Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

PLoS ONE: Kandidátske microRNA biomarkery rakoviny žalúdka človeka: systematická kontrola a validácia Study

abstraktné

Karcinóm žalúdka (GC) zostáva hlavnou príčinou chorobnosti a úmrtnosti na celom svete a je tu teda jasná potreba hľadať citlivejších skorých diagnostických biomarkerov. Vykonali sme systematické zhodnotenie ôsmich publikovaných miRNA profilovanie štúdiách, ktoré porovnávali GC tkanivá s priľahlými noncancerous tkanív. Systém poradí miRNA bola použitá, aby sa frekvencia porovnanie, smeru rozdielna expresia a celková veľkosť vzorky do úvahy. Identifikovali sme päť miRNA, ktoré boli najviac konzistentne hlásené byť up-regulovaná (MIR-21, MIR-106b, MIR-17, Mir-18a a mier-20a) a dve miRNA, ktoré boli downregulated (Mir-378 a mier-638). Šesť z nich boli ďalej potvrdené v 32 párových sád GC a priľahlých vzorky nenádorové tkaniva pomocou real-time PCR. Mir-21, MIR-106b, MIR-17, Mir-18a a mier-20a bolo potvrdené, že upregulatedin GC tkanivách, zatiaľ čo expresia MIR-378 sa znižuje. Navyše sme zistili, významný vzťah medzi úrovňou expresie MIR-21, MIR-106b, MIR-17, Mir-18a a mier-20a a klinicko-patologické rysy GC. Tieto miRNA môžu byť použité na diagnostické a /alebo prognostické biomarkerov pre GC, a preto vyžadujú ďalšie skúmanie

Citácia :. Wang J-L, Hu Y, Kong X, Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J, et al. (2013), ktorý môže byť posúdený microRNA Biomarkery v rakoviny žalúdka Human: systematická kontrola a overovacej štúdie. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10,1371 /journal.pone.0073683

Editor: William CS. Cho, Elizabeth Hospital kráľovná, Hong Kong

prijatá: May 16, 2013; Prijaté: 19.července 2013; Uverejnené: 09.09.2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotácií z Národného Natural Science Foundation Key Program (No. 30830055), Ministerstva zdravotníctva, Čína (No. 200802094), Ministerstvo školstva (č 20090073110077) do Fang JY, a doktor Foundation Innovation Shanghai Jiao Tong-University School of Medicine (č BXJ201219) na Wang JL. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

i napriek nedávnej zníženie výskytu karcinómu žalúdka (GC) [1], zostáva hlavnou príčinou chorobnosti a úmrtnosti po celom svete, a to najmä vo východnej Ázii. Celkom jeden milión nových prípadov GC došlo v roku 2008, s 738,000 úmrtia [2]. To predstavuje 8% z celkového počtu prípadov rakoviny a 10% z celkového počtu úmrtí. Aj keď endoskopia dokáže detekovať skorá štádia GC, vo väčšine prípadov sú stále diagnostikovaná v pokročilom štádiu, čo má za následok zlou prognózou [3]. Miera prežitia po dobu 5 rokov pre GC prípadov sa pohybuje v štádiu II od 30% do 50%, ale klesne na úroveň medzi 10% a 25% u pacientov s ochorením v štádiu III [4]. Hoci endoskopickej techniky sú rýchlo rozvíja, ich hodnota pre včasnú detekciu GC je obmedzený pre nedostatok citlivosti, vysokými nákladmi a nepríjemnosti. Nové diagnostické a prognostické biomarkery pre GC sú preto naliehavo potrebné.

mikroRNA (miRNA) sú krátke nekódujúca RNA molekuly 19-25 nt. Regulujú génovú expresiu na post-translačnú úrovni vedenia RNA vyvolané tlmiaci komplex na cieľových miestach miRNA v netranslatované oblasti 3 'mRNA, čo vedie k degradácii mRNA alebo inhibíciu translácie [5]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že mnoho miRNA aberantne vyjadruje v mnohých druhov rakoviny, a miRNA expresie profilovanie ukázali niektoré miRNA, ktoré majú byť spojené s rozvojom nádoru, progresiu a reakciu na liečbu. Preto sú vhodnými kandidátmi na použitie ako diagnostických, prognostických a prediktívnych biomarkerov [6].

Niekoľko štúdií boli vykonané na hľadanie biomarkerov identifikáciou diferenciálnej expresii miRNA medzi vzorkami GC tkanív a zodpovedajúce non-nádoru žalúdka tkaniva od rovnakého pacienta, [7] - [14]. Tieto štúdie viedli k identifikácii stoviek odlišne exprimovaných miRNA. Avšak, mnoho z nich je pravdepodobné, že bude falošne pozitívnych, a môže byť použitý len malý zlomok ako diagnostické alebo prognostické biomarkery. Logický prístup k rozlíšenie dôležitých miRNA z veľkého počtu kandidátov zoznamov miRNA je hľadať priesečníku miRNA identifikovaných v niekoľkých nezávislých štúdií [15]. Hoci táto metóda sa stala rastúci populárnou [15], [16], [17], nie je zverejnená štúdia identifikovala priesečníky miRNA GC súvisiace na základe veľkého počtu miRNA expresie profilovanie štúdií.

Vykonali sme tento systematický prehľad identifikovať najdôležitejšie rozdielne exprimovaných miRNA, ktoré boli trvalo hlásené v sérii nezávislej osoby miRNA expresie profilovanie štúdie u pacientov GC. Navyše sme ďalej overená niektoré miRNA, ktoré boli najviac po prúde aj proti downregulated pomocou PCR v reálnom čase v 32 párov GC a spárovaných vzoriek okolitom normálnom tkanív.

Materiály a metódy

etika Vyhlásenie

štúdia bola schválená etickou komisiou Shanghai Jiaotong University School of Medicine, a písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov pri vstupe do štúdie.

vyhľadávacie stratégie

Potenciálne štúdie uverejnenej v angličtine boli odobraté z Medline pomocou kľúčových slov: "Mirna" alebo "mikroRNA" alebo "Mir", "žalúdočné" alebo "žalúdok", "profilovanie" alebo "microarray". Zoznamy odkazov na prehľadné články a pôvodných článkov boli vyhľadávané manuálne ďalších publikácií.

Zahrnutie Kritériá literatúry

V prípade štúdie, ktoré majú byť zahrnuté do tohto systematického prehľadu, muselo byť splnené viaceré kritériá : 1) štúdie musela byť miRNA profilovanie štúdiách u pacientov GC; 2) štúdie mali použiť GC tkanivá a ich zodpovedajúcich okolitom normálnom tkanív pre porovnanie; 3) Metódy museli obsahovať miRNA microarray techniky. Ďalej boli zahrnuté len fulltextové publikácie v angličtine. Profilovanie štúdií, ktoré používali GC bunkových línií alebo vzoriek séra od pacientov GC tie, ktoré v porovnaní GC biopsiou z nádorov s rôznymi štádiách ochorenia, a tie, ktoré používajú rôzne miRNA technológie neboli zahrnuté. Prehľadné články takisto neboli zahrnuté do tejto systémovej kontrole.

Extrakcia dát a zoznamy miRNA

rozdielne exprimovaných miRNA boli identifikované od seba súčasťou profilovanie štúdie. Relevantné informácie bola stanovená (tj chromozomálne umiestnenie, pre-miRNA dĺžky, zrelých miRNA sekvencie a potenciálne ciele pre miRNA) a chýbajúce informácie bol identifikovaný z databázy miRBase (www. Mirbase.org/~~HEAD=pobj) a PubMed.

Poradie

Každá súčasťou profilácia štúdie [7] - [14] poskytla zoznam odlišne exprimovaných miRNA (tabuľka S1). Griffith a Chan vymyslel metódu hodnosti potenciálne molekulárnych biomarkerov pre porovnávacie skupiny [16], [17], ktorý bol použitý pre miRNA profilovanie štúdia. Napríklad, Ma et al. [15], ktoré možno identifikovať priesečníky kolorektálneho miRNA nádorových ochorení na základe veľkého počtu miRNA profilovacích štúdií. To znamená, že kritériá pre literatúru obsiahnuté v tomto súčasnom systematickom prehľade boli založené na tých, vo svojich správach [15]. Mierny boli hodnotené na základe kritérií v nasledujúcom poradí dôležitosti: (i) miRNA bola trvale označená ako rozdielne exprimované v konzistentným smere zmeny; (Ii) frekvencia miRNA bol zaznamenaný v štúdiách microarray; (Iii) celková veľkosť vzorky pre každý konzistentné hlásené miRNA.

Overenie miRNA pomocou real time PCR

Ak chcete overiť profilovanie výsledky, 32 čerstvých GC tkanív a ich párového non-nádoru žalúdka tkanivá boli získané z nemocnice Renji, pridružené k Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Celková RNA bola extrahovaná z 32 dvojíc vzoriek ľudskej GC (vrátane rakoviny a priľahlých nerakovinové tkanivá) za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen). Koncentrácia RNA a čistota bola meraná za použitia Nanodrop ND-2000, a spôsob merania ultrafialové absorpcie bola použitá pre detekciu čistota RNA, iba jej A260 /A280, umiestnený medzi 1,80-2,00, a A260 /A230 > 1.7, boli použité finálna experiment, inak RNA musí byť znovu získaná. Reverzný transkripcie od 3 ug RNA bolo vykonané usingAll-in-Onet First-Strand cDNA Synthesis Kit (Genecopoeia, Guangzhou, Čína), podľa protokolu výrobcu. Stručne povedané, pripravená RNA reverznej transkripcie Reakčná roztok sa inkubuje pri teplote 37 ° C počas 60 minút a ukončí pri teplote 85 ° C po dobu 5 minút, a potom sa uloží pri -20 ° C pre ďalšiu analýzu. Kvantitatívne PCR (qPCR) bola vykonaná za použitia Prism 7900HT Sequence systém ABI Detection (Applied Biosystems, USA) s SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA). Primery (MIR-21-5p, MIR-106b-5P, MIR-17-5p, MIR-18a-5P, MIR-20a-5p a mier-378-5p) vrátane U6 boli získané od Genecopoeia (Guangzhou, Čína) , Kvantifikácia bola vypočítaná za použitia metódy 2 -ΔΔCT a sú uvádzané ako normalizované vzor.

Štatistická analýza

Výsledky boli analyzované s použitím softvéru SAS: 9.2 (SAS Institute Inc. USA). Dáta sú uvedené ako priemer ± SD. T test bol použitý na porovnanie hodnôt medzi dvoma nezávislými skupinami.

Výsledky

výber literatúry a pracovisko Charakteristika

Celkom 104 štúdií boli hľadaných v PubMed pomocou nášho vyhľadávania stratégie, 73 z nich bolo po filme tituly a súhrny vylúčené. 23 štúdie boli po prečítaní celého textu vylúčená. Iba osem štúdie boli nakoniec zahrnuté do tohto systematického prehľadu. Podrobný výber štúdii bolo ukázané na obrázku 1. Podrobnejšie údaje o každej štúdie sú uvedené v tabuľke 1.

rozdielne exprimovaných miRNA

Celkom 223 odlišne exprimovaných miRNA boli hlásené v ôsmich mikročipe štúdie (rozdielne exprimovaných miRNA v každej štúdii boli podrobne popísaný v tabuľke S1); 124 bola stimulovaná v GC a 99 boli downregulated. Medzi 223 odlišne exprimovaných miRNA, 48 bolo hlásených u najmenej dvoch štúdiách; 39 (81,3%) malo konzistentné smer a deväť (18,7%) mal nejednotný smer zmenené expresie. Medzi bývalej 39, 20 bola stimulovaná v GC a 19 boli downregulated. Tri z týchto miRNA boli hlásené v piatich microarray štúdiách (Mir-21, Mir-106B a mier-378), štyri boli hlásené v štyroch štúdiách (Mir-17, MIR-18a, mier-20a a mier-638) a siedmimi boli hlásené v troch štúdiách (MIR-19a, MIR-20b, MIR-25, MIR-30d, MIR-923, mier-375 a mier-148a). Ich chromozomálne umiestnenie, pre-miRNA dĺžky, zrelé sekvencie a potenciálne ciele sú uvedené v tabuľkách 2-4.

Overenie vybraných miRNA v GC Pacienti

Ak chcete overiť expresiu šiestich najväčší trvalo označená miRNA (Mir-21, MIR-106B, MIR-17, MIR-18a, mier-20a a mier-378), expresie týchto miRNA v GC biopsiách a priľahlé nerakovinové tkanivá boli porovnané v 32 prípadoch GC za použitia real-time PCR. Hrubé hodnoty Ct šiestich miRNA boli ukázané vo výsledkoch Tabuľka S2.The ukázali, že mier-378 bol downregulated v GC tkanivách, zatiaľ čo ostatné piatich miRNA (Mir-21, MIR-106B, Mir-17, Mir-18a a mier -20a) bola up-regulované v GC (obrázok 2). Naše výsledky boli zhodné s tými z pôvodných štúdií profilovanie. Ďalej sme skúmali vzťah medzi expresiou týchto miRNA sa klinických a patologických rysov GC. Zistili sme, že expresia MIR-21 bola významne vyššia v prípade GC prípadoch, v závislosti na veľkosti nádoru (≥8 cm), zlá diferenciácie a metastáz s postihnutím lymfatických uzlín a neskôr štádiu ochorenia. Mir-106b, mier-17 a hladiny Mir-18a boli významne vyššie u zle diferencované GC prípady s postihnutím lymfatických uzlín alebo neskoré štádiu ochorenia, zatiaľ čo hladiny MIR-20a boli významne vyššie v prípade GC s postihnutím lymfatických uzlín. Avšak, nebol zistený žiadny vzťah medzi expresiou Mir-378 a klinicko-rysy GC. Tieto výsledky sú podrobne uvedené v tabuľke 5.

Diskusia

Mirna microarray štúdie poskytujú množstvo informácií, ale spoločný nevýhodou je nedostatok súdržnosti medzi rôznymi štúdiami. Podľa správ Griffith et al. a Chan et al. [16], [17], čo je logickým riešením tohto problému by bolo zistiť súlad medzi rôznych štúdiách použité rôzne microarray platformy. Niekoľko systematické hodnotenie [15] - [17] Táto metóda sa používa na stanovenie rozdielne exprimovaných génov alebo miRNA v rôznych chorobných stavov. Použitím podobné metódy, sme zistili, že celkovo 48 odlišne exprimovaných miRNA boli hlásené v najmenej dvoch nezávislých štúdií medzi osem GC miRNA profilovanie štúdie [7] - [14]. Medzi nimi 39 miRNA boli hlásené byť zmenený v konzistentnom smere, zatiaľ čo závery pre deväť bolo nekonzistentné. Medzi 39 miRNA, ktoré mali konzistentné zmeny, 20 miRNA boli dôsledne up-regulované v GC v porovnaní s nenádorové žalúdočné tkaniva a 19 boli dôsledne downregulated v GC. Identifikovali sme päť miRNA, ktoré boli najviac konzistentne upregulovány (Mir-21, MIR-106A, Mir-17, Mir-18a a mier-20a) a dve najdôkladnejšie downregulated (Mir-378 a mier-638) v aspoň štyri profilovanie štúdií. Potom sme overený tieto zistenia pomocou PCR v reálnom čase, čo ďalej podporilo závery tohto systematického prehľadu. Tiež sme zistili, že expresia týchto miRNA korelovaných s klinicko-rysy GC, z ktorých vyplýva, že tieto miRNA môžu byť užitočné ako biomarkerov pre GC.

Jedným z najviac vykazovať rovnako up-regulované miRNA v našej systematického prehľade bolo Mir -21, ktorá zmenila expresie a onkogénnu aktivitu v rôznych ľudských nádoroch. Cui a kol. [18] preukázali, že expresia MIR-21 bola významne vyššia u GC tkanive v porovnaní s priľahlou normálnou tkanív. Bolo tiež zistené, že expresia MIR-21 je vyšší u pacientov s GC s lymfatických uzlín, než tie, ktoré, bez, a bol tiež významne koreluje s histologickým typom nádoru a pTNM fázy [19], ktorá bola overená našej štúdii. Navyše, vyššie hladiny expresie MIR-21 predpovedal zlé prežitia u pacientov s GC [19]. Iné štúdie zistili, že mier-21 môže podporovať proliferáciu nádoru a invázii v GC potlačením expresie Ptení alebo PDCD4 [20], [21]. Navyše predchádzajúce štúdie tiež odhalili onkogénne aktivitu Mir-21 v kolorektálnym karcinómom [22], rakoviny prsníka [23] a rakoviny pažeráka [24].

MIR-106b bolo tiež dôsledne hlásená ako stimulovaná miRNA v GC tkanivo tým aj predchádzajúce štúdie [14], [25]. Vysoká expresia MIR-106b bol predtým spojené s lymfatických uzlín [25], [26], a to bolo potvrdené v našej štúdii. Kim et al. [27] zistili, že mier-106b môže pôsobiť onkogénne aktivitu potlačením expresie p21 v GC. MIR-106b by mohlo vyvolať epiteliálne-to-mesenchymálního prechodu (EMT) a fenotypu bunky nádorové iniciovanie v karcinómu prsníka o zacielení Smad7 a Six1 a aktivácia TGF-beta signalizácie [28]. To môže tiež podporovať proliferáciu buniek v ľudskom hepatocelulárneho karcinómu tým downregulating expresie APC [29].

MIR-17 má známe onkogénne aktivitu u ľudí, a zistilo sa, že up-regulované v 77,2% vzoriek tkaniva GC v porovnaní s priľahlou normálnou žalúdočné tkaniva. To podporuje progresiu bunkového cyklu a inhibuje apoptózu v GC zacielením p21 a p53INP1 (nádorový proteín p53 indukovaná jadrový proteín 1) [30]. Cirkulujúcej hladiny MIR-17 sú zvýšené u pacientov s GC, a koncentrácia Mir-17 je významne spojená s štádiu TNM a stupňa GC [31]. Avšak, naša štúdia ukázala, že expresia MIR-17a bola vyššia v prípadoch, bez GC lymfatických uzlín, než tie, ktoré sa zapojením lymfatických uzlín, ktoré mohli byť dôsledkom malej veľkosti vzorky v našej štúdii. Vysoká expresia Mir-17 je signifikantne v korelácii so zlými výsledkami prežitia [31]. Predchádzajúce štúdie tiež zistili, že mier-17 má onkogénne aktivitu u kolorektálneho karcinómu [32], rakoviny prsníka [33] a rakoviny pankreasu [34].

Bolo zistené, MIR-18a, ktoré majú byť up-regulovaná v štyroch štúdiách v tomto systematický prehľad, a je známe, že má onkogénne aktivitu u ľudí. Wu et al. [35] sa zistilo, že expresia MIR-18a bola významne up-regulovaná v GC tkanive v porovnaní s normálnou žalúdočné tkaniva, a môže sa priamo zamerať PIAS3 (inhibítor proteínu prevodníka aktívneho signálu a aktivátor transkripcie 3) a v pozitívnej korelácii s úrovňou survivin, Bcl-xl a c-myc. Okrem toho up-regulácia MIR-18a bola popísaná v nazofaryngálne karcinóm [36], rakoviny pankreasu [37], hepatocelulárny karcinóm [38] a rakoviny prsníka [39].

Mir-20a je ďalší miRNA s onkogénne bolo zistené, činnosť, a ktoré majú byť up-regulovaná v štyroch štúdiách v tejto literatúre. Bolo preukázané, že cirkulujúca hladina MIR-20a je významne zvýšená u pacientov s GC v porovnaní so zdravými kontrolami, čo je významne spojená s stupňami a stupňami nádoru [31], [40]. Naša štúdia tiež zistil, že mier-20a bola významne zvýšená u GC tkanivách a bol významne spojené s lymfatických uzlín. Okrem toho up-regulácia MIR-20a už skôr bolo zistené, u rakoviny krčka maternice, rakoviny prostaty a rakoviny vaječníkov, a to miRNA by mohla podporiť bunkovú proliferáciu alebo invázii týchto rakovín [41] - [43].

najdôslednejšie downregulated Mirna v tomto systematického prehľade bolo MIR-378, čo bolo zistené, že downregulated v piatich štúdiách. MIR-378 bolo preukázané, že anti-onkogénne aktivitu u ľudí [44]. Exogénne expresie MIR-378 výrazne potláča proliferáciu GC buniek potlačením CDK6 a VEGF signalizácie [44]. V našej štúdii, aj keď sme zistili, že expresia MIR-378 sa downregulated v GC tkanivách, nebol zistený žiadny vzťah medzi expresiou Mir-378 a klinicko vlastností GC. Toto môže boli kvôli malej veľkosti vzorky tejto štúdie. To je tiež hlásil, že mier-378 je významne downregulated v kolorektálneho karcinómu, a môže hrať dôležitú úlohu nádorového supresor v tejto rakoviny [45]. Avšak, iné štúdie zistili, že mier-378 môže byť onkogénne aktivitu v iných typov rakoviny [46] - [49]. Preto je presná úloha Mir-378 v karcinogenéze musí byť ďalej objasnený.

Okrem toho sme tiež zistili, že niektoré z kandidátskych miRNA uvedených v našej štúdii boli slso identifikované ako biomarkery séra v rôznych druhov rakoviny. Napríklad sérum MIR-21 bola významne zvýšená v sére z perioperačnej adenómov a kolorektálneho karcinómu (CRC), a bol nezávislý prognostický marker CRC [50], [51]; Plasma MIR-106b, spolu s Mir-20a a mier-221 majú potenciál ako nových biomarkerov na skorú detekciu rakoviny žalúdka [40]; Cirkuláciou Mir-17 sa môže použiť ako nová neinvazívna biomarker nosohltana karcinómu [52], rakoviny žalúdka [53] a CRC [54]; Sérum MIR-18a môže byť použitý ako nový biologický marker karcinómu prsníka [55], kolorektálneho karcinómu [56], hepatocelulárny karcinóm [57], a rakovinu pankreasu [58]; Cirkulujúci MIR-378 môže byť použitý ako biomarker rakovinu obličiek [59] a rakoviny žalúdka [60]. Tieto štúdie ďalej potvrdila dôležitosť týchto identifikovaných miRNA, a môžu rozšíriť rozsah uplatňovania týchto miRNA.

Na záver, naše systémové preskúmanie identifikovala päť stimulovaná miRNA (Mir-21, MIR-106B, Mir-17, Mir-18a a mier-20a) a jeden downregulated miRNA (MIR-378), ktoré sú potenciálne nové biomarkery pre GC. Tieto miRNA bolo preukázané, že majú diagnostické a /alebo prognostické potenciál pre túto rakovinu a vyžadujú ďalšie skúmanie. Ďalšie štúdie, ktoré sa zameriavajú na tieto miRNA pomôže určiť panel diagnostických a prognostických biomarkerov GC s príslušnou úrovňou citlivosti a špecifickosti.

Podporné informácie
tabuľke S1.
rozdielne exprimovaných miRNA identifikovanej v každú zahrnutú štúdii
doi :. 10,1371 /journal.pone.0073683.s001
(XLS)
tabuľke S2.
Raw Ct hodnota vybraných miRNA
doi :. 10,1371 /journal.pone.0073683.s002
(XLS)
Tabuľka S3.
PRISMA Kontrolný
doi :. 10,1371 /journal.pone.0073683.s003
(DOC)

Poďakovanie

Ďakujeme slečne Wei Feng-Qu za jej vynikajúcu úvodník práce.

Other Languages