Ploche ONE: Vedzte, Román Predpokladané nádorového supresor, Potláča rast a tumorigeničnosti na žalúdočné rakovinu

Abstraktné

Vezatin (viezť), čo je adherens križovatky transmembránový proteín, bol identifikovaný ako domnelého nádorového supresor v našej predchádzajúcej štúdii. Avšak role viezť v vzniku nádorov stále uniká. Naším cieľom bolo objasniť jej epigenetické regulácie a biologických funkcií v rakoviny žalúdka. V tejto štúdii sme sa ukázať, že hladina expresie vedzte je zapojený do lymfatické metastázy, hĺbka rakoviny a invázie TNM fázu 104 pacientov s karcinómom žalúdka. Bisulfát sekvenovania PCR (BSP), metódy ukazujú, že Vedzte bola hypermethylated v tkanivách a zodpovedajúcim krvi u pacientov s karcinómom žalúdka v porovnaní so zdravými kontrolami. Helicobacter pylori
( H. Pylori
) infekcie indukuje metylácii a umlčanie vedzte v bunkách GES-1. Obnovenie Vedzte expresiu v MKN-45 a NCI-N87 rakoviny žalúdka buniek potlačil rast, invázia a vzniku nádorov in vitro a in vivo
. Globálna analýza microarray bola použitá na analýzu molekulárnej podstaty biologických funkcií vedzte po transfekciu viezť v kombinácii s real-time PCR a chromatínu imunoprecipitačním testom. Spriahnutý s G proteínom receptor 56 (GPR56), rast buniek, bunkové delenie cyklu 42 (Cdc42), migrácia /invázia a transkripčný faktor 19 (TCF19), progresiu bunkového cyklu, boli považované za cieľové gény priamy viezť. TCF19, román terčom vedzte, bol funkčne overená. Nadmerná expresia TCF19 v MKN-45 bunkách zvyšuje priebeh bunkového cyklu a schopnosti rastu. Táto štúdia poskytuje nový pohľad na reguláciu génu vedzte, čo by mohlo predstavovať potenciálnu cieľ pre terapeutické stratégie proti rakovine

Citácia :. Miao R, Guo X, Zhi Q, Y Shi, Li L, Mao X, et al. (2013) vedzte, román Predpokladané nádorového supresor, Potláča rast a tumorigeničnosti na žalúdočné rakovinu. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko

prijatá: 1. apríla 2013; Prijaté: 01.08.2013; Uverejnené: 17. septembra 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená čiastočne granty z Národného včech Science Foundation Číny (81101858), Natural Science Foundation z provincie Šan-tung v Číne (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key výskumný projekt z Shandong Science and Technology komisie (2011GGB14158, 2007H2071), mladistvý Science Foundation z provincie Šan-tung v Číne (BS2010YY060). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

žalúdka rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu mužskej súvisiacich a treťou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu u žien súvisiace s celosvetovo [1]. To je hlavný problém verejného zdravia na celom svete [2]. V Číne existuje 400.000 nových prípadov rakoviny žalúdka a 300.000 úmrtí ročne. Mnoho prípadov, ktorí trpia rakovinou žalúdka stratili liečebnú možnosť extrémne zlou prognózou [3]. Z tohto dôvodu, vývoj nových a účinných terapeutických metód, je nevyhnutné znížiť úmrtnosť na rakovinu žalúdka. Je známe, že patogenéza žalúdočných karcinómov je multifaktoriálne, ktorý zahŕňa genetické predispozície a faktory životného prostredia. Existuje celý rad genetických striedanie vrátane tumor supresorových génov, onkogény, bunkových adhéznych molekúl a rastových faktorov [4].

Hoci molekulárne mechanizmy žalúdočné karcinogenézy zostávajú nejasné, epigenetické umlčanie génov nádorových súvisiacich s promótorom hypermetylace v poslednej dobe sa objavil ako dôležitý mechanizmus vzniku nádorov. Profil promótor hypermetylace sa líši v každom type rakoviny a v rámci každého génu, poskytujúca nádoru Typ s a génovo špecifických hypermetylace profily, ktoré môžu zahŕňať v zodpovedajúcej molekulárnej mechanizmus vzniku nádorov. Identifikáciu nového génu zameraný promótorom hypermetylace môže poskytnúť pohľad na mechanizmus pre inaktiváciu dráh tumor potláčajúce a je dôležitý pre identifikáciu nádorových markerov v karcinómu žalúdka [5,6].

V poslednej dobe sme identifikovali, čo adherens križovatkách transmembránový proteín, vedzte ako kandidát tumor-supresorového génu. Naším cieľom bolo objasniť epigenetické regulácie a biologických funkcií vedzte v rakoviny žalúdka. Vedzte, všadeprítomný integrálne proteín, je nepriamo spojená s E-cadherin-katenin komplexu a aktinového cytoskeletu [7,8]. Jeho funkcie boli hlavne boli preskúmané v epitelové bunky. Strata viezť je postupne poškodzuje embryonálneho vývoja [9,10], a vedzte je rozhodujúci pre zachovanie integrity bunkových spojov pri dlhodobom mechanickom namáhaní vyskytujúce sa na úrovni vnútorného ucha vláskových buniek v reakcii na zvuk. Okrem toho je vnútorné ucho špecifické vedzte podmienenej zneplatnenie vedie k postupnej hluchote [7]. Vedzte je vysoko exprimovaný v mozgu, [8,11]. Vedzte je obohatený dendritické tŕne v myši hippokampu neurónov. Použitie viezť knock-down a podmienený knockout pred (D6cre) alebo až po (CamKIIαcre) narodenia, vedzte reguluje chrbtice morfológiu. Morfologické zmeny nie sú spojené s nepriechodnými synaptických kontaktov, ale postsynaptické vedzte hrá kritickú úlohu v morfologicko-funkčné zrenie excitačných postsynaptických prvky [12].

Inaktivácia génu vedzte bol identifikovaný v karcinómu žalúdka, a metylácie CPG ostrovov v promotorové oblasti génu viezť prispievať k jeho inaktiváciu, ako je stanovené podľa predchádzajúcej štúdie vykonanej našom laboratóriu [13]. Mechanizmus metylácie a presná úloha vedzte v rozvoju rakoviny žalúdka, sú v súčasnej dobe známe. doteraz boli identifikované cieľové gény a súvisiace dráhy viezť. V tejto štúdii sme systematicky analyzovali mechanizmus metylácie a metylačného statusu promótorom génu viezť. Tiež sme analyzovali jeho funkčné vlastnosti po rozpustení vedzte výraze in vitro a in vivo
.

Materiály a metódy

Bunkové línie a tkanivové vzorky

MKN -45, MKN-28, SGC-7901 je zvečnený ľudskej žalúdočnej sliznice bunkové línie GES-1 (za predpokladu inštitútom zažívacieho chirurgia Ruijin nemocnici pridružená k Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] a ľudskej pupočnej žily endoteliálne bunky (HUVEC) boli zachované v našom ústave. Žalúdočné nádorových bunkových línií SNU-1 a NCI-N87 bunky boli získané z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). V stručnosti, bunky boli pestované v RPMI 1640 doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra a 2 mM L-glutamínu. Bunky boli udržiavané pri 37 ° C v prítomnosti 5% CO _2.

Primárne nádor žalúdka a normálne žalúdočnej sliznice boli odobraté z oboch bežnej liečebné chirurgie alebo gastrointestinálne endoskopie na našom pracovisku. Zvyšok bol H. pylori
stav infekcie bola stanovená na základe rýchleho ureasového testu, ako bolo opísané skôr [18].

Ethics vyhlásenie

písomný informovaný súhlas v štúdii bol získaný od všetkých účastníkov. 4-week-old male Balb /c nahých myší boli zakúpené z pokusného zvieraťa Centra čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína) a udržiavané v Animal Laboratory Center zemskej nemocnice pridružený k Shandong University (Jinan, Čína) na 12/12 h svetlo /tma (svetlo vystúpiť na 19: 00) s potravou a vodou k dispozícii ad libitum. Pokusy na zvieratách boli schválené používanie a ošetrovanie výboru Institutional Animal na zemskej nemocnice pridružený k Shandong University (Číslo povolenia: SHANS87492). Protokol štúdie bol schválený etickou komisiou zemskej nemocnice pridružený k Shandong University.

Spracovanie Laser mikrodisekcii pre tkanivá a bunky

Tkanivá boli odstránené čo najskôr po resekcii a upevniť formol, vložené do parafínu a nakrájané na 8-um silné oddiely pre hematoxylínom a eosínu (H &E) farbenie. Všetky tkanivá boli vyšetrené histologicky a skúsení patológovia potvrdil diagnózy. Časť každej vzorky bol zakotvený v Tissue-Tek ^{® Optimálna teplota rezu ™ (OCT) zlúčenina médium (VWR Scientific Products, San Diego, CA, USA) v kryostatu a zapadne zmrazené pre mikrodisekcii.}

Bunky a šmýkačky nazmrz- boli zafarbené tesne predtým, ako laser zachytenie mikrodisekcii (LCM) na ľade. Stručne povedané, úseky boli laser microdissected pomocou LM200 systému (Olympus, Japan /Arcturus Engineering Inc., USA). Oblasti záujmu boli vybrané na základe mikroskopického vedením, a pokrytý etylén vinyl termoplastického filmu (EVA) namontované na opticky priehľadné viečko. Infračervený laser bol aktivovaný stlačením tlačidla, ktorý taví film priamo nad cieľovým bunkám. Táto tavenina spôsobil väzby tvoria medzi bunkami a prenosové fólie, ktorá bola silnejšia ako väzba medzi bunkami a sklíčka. Parametre použité pre LCM súčasťou priemer laserového 7,5 um, výkon lasera 50-60 mW. Päť tisíc laserového pulzu výboje na vzorke boli použité na "zachytenie" približne 10 000 morfologicky bunky z každého prípadu. Každá populácia sa odhaduje na viac ako 95% "homogénna", ako je stanovené mikroskopickým vizualizáciu zachytených buniek. Viečka sa zajatými bunky potom boli namontované na 0,5 ml microcentrifage rúrok. Po mikrodisekcii, DNA, RNA alebo proteínov môžu byť získané z alikvótnych častí microdissected vzoriek.

Metylácia analýza

genómovej DNA získané z microdissected bunkových línií karcinómu žalúdka tkanív a plazmy (0,2 ml ) sa čistí za použitia DNAzol (Invitrogen). Purifikovaná DNA sa zmieša hydrogensiričitanovú sodným (Sigma, Phoenix, USA) a potom sa analyzujú BSP alebo špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (MSP), ako bolo opísané skôr [13,15]. Amplifikovanej bisulfitová PCR produkty boli subklonovány do vektora TA systému (Promega) podľa inštrukcií výrobcu. Sekvenovania DNA bolo vykonané na troch jednotlivých klonov (Sangong). PCR produkty boli potvrdené pomocou elektroforézy v agarosovém gélu a vizualizované za použitia farbením etidiumbromidom. Primery použité sú zhrnuté v tabuľke S1.

elektrónového mikroskopu pozorovanie

H. pylori
kmene NCTC11637 (obaja CagA- a VacApositive) boli poskytnuté profesora Guo z Ústavu lekárskej mikrobiológie a parazitológie, Institutes of lekárskych vied, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H. pylori
kmene boli kultivované rutinne po dobu 72 h na Columbia Agar Base (BIOMERIEUX, Francúzsko) s 5% ovčej krvi v zmiešanom vzduchu, ktoré obsahujú 10% CO _{2, 5% O2 a 85% N 2 na 37 ° C. Potom sme previedli H. pylori
do kvapalného prostredia obsahujúceho mozgu Heart Infusion (BD, USA), 10% ovčej krvi, a rovnaké antibiotiká, ktorá bola použitá Columbia Agar Base. Kvapalné prostredie sa trepe v trepačke (Forma Scientific, USA) s konštantnou rýchlosťou otáčania 120 otáčok za minútu. H. pylori
sa počítali za použitia spektrofotometra (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japonsko) a premyté sterilným PBS (pH 7,4, 5000 otáčok za minútu, 10 minút) pred použitím. GES-1 bunky (4 x 10 ^{5) boli pestované do zhlukovania na sklenený kryt vkĺzne do šiestich jamkami, a potom boli bunky GES-1 infikované H. pylori
pri multiplicitě infekcie (MOI) 100: 1. Po inkubácii po dobu 24 hodín, morfologické zmeny GES-1 buniek boli pozorované pomocou H-800 transmisného elektrónového mikroskopu.}}

v reálnom čase QRT-PCR analýza

bola získaná čistená celkovej RNA z microdissected buniek, celková RNA bola extrahovaná za použitia roztoku TRIzolu. Reverzný transkripcie (RT) sa uskutočňuje v 20-ul reakcii podľa odporúčania výrobcu (Qiagen). V reálnom čase QRT-PCR analýzy boli vykonané s použitím primérov uvedených v tabuľke S1. Úroveň expresie transkriptov bola stanovená kvantifikáciou intenzity PCR produktu normalizovať na glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) expresiu. Kvantitatívne meranie hladín mRNA sa vykonáva za použitia ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Tieto dáta boli analyzované za použitia porovnávacej metódy Ct.

Western blotting

Celkový proteín bol extrahovaný z buniek microdissected. bol použitý signál extrakčný pufor proteín 1 systém (430-7608-MSDS) Bio-Rad Corporation pre extrakciu proteínov v našich experimentoch a koncentrácia bola meraná pomocou DC proteín-teste spôsobom podľa Bradford (Bio-Rad). Celkom 100 ug proteínu v každej vzorke boli separované pomocou 10% SDS-PAGE gélu a prenesené do rovnovážneho stavu polyvinylidendifluoridovou membránu (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) Proteíny boli detekované zvýšenej chemiluminiscencie (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) po inkubácii s špecifickou primárnou protilátkou vedzte (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), CAG A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), a IRX5 (1: 2000) pri teplote 4 ° C cez noc a potom sa sekundárnou protilátkou. Úrovne proteínové boli normalizované na celkový GAPDH za použitia monoklonálnej protilátky anti-GAPDH (Sigma), ako bolo opísané skôr [15].

Konštrukcia expresného vektora pre viezť a TCF19

viezť a TCF19 nadmerná expresia vektora pEGFP -N 1 viezť a pEGFP-N1-TCF19 boli konštruované pomocou prekrytia PCR alebo PCR metódy, v danom poradí, a priméry použité pre dva vektory sú zhrnuté v tabuľke S1. PCR produkty boli potvrdené priamym sekvenovaním DNA a klonované do cicavčieho expresného vektora pEGFP-N1 ako bolo opísané skôr [15]. MKN-45 a NCI-N87 rakoviny žalúdka bunkové línie boli použité na štúdium nadexpresiou. Získali sme stabilne transfekované klonov G418 výberu (Promega). Stabilná transfekcia z pEGFP-N1 prázdnym vektorom bol použitý ako kontrola. Pre transfekciu sa komplexy Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) a jeden z plazmidov uvedených vyššie bola pripravená podľa návodu výrobcu, a tieto komplexy sa priamo zmieša s bunkami v 24-jamkové dosky pre kultiváciu buniek pri hustote 4 × 10 ^{4 buniek na jamku. Miera viezť alebo TCF19 expresie po transfekciu bola testovaná pomocou real-time PCR.}

invázie, migrácia a testy tvorby endotelových trubice

invázie buniek, migrácie a testy tvorby trubka endoteliálny boli vykonané s použitím MKCH -45 a NCI-N87 buniek. Bunková kultúra bola vykonaná v transwell komorách (Corning, NY, USA). Pre test invázie, vložka membrány boli potiahnuté zriedeným Matrigel (San Jose, CA, USA). Bunky (1 x 10 ^{5) boli pridané do hornej komory a boli kultivované po dobu 48 hodín. Pre test migrácie, že vložka membrány potiahnuté Matrigelem, ale boli kultivované za rovnakých podmienok. Nakoniec sa vložka membrány boli narezané a zafarbené kryštálovou violeťou (0,04% vo vode, 100 ml), a migrované bunky boli spočítané pod inverzným mikroskopom a boli vyfotografované}

in vitro angiogenézu bola hodnotená za použitia. endoteliálny tvorba trubice testovacia súprava (San Diego, CA, USA). Stručne povedané, každej jamky prechilled 96-jamkových kultivačných doštičkách bol potiahnutý tenkou vrstvou ECM gélu. Bunky HUVEC boli resuspendované v supernatante získaných z transfekciou buniek. Bunky HUVEC (2 x 10 ^{4 buniek /jamku) boli pridané do polymerizovaný ECM gélu 300 ml supernatantu. Po 18 hodinách inkubácie, schopnosť tvorenia trubica bola hodnotená určením rúrkového číslo, trubkový dĺžka a počet rúrkových pretínajúcimi uzlov v piatich náhodných polí s použitím programu Image Pro Plus (Media softvér kybernetika Inc., Bethesda, MD, USA) podľa na Mirshahi metódou [19].}

rast buniek a mäkký agar tvorba kolónií test

žalúdočné rakovinové bunky (2 x 10 ^{3 buniek) boli inkubované so 100 ul kultivačného média na 96 -multiwell dosky pre jeden deň pri teplote 37 ° C v 5% CO _{2. Bunky boli transfekovány plazmidmi pre 24, 48, 72, 96 a 120 hodín. počet buniek bola hodnotená pomocou počítania bunka kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japonsko). Stručne povedané, CCK-8 (10 ul) sa pridá do každej jamky. Po 1 h inkubácie pri 37 ° C, absorbancia pri 450 nm sa merala za použitia čítačky doštičiek ARVO MX (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Počet buniek sa stanoví relatívnej absorbancie pri vlnovej dĺžke 450 nm.}}

žalúdočné rakovinové bunky boli trypsinizovány na jednobunkové suspenzie 3 x 10 ^{3 bunky a potom boli umiestnené v šiestich jamkami v kompletnej kultivačné médium, obsahujúce 0,3% agaru navrstvený na vrchol vrstvy 0,6% agaru. Doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C v prítomnosti 5% CO _{2 po dobu 16 dní. Kolónie, ktoré obsahujú aspoň 50 buniek boli hodnotené. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka piatich náhodne ryhovaných oblastiach.}}

Rast nádoru u nahých myší

buniek (1 x 10 ^{6 buniek v 100 ml), z nádorových buniek línia prenesené prázdnym vektorom alebo vedzte expresného vektora boli odobraté a vrúbľovať subkutánne do pravého boku regiónoch 4 týždne starí samci Balb /c nahých myší (čínskej akadémie vied, Shanghai, Čína). Nádorové uzliny boli merané každé 4 dni s strmeňmi. Myši boli usmrtené po 1 mesiaci. boli vypočítané rastové krivky nádoru a ceny inhibícia rastu. Dve myši boli použité pre experimentálne a kontrolnej skupiny, a tri nezávislé experimenty boli vykonávané ako bolo opísané skôr [15,16].}

globálna analýza cDNA microarray a cieľový gén overenie

Upravená celková RNA bola získané z microdissected buniek. bol použitý celý ľudský genóm oligo microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Po hybridizácii a premytí sa microarray sklíčka boli skenované pomocou microarray skener Agilent DNA. Výsledné textové súbory extrahované z Agilent Feature Extraction Software (verzia 9.5.3) boli importované do softvéru Agilent GeneSpring GX (verzia 7.3) pre ďalšiu analýzu. Rozdielne exprimované gény boli identifikované pomocou skríningu fold-change. Pre overenie cieľového génu bol použitý PCR v reálnom čase a chromatínu, Imunoprecipitácia testu. Primery pre cieľových génov sú uvedené v tabuľke S1.

prietokovej cytometrie bunkového cyklu

Jeden deň pred transfekcia, 1 × 10 ^{6 bunky MKN-45 bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových kultivačných doštičkách bez antibiotík. Bunky boli transfekovány prázdnym vektorom alebo TCF19 expresného vektora. Štyridsať osem hodín po transfekciu boli bunky zozbierané a fixované v 70% etanolu pri teplote -20 ° C cez noc, a potom farbené 250 ug /ml propidium jodidu (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNázy A (Sigma-Aldrich) a 5 mmol /l EDTA v PBS (pH 7,4) počas 30 minút. Analýza bunkového cyklu bola vykonaná pomocou FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softvéru SPSS15.0 (SPSS Inc., USA). Údaje sú vyjadrené ako stredná hodnota ± štandardná odchýlka z aspoň troch oddelených pokusov. Korelácia medzi Vedzte expresiou v nádoroch a patologickým premenné bola vypočítaná s rank testu Kruskal-Wallis a test Mann-Whitney U. Rozdiely medzi skupinami boli analyzované pomocou t test a Chi-kvadrát test. Hodnota p Hotel < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

Výsledky

Vzťah viezť expresných hladín a klinicko-faktorov u pacientov s rakovinou žalúdka

Skúmali sme vzťah medzi úrovňami expresie Vedzte vo 104 párového žalúdočných rakovinové tkanivá a klinicko-patologické faktory u pacientov s karcinómom žalúdka. Zistili sme, že hladina expresie viezť významne spojená s lymfatické metastázy, hĺbka rakoviny a invázie TNM fáze (tabuľka 1, P Hotel &0,05). Avšak, hladiny expresie viezť neboli spojené s pohlavie, vek, veľkosť nádoru, bunkovú diferenciáciou, hrubý vzhľad, miesto nádoru a vzdialené metastázy.
Faktory
No. pacientov
Stredná expresiu VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor Veľkosť < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site z tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth rakoviny invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5.41 distálnej metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Vzťah medzi úrovňami expresie vedzte v nádorových tkanivách a klinicko faktory u pacientov s rakovinou žalúdka.
analyzovali sme vzťah medzi úrovňami expresie vedzte v rakovinových tkanivách a klinicko-faktorov vo vzorkách karcinómu žalúdka v porovnaní priľahlú normálne tkanív (n = 104). Zistili sme, že hladina expresie viezť významne spojená s lymfatické metastázy, hĺbka rakoviny a invázie TNM fáze (tabuľka 1, P Hotel &0,05). Avšak, hladiny expresie viezť neboli spojené s pohlavie, vek, veľkosť nádoru, bunkovú diferenciáciou, hrubý vzhľad, miesto nádoru a vzdialených metastáz # :. TNM, tumor-node-metastázy; * p Hotel < 0.05. CSV na stiahnutie vo formáte CSV

Analýza metylácie normálne žalúdočnej tkanív, primárna rakovina žalúdka tkanív a periférnej krvi od pacientov s karcinómom žalúdka a zdravých kontrol

v predchádzajúcej štúdii z našej laboratóriu, sme predpokladali, že metylácie viezť promótor bol iný u pacientov s karcinómom žalúdka a zdravých kontrol; sme použili on-line softvér bioinformatiky pre analýzu promotorová oblasť a metylačnej stav vedzte génu (obrázok 1A). Skúmali sme hladinu metylácie promótorom vedzte v 30 vzorkách tkaniva DNA od pacientov s primárnymi rakovinou žalúdka tkanív, čo zodpovedá plazmové DNA a ovládanie pomocou BSP metódy, ktorá sa týkala oblastí -171bp na -428bp (obrázok 1A). Priemerné hladiny methylata vedzte v 30 primárnych karcinómu žalúdka tkanív a 30 normálne žalúdočnej tkanive boli 67.78 ± 25,90% a 42.42 ± 30,30%, v uvedenom poradí (obrázok 1B). Primárne rakovinové tkanivá žalúdočné vykazovali vyššie úrovne metylácie v promotorové oblasti viezť v porovnaní s normálnymi tkanivami žalúdka (obr S1A, obrázok 1B, P menšie ako 0,05). Priemerná methylata hladina plazmovej DNA v primárnych pacientov s rakovinou žalúdka a zdravých kontrolných prípadoch boli 69.00 ± 23,90% a 46.71 ± 26,31%, v uvedenom poradí (obrázok 1C). Methylata hladina plazmatické DNA u pacientov s primárnou rakovinou žalúdka vykazovali vyššie úrovne metylácie v promotorové oblasti viezť v porovnaní so zdravým kontrolným prípade (obr S1B, Obrázok 1C, P menšie ako 0,05). Tak, významná metylácie bola pozorovaná v žalúdočnej skupiny karcinómu v porovnaní so zdravými kontrolami. Hladina metylovaného viezť v tkanivách a plazme môže slúžiť ako molekulárne marker pre rakovinu žalúdka.

H. pylori
infekcie indukuje metylácii a umlčanie vedzte

Značný počet štúdií boli publikované povinná preukázať, že H. pylori
infekcie je nezávislý rizikový faktor pre metylácii [20,21,22]. Preto predpokladáme, že H. pylori
spôsobuje viezť metylácie a následne rakoviny. Spočiatku sme sa zaoberali úroveň metylácie promótorom vedzte v DNA z 23 vzoriek tkaniva od pacientov s H. pylori
-pozitívne chronický zápal žalúdka a ovládanie pomocou BSP a MSP metódy, ktorá sa týkala oblastí -171bp na -428bp a -342 bp do -513 bp, respektíve (obrázok 1A). Hladiny strednej metylácie promótorom vedzte v H. pylori
-pozitívne a kontroly boli 75,74 ± 28,16% a 31,20 ± 25,67%, resp. Tak, významný rozdiel v metyláciou bolo pozorované v H. pylori
-pozitívne chronická gastritída skupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou ( P
< 0,01, obrázok 2A). Promotorová oblasť z vedzte bol všeobecne methyluje u pacientov s chronickou gastritídou podľa analýzy MSP (tabuľka S2); Zistili sme však, štyri prípady H. pylori
-pozitívny chronickú gastritídu, ktoré boli relatívne nemethylovaný. Pozorovali sme 19 prípadov H. pylori
-pozitívne chronický zápal žalúdka, ktorá sa zobrazí hypermetylace (tabuľka S2). Ak chcete zistiť, či H. pylori
infekcia indukuje promótor metylácie génu vedzte in vitro
sme zistili, že H. pylori
infekcie boli spojené s expresiou IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, a ATF3 IRX5 proteínu po H. pylori
infekcie a inkubované po dobu 24 hodín v bunkách GES-1 za použitia Western blotting. Naše výsledky ukázali H. pylori infekcie
podporovať expresiu IL-6, TNF-AKT, а, IL-8, a ATF3 IRX5 proteínu a H. pylori infekcie
bol úspešný v GES-1 buniek (obrázok 2B, 2C). Ak chcete ďalej potvrdzujú, že H. pylori
infekcie je skutočne zodpovedný za metylácii alebo umlčanie vedzte sme analyzovali stav metylácie promótorom z vedzte v GES-1 buniek MSP a BSP. Ako je znázornené na obrázku 2D a 2E, promótor vedzte bol hypermetylace v H. pylori
-infected GES-1 bunky, ale unmethylation bolo pozorované v bunkách neinfikovaných s H. pylori
(obrázok 2D, a E). Hladina expresie proteínu vedzte bola tiež nižšia v H. pylori
-infected bunkách než v bunkách neinfikovaných s H. pylori
(obrázok 2C).

Funkčná analýza po obnovení vedzte expresiu in vitro

časté tlmenie hluku alebo downregulaci vedzte v žalúdočných bunkových línií karcinómu naznačuje, že je pravdepodobné, že nádor-supresorové gén v našej predchádzajúcej štúdii. Za účelom testovania tohto bodu sme premietaný vedzte expresie v niekoľkých bunkových líniách rakoviny žalúdka pomocou real-time PCR a westernovým prenosom. Rôzne úrovne viezť expresie boli nájdené v šiestich analyzovaných bunkových líniách (obrázok 3A). konštruované sme pEGFP-N1-viezť expresného vektora a transfekovány pEGFP-N1 vektora do žalúdočnej rakovina bunkové línie MKN-45 a NCI-N87, ktorý ukázal, žiadny alebo nízky stupeň viezť expresie. Po transfekciu, sme skúmali expresiu vedzte v týchto bunkových líniách pomocou PCR v reálnom čase, ktorá ukázala, že expresia transkriptov úroveň vedzte bola up-regulovaná 41,99-krát (obrázok 3B, P 0,01) v týchto bunkových línií v porovnaní s s bunkami kontrolnými transfekciou. Tiež sme skúmali schopnosť rakovinových buniek žalúdka nadmernou expresiou viezť k invázii a migráciu tým transwell invázie a migrácie testoch (obr 3C). Invazívne Schopnosť MKN-45 bunkách v /N1 skupiny vedzte bola významne znížená v porovnaní s bunkami kontrolnými prenesené (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45, P Hotel &0,001). Počet MKN-45 bunkách v viezť transfekciou vzorke, ktorý preneseného cez transwell inzertu bola tiež významne nižšia v porovnaní s bunkami kontrolnými prenesené (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7.42, P Hotel < 0,001).

HUVEC boli suspendované v supernatante získaných z kontroly a vedzte /N1. Po 18 hodinách inkubácie sa supernatant zozbieraná z vedzte /N1 bunky vykazovali silný inhibičný účinok na tvorbu trubicovitých štruktúr HUVEC vzhľadom na počet, dĺžka a pretínajúca uzly v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr 3C). Ako je znázornené na obrázku 3D, bunkového rastu MKN-45 bunkách bola významne potlačená na obnovenie Vedzte expresie v porovnaní s kontrolnou skupinou ( P Hotel &0,05). Ak chcete skontrolovať reprodukovateľnosti našich zistení sme hodnotili schopnosť NCI-N87 rakovinových buniek žalúdočnej napadnúť, migrovať a tvoria rúrkovité štruktúry na viezť nadmerné expresie. Tieto výsledky boli podobné tým, ktoré je opísané v MKN-45 rakovinových buniek, čo naznačuje, že vedzte má významnú inhibičný úlohu v invázii, migrácia a tubulárnej tvorbe nádorových buniek.

Vplyv viezť nadmerné expresie na karcinogenity rakoviny bunky u nahých myší

vyjadrenie vedzte potlačil rast ako v MKN-45 a NCI-N87 pomocou CCK-8 testu v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3D, P menšie ako 0,05). Toto zistenie bola ďalej potvrdená testom tvorby kolónií, ktoré rastú buniek karcinómu žalúdka na mäkkom agare po transfekciu s viezť-nadexprimující vektora. ceny kolónie so založením MNK-45 bunky boli 13,56 ± 0,53% v /N1 skupiny viezť a 1,2 ± 0,31% v kontrolnej skupine ( P Hotel &0,001, obr 4E). Miera tvorenia kolónií NCI-N87 buniek vykazovali podobný trend. Ďalej sme skúmali účinok nadmernej expresie viezť na rast nádoru inokuláciou MKN-45 alebo NCI-N87 /N1 a vedzte /N1 buniek subkutánne do pravého boku nahých myší oblastí. Karcinogenity bola významne znížená v vedzte-transfekciou buniek. Rýchly rast nádoru bol pozorovaný v kontrolných skupinách po 1 mesiaci (obrázok 4F). Tumor potláčajúce Úloha vedzte expresie bol zjavný v oboch testovaných nádorových bunkových línií (obr 4G, p 0,01), čo naznačuje, že vedzte potláča tumorigeničnosti rakovinových buniek. Tieto výsledky ukazujú, že expresia vedzte inhibuje tumorigeničnosti rakoviny žalúdka aj in vitro stroje a in vivo
.

Identifikácia cieľových génov po vedzte génové transfekcia

k objasneniu molekulárnej mechanizmus stojaci inhibičný účinok na bunky viezť inváziu, rast, migráciu a vyvolanie nádorového bujnenia, rakoviny žalúdka. Analyzovali sme celého genómu transcriptome profil MKN-45 /N1 a vedzte /N1 buniek Agilent oligo mikročipu. Podľa rozkladacie zmenu (viac ako 3.0), screening medzi MKN-45 /N1 a vedzte /N1 bunky, sme našli 193 upregulovány gény a 135 downregulated gény (Tabuľka S3). Hľadali sme gény, ktoré prekrývali s rakovinou spojené a génovej sady molekulárnej funkcie súvisiace vo MSigDB (C4 a C5 génových sád; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~HEAD=dobj~~number=plural). Vybrali sme 49 s rakovinou spojené s génmi, ktoré obsahujú 23 up-regulovaná gény a 26 downregulated gény pre klastra mapovanie na platforme microarray analýzy MeV (www.tm4.org/mev.html~~pobj, obrázok 4A). PCR v reálnom čase bolo vykonané na overenie týchto génov (tabuľka S4), a potvrdzuje, že naše zistenia microarray 8 up-regulovaná gény a 10 downregulated génov (Obrázok 4B). Mená gén a funkčné anotácie sú uvedené v tabuľke S5. Ak chcete zistiť, či ide o priame cieľovej gény vedzte sme vykonali chromatín testy imunoprecipitačních pomocou viezť protilátku a potom analyzoval ťahaný dole DNA. Identifikovali sme tri downregulated gény, TCF19 (NM_001077511), Cdc42 (NM_001039802) a GPR56 (NM_001145770) ako priame ciele vedzte (obrázok 4C).

Korelácia medzi viezť a jeho následných cieľov, ako aj ich vzťah s inhibícia žalúdočnej inváziu rakovinových buniek, rast, migráciu a vyvolanie nádorového bujnenia rakoviny žalúdka in vitro stroje a in vivo
, bolo znázornené na obrázku 5C.

• Ploche ONE: Biomarkery Identifikácia a charakterizácia nových N-glykan založené na žalúdočné Cancer
• Ploche on: genetický polymorfizmus v TOX3 je spojená s prežitia rakoviny žalúdka v čínskej Population