklu [32]. V poslednej dobe bolo publikované, že FoxM1 výraz môže tiež byť modulovaná mikroRNA. FoxM1 bol identifikovaný ako priamy cieľ MIR-134, ktorého hladiny sa inverzne koreluje s invazívnym potenciálu niektorých NSCLC buniek [33]. Okrem toho FoxM1 je tiež potlačená Mir-370 v rakovinových bunkách žalúdku [29], čo naznačuje, že sú potrebné ďalšie štúdie, aby vyšetrila, či Twist 1 mohli spolupracovať týchto regulačných dráh.

Na záver sme sa tu ukazuje, že Twist 1 nadmerná expresia vedie k významnému up-regulácia FoxM1, ktorý hrá kľúčovú úlohu v progresii bunkového cyklu v rakovinových bunkách žalúdka. Na rozdiel od toho Vyradenie Twist 1 znižuje FoxM1 expresie, čo naznačuje, že by mohol byť FoxM1 priamym transkripčný cieľ Twist 1. Ďalej ukazujú, že Twist 1 mohla viazať na oblasti promotora FoxM1, a následne získavať p300 pre indukciu FoxM1 mRNA transkripciu. Preto sú naše výsledky odhaliť predchádzajúce nezistenej Twist 1 /FoxM1 regulačné dráhy, čo môže pomôcť pochopiť mechanizmy žalúdočné šírenie rakoviny.

Podporné informácie
Obrázok S1.
(AB) mRNA a množstva bielkoviny E-cadherinu v NCI-N87 (A) a AGS (B) bunky transfekovány adenovírusy vyjadrujúce prázdny vektor (EV) alebo Twist 1.
DOI: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001
(TIF)
obr S2.
(A-B) Bunková proliferácia potenciál (BrdU) bola stanovená v NCI-N87 (A) alebo AGS (B) buniek bez alebo s transfekciu prázdnym vektorom (EV) alebo GFP siRNA. (C) Endogénne Twist 1 expresie bola stanovená Western blot v štyroch buniek karcinómu žalúdka (NCI-N87, AGS, HGC-27 a MGC80-3). Rastová krivka štyroch bunkových línií bola meraná
doi :. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002
(TIF)
Obrázok S3.

(A-B) mRNA (A) a proteínu (B) hladiny FoxM1 v NCI-N87 buniek transfekciou siRNA oligo proti NCI-N87 alebo negatívne kontrolou (Ctrl). (C) Bunková proliferácia sa merala aktivita pomocou BrdU testy in NCI-N87 buniek. Bunky boli vopred transfekovány siRNA oligo po dobu 24 hodín a potom prenesené prázdnym vektorom (EV) alebo Twist 1 na ďalších 24 hodín. Hladiny
(D) mRNA p21, p27, cyklin B1, cyklin D1, cyklin D2 a cyklin E boli stanovené pomocou real-time PCR v NCI-N87 buniek. Bunky boli vopred transfekovány siRNA oligo po dobu 24 hodín, a potom prenesené prázdnym vektorom (EV) alebo Twist 1 pre ďalších 24 hodín
doi :. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003
(TIF)

• Ploche ONE: c-Met ako prognostický marker u rakoviny žalúdka: systematického prehľadu a metaanalýzy
• Ploche ONE: zlé prognóze fosfatázy Regenerácia pečene 3 výraz v rakoviny žalúdka: metaanalýza