Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Multiple-to-Multiple vzťahoch medzi mikroRNA a cieľových génov v žalúdočnej Cancer

Abstraktné

mikroRNA (miRNA) pôsobí ako transkripčný regulátory a hrajú kľúčovú úlohu v karcinogenéze. V súlade s cieľovým databázou miRNA, jeden miRNA môžu regulovať mnoho génov, ako svoje ciele, zatiaľ čo jeden gén môže byť cieľom mnohých miRNA. Tieto zistenia naznačujú, že vzťahy medzi miRNA a ich cieľov, nemusí byť jedna ku jednej. Avšak, veľa správ popísali len one-to-one, one-to-násobok alebo násobok-to-jeden vzťah medzi miRNA a jeho cieľového génu v ľudských nádorov. Tak, že je potrebné zistiť, či kombinácia niektorých miRNA by regulovať niekoľko cieľov a podieľa sa na karcinogenéze. Nájsť niektoré skupiny miRNA, ktoré môžu synergicky regulujú ich cieľov v ľudskej rakovine žalúdka (GC), sme znovu analyzované naše dáta predchádzajúcej miRNA expresie poľa a bolo zistené, že 50 miRNA sú up-regulované v liečbe 5-aza-2'-deoxycytidínu v GC bunkovej línii. Ďalej len "TargetScan" miRNA cieľovej databázy predpovedal, že niektoré z týchto miRNA majú spoločné cieľové gény. Ďalej uvedenej databázy GEO pre expresiu týchto spoločných cieľových génov v ľudskej GC, ktoré by mohli byť spojené s žalúdočnej karcinogenéze. V tejto štúdii sme analyzovali dve kombinácie miRNA Mir-224 a -452, a mier-181c a -340. Nadmerná expresia oboch kombináciou miRNA významne down-regulované svoje cieľové gény, DPYSL2 stroje a KRAS stroje a KRAS stroje a MECP2
, resp. Tieto kombinácie Mirna synergicky znížila proliferáciu buniek po transfekciu. Ďalej bolo zistené, že tieto miRNA boli down-regulovaná promótorom hypermetylace v GC buniek. Je teda pravdepodobné, že vzťahy medzi miRNA a ich ciele nie sú one-to-one, ale viac k-násobku v GC, a že tieto zložité vzťahy môžu byť v súvislosti s žalúdočnej karcinogenéze

Citácia :. Hashimoto Y, Y Akiyama, Yuasa Y (2013) Multiple-to-Multiple vzťahoch medzi mikroRNA a cieľových génov v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

prijatá: 14. decembra 2012; Prijaté: 24. marca 2013; Uverejnené: 08.05.2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporovaný z časti z grantov A3 Foresight Programu japonskej spoločnosti pre podporu vedy (JSP) (RR), a študijných pobytoch v JSPS pre mladých vedcov (YH). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

mikroRNA (miRNA), trieda malých RNA non-kódujúcich proteíny, ktoré boli identifikované ako nový typ regulačného génu, ktoré sa viažu na 3'-nepřekládané oblasti (UTR) cieľovej mRNA, čo vedie degradácii mRNA alebo blokády translácia mRNA [1]. Je všeobecne známe, že miRNA zmeny sú spojené s tumorigenezí [1]. V súlade s cieľovým databázou miRNA, jeden miRNA môžu regulovať mnoho génov, ako svoje ciele, zatiaľ čo jeden gén môže byť cieľom mnohých miRNA. Avšak, početné štúdie ukázali vzťah jedna k jednej medzi miRNA a jeho cieľového génu. Bolo tiež zistené, že pre viac alebo zhluk miRNA kooperatívne reguluje gén, ktorý sa vzťahuje ku karcinogenéze [2] - [4]. Na druhej strane, viac génov sú zamerané jedným miRNA [3], [4]. Dokonca viac k viac vzťahov medzi miRNA a cieľov boli hlásené pomocou výpočtovej analýzy [5], [6]. Avšak, tam bolo len málo prác zaoberajúcich sa experimentálne legalizujúce viac-to-násobok vzťahy v rakovinových bunkách.

Karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou ľudské malígne ochorenie a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete, s odhadom jeden milión nových prípadov ročne [7]. Karcinómov žalúdka sú histologicky rozdelené do dvoch hlavných typov, črevné a difúzna typy [8]. Difúznu typu GC je často neriešiteľný a vykazuje zlú prognózu pacienta. V poslednej dobe sme preukázali, že strata funkcie Cdh1 a Trp53 vyvoláva difúzneho typu GC na myšiach modelov [9]. Hoci toto zistenie nám umožní vyvinúť nové rakovina žalúdka u ľudí terapie, ďalšie vyšetrovanie na molekulárne mechanizmy podkladové žalúdočné karcinogenéze sú nevyhnutné vyvinúť iné prístupy pre cielenú terapiu.

Promoter CPG ostrov hypermetylace je jedným z najbežnejších mechanizmov ktorými sú tumor supresorové gény inaktivované v ľudských nádorov [10]. V poslednej dobe sa ukázalo, že niektoré miRNA sú tiež terčom epigenetické umlčanie v nádorových ochorení [11]. Naše a ďalšie skupiny, už skôr ukázali, že farmakologický alebo genetické narušenie metylácie DNA v bunkových líniách rakovinových vyvoláva up-reguláciu značným množstvom miRNA [12] - [15]. Tieto údaje viedli k identifikácii kandidátnych nádor potláčajúce miRNA, ktorých umlčanie je spojená s CPG ostrovné metylácie. Tak ďaleko, metylácie členov rodiny MIR-124 bol identifikovaný v kolorektálneho karcinómu a nádorov iných orgánov [11]. Okrem toho sa /c klastra MIR-34b má typickú CPG ostrova, a je down-regulovaná časté metylácie v hrubého čreva a rakoviny žalúdka [12]. Podobne sme zistili, že mier-181c metylácie je spojená s žalúdočnej karcinogenéze prostredníctvom regulácie génov onkogénnych KRAS stroje a NOTCH4
[13]. Down-reguláciu mnohých miRNA pomocou metylácie súčasne sa vyskytuje v rakovinových bunkách, a môže zvýšiť viac-to-násobok vzťahy medzi miRNA a cieľov.

V tejto štúdii na overenie viac k viac vzťahov medzi miRNA a cieľov v rakovinových bunkách, sme preukázali, že dva páry viac miRNA Mir-224 a -452 a Mir-181c a -340, mal viac cieľových génov a synergicky znížila proliferáciu buniek prostredníctvom regulácie svojich cieľov v oblasti ľudských GC buniek.

Výsledky

50 miRNA bola up-regulovaná v GC bunkové línie, KATO-III, po 5-aza-2'-deoxycitidin Liečba

Ak chcete určiť kandidátnej miRNA, ktoré synergicky ovplyvňujú ich cieľové gény, sme znovu analyzovali našej predchádzajúcej microarray dát (Gruz prístupové číslo GSE16006) [13]. považovaná sme, že hladina miRNA bola up-regulovaná na 5-aza-2'-deoxycytidínu liečby (5-aza-CdR), pri ktorej čisté intenzity jednotlivých bodov 3 bolo viac ako 1,5-krát. Ďalej sme tiež vybrané miRNA, ktoré boli nájdené v priemere, aby sa zvýšil viac ako 3 krát na microarray analýzy. na týchto nových kritérií, sme zistili, že 50 miRNA bola up-regulované v bunkovej línii GC, KATO-III (tabuľka S1). potvrdila sme up-regulácia 5 zo 6 reprezentatívnych prekurzorov miRNA, to znamená, že mier-145, -148, -152, -224 a -340, po 5-aza-CdR liečby pomocou RT-PCR (obrázok 1A).

TargetScan Predpokladaná Common cieľových génov kandidáta miRNA

Ak chcete zistiť, či epigenetické regulované miRNA majú spoločné cieľových génov, hľadali sme databázu TargetScan (verzia 5.1) pre ich spoločných cieľoch. Podľa TargetScan, 50 miRNA by mohli byť rozdelené do 46 skupín na základe ich semien sekvencií. TargetScan tiež ukázal, že tieto skupiny 46 môžu byť zacielené na 6,460 gény. Z týchto cieľových génov, sme vybrali 13, ktoré bolo hlásené výraz, ktorý má byť zvýšená na GC v GEO databázy (GEO prístupové č GSE2685), alebo je v spojení s žalúdočné karcinogenéze (tabuľka S2). Tu sa zameriame na štyri miRNA MIR-152, -181c, -224 a -340, pretože sme už oznámila, že mier-181c je epigenetické down-regulované v GC [13] a CPG ostrovy sa nachádzajú v dodávateľských oblastiach tri ďalšie miRNA (Obrázok 2A a C, a obr S1). Obrázok 2a takisto ukazuje, že mier-452 klastre s Mir-224. TargetScan predpovedal, že päť miRNA môžu regulovať spoločné ciele. Napríklad, DPYSL2
(Dihydropyrimidináza-like 2, tiež známy ako padá odozvy mediator proteín 2, CRMP2
) je zameraný MIR-224, -452, a -181c, KRAS
podľa MIR-224, -452, -340 -181c, a -152, a MECP2
(metyl CPG väzobný proteín 2) MIR-181c a -340, v danom poradí (obrázok 3).

Expresia MIR-224, -452, -152 a -340 Zníženie na DNA hypermetylace v GC bunkových líniách

skúmali sme zapojení epigenetických zmien v down-regulácia miRNA. Expresie MIR-224, -340 a -152 boli v niekoľkých GC bunkových líniách (obrázok 1B), zvyšuje o 5-aza-CdR liečby. My kvantitatívne analyzoval zrelé MIR-224 expresie v 9 GC bunkových línií a bunkové línie kolorektálneho karcinómu (CRC). Č expresie MIR-224 bola zistená u 7 z 10 bunkových línií karcinómu (obrázok 1C). Tiež sme analyzovali expresiu zmenu MIR-224 /-452 klastra v bunkách KATO III-liečených nízkou dávkou 5-aza-CdR (0,2 umol /l), inhibítora Histon deacetylázy, trichostatin A (TSA, 0,3 umol /l), alebo kombinácia týchto dvoch liečiv. bunky KATO-III s podávaním nízkej dávky 5-aza-CdR vykazovali up-regulácia klastra MIR-224 /-452, zatiaľ čo TSA sám nespôsobil up-regulácia. Cluster MIR-224 /-452 sa synergicky up-regulované v bunkách KATO-III v kombinácii s 5-aza-CdR a spracovanie TSA (obr 1D). Tieto výsledky naznačujú, že mier-224 a mier-452 môže byť down-regulované prostredníctvom metylácie DNA v GC bunkové línie, ako je rovnaké transkripčné jednotke.

Bolo zistené, že intronové miRNA sú regulované pomocou metylácie promótorom hostiteľskej gény [14], [15]. Podľa výsledkov počítačovej analýzy MIR-224 /-452 klastra a Mir-340 sa nachádza v intronom 6 vo Gabre stroje a intronom 2 do RNF130
, v danom poradí, z ktorých oba obsahujú husté CPG ostrovov iba v promotorových oblastiach svojich hostiteľských génov (Obrázok 2A a C). Skúmali sme vzťah medzi expresiou týchto miRNA a metylačného statusu hostiteľských génov v bunkových líniách GC analýzou MSP. GC bunkové línie bez MIR-224 expresie vykazovali iba metylácie signály, zatiaľ čo expresia pozitívnych bunkových línií vykazovala silné unmethylation vzory (obrázok 2B). Podobný vzťah bol zistený pre mier-340 v bunkových líniách GC (Obrázok 2D). Tieto údaje naznačujú, že expresie týchto miRNA v bunkových líniách GC môže byť umlčaný prostredníctvom metylácie promótorom svojich hostiteľských génov.

epigenetické Regulované miRNA môže súvisieť GC bunkovej proliferácie

Ak chcete zistiť, či epigenetické regulované miRNAs sú tumor potláčajúce alebo nie, Hodnotili sme účinok 5-aza-CdR vo siDICER1-transfekciou KATO-III a DICER1 KO HCT116 (D1KO) buniek (Obrázok 4A). Neošetrené KATO-III a rodičovskej HCT116 bunky vykazovali so spomalením proliferácie po liečbe s 5-aza-CdR. Na druhej strane, v siDICER1-transfekciou buniek KATO-III a D1KO, účinok 5-aza-CdR spracovanie na bunkovú proliferáciu sa stal slabý v oboch prípadoch. Tieto výsledky naznačujú, že účinok 5-aza-CdR bola znížená na nízke alebo nulové DICER1 buniek, a že epigenetické regulované miRNA zohrávajú dôležitú úlohu v GC a buniek CRC.

Na účely analýzy vzťahu medzi týmito miRNA a 13 cieľové gény uvedené v tabuľke S2, sme sa transfekované bunky KATO-III s siDICER1 a /alebo spracuje s 5-aza-CdR. Aj keď expresia 3 ( DPYSL2
, KRAS stroje a MECP2
) zo 13 génov boli znížené po 5-aza-CdR spracovanie, expresie týchto génov urobil nezmení na 5-aza-CdR spracovanie s následným transfekcia siDICER1 (Obrázok 4B).

Kombinačné transfekcia Mir-224 a -452 Potlačené GC Cell proliferation

transfekovány sme bunkové línie s GC Mir-224 a /alebo -452 napodobňuje ako zástupca miRNA klastrov, alebo negatívne kontrolou, a potom vykonáva vo vode riešený tetrazolium-8 testy (WST-8). Sedemdesiatdva hodín po transfekciu, sme pozorovali, že ektopická expresia MIR-224 alebo -452 potlačil rast dvoch bunkových línií, KATO-III a AGS (Obrázok 5A). Pozoruhodne, kombinačné transfekcia Mir-224 a -452 napodobňuje značne znížil rast dva GC bunkových línií (Obrázok 5A).

Mir-224 /-452 Cluster kooperatívne znížená expresia DPYSL2 stroje a KRAS

Ak chcete zistiť, či je alebo nie je cluster MIR-224 /-452 je vlastne súvisí s reguláciou DPYSL2 stroje a KRAS
sme analyzovali expresiu DPYSL2
po transfekciu buniek KATO III-a AGS s Mir-224 /-452 klastra, samotné alebo spoločne. Vykonali sme RT-PCR a Western blot analýzy. DPYSL2 stroje a Kras
hladiny mRNA boli znížené po transfekciu s Mir-224 alebo MIR-452 mimických (obrázok 5B). Je zaujímavé, že v prípade, že kombinačné transfekcia s Mir-224 a -452, expresie týchto cieľových génov bola ďalej down-regulované (obrázok 5B). Nadol-regulácia DPYSL2 bol tiež pozorovaný na úrovni proteínov v oboch bunkových líniách (obrázok 5C). Tiež sme skúmali úrovne expresie ďalších piatich génov, MECP2, MYC, Junbo, MUC1 stroje a SETDB1
, ktoré neboli uvedené ako ciele pre mier-224 alebo -452 strany TargetScan. Ako sa dalo očakávať, žiadne výrazové zmeny týchto piatich génov boli nájdené v bunkách KATO-III po transfekciu s Mir-224 a -452 (obr S2). Tieto údaje naznačujú, že mier-224 a -452 špecificky down-regulované DPYSL2 stroje a KRAS
.

DPYSL2
bola spojená s GC bunkovej proliferácie

Sledovali sme účinok Vyradenie DPYSL2
, ktoré bolo preukázané, že terčom klastra MIR-224 /-452, na proliferáciu buniek. Transfekcia DPYSL2
siRNA zreteľne znížilo hladiny DPYSL2
prepisy (obrázok 5D) a inhibuje rast buniek AGS a KATO-III 72 hodín po Vyradenie DPYSL2
(obr 5E), čo naznačuje, že DPYSL2 má onkogénne aktivitu.

Kombinačné transfekcia Mir-340 a -181c Potlačené GC množenia sa a indukované down-reguláciu KRAS
a MECP2
Expression

Ako druhý príklad viac-to-násobok vzťahov medzi mikroRNA a cieľových génov sme analyzovali vzťah medzi MIR-340 /-181c a KRAS /MECP2 .
Pri Mir-340 a mier-181c boli transfekovány do buniek KATO-III, množenia bola synergicky down-regulovaná dvoma miRNA (obrázok 6A). Ak chcete zistiť, či epigenetické regulované MIR-340 a mier-181c kooperatívne ovplyvniť ich ciele, sme analyzovali hladiny mRNA KRAS stroje a MECP2.
On RT-PCR analýzy KRAS stroje a MECP2
bolo zistené, že down-regulované MIR-340 a mier-181c sám, alebo kombinačné transfekcia v bunkách KATO-III (obrázok 6B). Pokiaľ ide o štyri gény, MYC, Junbo, MUC1 stroje a SETDB1
, nevykazujúce žiadne predpokladané miesta pre tieto dve miRNA podľa TargetScan, že hladiny expresie neboli zmenené v tejto štúdii. Reprezentatívne údaje sú uvedené na obrázku 6B. To znamená, že účinky Mir-340 a -181c môžu byť špecifické pre ich spoločné cieľových génov, ako aj Mir-224 a -452.

Expresia a Metylácia Stav Mir-224 a -340 v primárnej GC Puzdrá

skúmali sme metylačného statusu Mir-224 a -340 v primárnych prípadov GC. boli zistené methylata vzorca Mir-224 v 15 z 26 (57,7%), primárne GC tkanív (Obrázok 7A a tabuľka 1). Spárovaný non-rakovinové žalúdočnej sliznice sotva vykazovali metylačnej vzorec MIR-224. Ďalej sme skúmali kvantitatívne hladiny Mir-224 v primárnych GC tkanív a zodpovedajúce bez rakoviny sliznice pomocou TaqMan RT-PCR. Významné zníženie MIR-224 expresie v tkanivách GC bola pozorovaná u prípadov rakoviny metylácie-pozitívnych v porovnaní s tie metylácie-negatívne a bez rakoviny žalúdka sliznice (obrázok 7C).

ďalej analyzujú DPYSL2
hladiny mRNA v porovnaní s metylačného statusu Mir-224 v GC tkanivách: GC s Mir-224 metylácie (Ca MIR-224 MT), GCS s Mir-224 unmethylation (Ca MIR-224 Un) a non -cancerous tkaniva s unmethylation (N MIR-224 UN). DPYSL2
hladiny mRNA v skupine "Ca Mir-224 Mt" bola výrazne vyššia ako v "N Mir-224 UN" a "Ca Mir-224 UN" skupiny, p = 0,049 a p = 0,035, v danom poradí (obrázok 7D). Tak, existuje vzájomný vzťah medzi metylačného statusu Mir-224 a DPYSL2
expresiu v tkanivách GC.

Metylácia frekvencie MIR-340 bol v testovaných primárnej GC tkanivách relatívne nízka (4 z 26., 15,4%) (obrázok 7B a tabuľka 1), zatiaľ čo žiadny z 26. spárovaná non-rakovinové žalúdočnej sliznice vykazovala zjavné metylácie vzory MIR-340. Pokiaľ ide o MIR-152 metylačnej analýzu, snažili sme sa tri sady primérov navrhnutých v oblasti proti smeru MIR-152, ktoré obsahujú CPG ostrovov (obr S1), ale žiadna z nich úplne uzatvorený MIR-152 výraz MSP analýzy (dáta nie sú uvedené).

Diskusia

aj keď bolo popísané, že expresia niektorých miRNA sa znižuje u niekoľkých nádorov prostredníctvom metylácie DNA, väčšina z týchto správ je popísané, že vzťah medzi aberantne expresiou miRNA a jeho cieľových génov bola one-to-one, one-to-násobok alebo viac ku jednej. Ak chcete preskúmať možnosť viacnásobných-to-násobok vzťahov medzi miRNA a ciele v rakovinových bunkách, sme sa zamerali na dvoch kombináciách miRNA v GC buniek, Mir-224 /-452 klastra a Mir-181c a -340, v tejto štúdii , Zistili sme, že dve sady miRNA Mir-224 a -452 a Mir-181c a -340, mal viac cieľových génov, DPYSL2 stroje a KRAS stroje a KRAS stroje a MECP2
, v danom poradí, a synergicky znížili proliferáciu buniek v ľudských bunkových líniách GC. Je pozoruhodné, že onkogén, KRAS
[16], bolo zistené, že cielená štyrmi miRNA, aj keď kandidát väzbového miesta štyroch miRNA sa líšia v 3'-UTR KRAS
(TargetScan). Máme už bolo skôr oznámené, že mier-181c down-regulované NOTCH4
príliš [13]. Tak, viac k viac vzťahov medzi miRNA a cieľov boli indikované nielen databázy analýz, ale tiež transfekční pokusy zahŕňajúce ľudské bunky.

GC bunkové línie Mir-224- a /alebo -340-výraz-negatívnych vystavené hypermetylace signály na analýze MSP a expresie Mir-224 a -340 obnovená na liečbu demetyláciou agenta. Okrem toho hypermetylace z Mir-224 a -340 bola častejšie pozorovaná v primárnych GC ako zodpovedajúca nenádorové sliznice. V MIR-224 metylácie-pozitívnych prípadov, expresie MIR-224 bola výrazne nižšia ako v tie metylácie-negatívny. Tieto údaje jasne ukazujú, že aberantne DNA metylácie je jedným z hlavných mechanizmov, na ktorých down-reguláciu MIR-224 a -340 do GC buniek.

Ukázali sme, že inhibícia miRNA spracovanie siDICER1 transfekcia alebo pomocou DICER1 knockout buniek znížil účinok 5-aza-CdR, to znamená, že sa znížila proliferácia buniek a down-reguláciu cieľových génov, v GC a buniek CRC. Bolo oznámené, že hojnosť DICER1, enzýmu, ktorý katalyzuje konečný krok miRNA zrenia, je priamo spojená s progresiou nádoru [17]. Tieto výsledky naznačujú, že aberantne regulácia miRNA zrenia prispieva k tvorbe GC a CRC.

Zistili sme, že klastra MIR-224 /-452 sa aberantne down-regulované v GC cez hypermetylace. Aberantne expresie MIR-224 bola tiež hlásená u iných nádorov. Expresie MIR-224, nech-7F a mier-516a je znížená u rakoviny vaječníkov, a synergicky regulujú expresiu kalikreín súvisiacich peptidázy 10 (KLK10) [18]. Mier-224 je down-regulovaná s metotrexátom rezistentné bunkové línie CRC v porovnaní s v citlivých bunkách [19]. Tu sa tiež ukázalo, že je stav metylácie MIR-224 bola v korelácii s DPYSL2
úrovni v ľudskom GC. Dohromady, mier-224 hrá dôležitú úlohu ako tumor potlačujúci miRNA v GC, ako aj v niekoľkých ďalších typov rakoviny. Na rozdiel od toho MIR-224 je up-regulovaná v hepatocelulárny karcinóm [20] a v porovnaní s normálnymi tkanivami medulloblastomas [21]. Preto sú potrebné ďalšie štúdie na objasnenie role Mir-224 v karcinogenéze.

Skúmali sme spoločných cieľov epigenetické down-regulované miRNA. DPYSL2
bolo preukázané, že je down-regulovaná MIR-224 a -452. DPYSL2 hrá dôležitú úlohu pri vytváraní neurónov polarity [22]. DPYSL2 sa tiež podieľa na dráhach, ktoré regulujú proliferáciu non-neurónových buniek prostredníctvom fosforylácie regulačnými proteínmi. DPYSL2 prechádza dynamické zmeny fosforylácie v reakcii na kontakt pokojového stavu a hyperfosforylaci inhibícia indukovanej DPYSL2 sa vyskytuje v nádore [22]. Hoci úloha DPYSL2 v GC nie je jasné, naše siRNA na báze Vyradenie DPYSL2 expresie indukuje zníženie proliferácie v obidvoch GC bunkové línie, čo naznačuje, onkogénne aktivitu DPYSL2.

Stručne povedané, naše zistenia ukazujú, že viac k-mnohým vzťahov medzi miRNA a cieľových génov skutočne existujú v GC. Je pravdepodobné, že aberantne metylácie znižuje expresiu rôznych nádorových potláčajúce miRNA, ako je MIR-224, -452, -340 a -181c, ktorý indukuje nadmernú expresiu mnohých onkogénnych génov, rovnako ako KRAS
DPYSL2 stroje a MECP2
. Tieto abnormálne viac-to-násobok vzťahy medzi miRNA a cieľov by bolo jedným z dôležitých mechanizmy žalúdočné rakoviny. Je teda vysoko pravdepodobné, že epigenetické lieky môžu normalizovať expresiu nielen tumor potláčajúce gény, ale aj viac nádorových potláčajúce miRNA, čo vedie k poklesu týchto abnormálnych viac-to-násobok vzťahov medzi miRNA a cieľov, a tak sa môže stať vynikajúce terapeutické lieky proti rakovine.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých subjektov, a etická komisia Tokyo lekárov a zubných lekárov University School of Medicine schválila tento výskum.

bunkové línie a tkanivové vzorky

študovali sme 9 GC bunkové línie (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 a GCIY), 2 CRC bunkové línie (HCT116 a DICER1
knock out HCT116 [23]), a 26 primárnych prípadov GC. MKN45, MKN74, TGBC11TKB a GCIY boli zakúpené z bunkovej banky Riken a KATO-III a AGS boli od ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 a HSC58 boli získané od Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 a HSC58 boli pestované v médiu RPMI 1640, a AGS, TGBC11TKB, GCIY a dve bunkové línie CRC v Dulbeccova modifikovanom Eaglovho média, minimálna esenciálne médium alebo McCoy 5A, doplnenom 10% fetálneho hovädzieho dobytka séra. Chirurgicky operaciindikováni vzorky od 26 pacientov s primárnou GC bolo náhodne získané z pridružená nemocnice School of Medicine, Tokyo lekárov a zubných lekárov University.

v analýze silico

odvolával sme do databázy GEO pre miRNA a profily génovej expresie (Gruz prístupové číslo GSE16006 a GSE2685). Použili sme tiež miRNA cieľovej databázy "TargetScan".

Drug ošetrenie buniek a RNA extrakčnej

demetylačných štúdiách boli bunky každý deň liečení 5 umol /l 5-aza-CdR (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) po dobu 72 hodín. Tiež ošetrené bunky s 0,3 pmol /l TSA sám, a s kombináciou 0,2 umol /l 5-aza-CdR a TSA. Celková RNA bola izolovaná pomocou TRIzolu činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA) alebo miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko).

Kvantitatívne v reálnom čase Reverse Transcription-polymerázovej reťazovej reakcie

v reálnom čase reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) analýzy boli vykonávané s použitím StepOne real-time PCR systém (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix sa ROX (Roche, Mannheim, Nemecko), A TaqMan Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), a TaqMan miRNA testov (Applied Biosystems) podľa inštrukcií výrobcu. Hladiny expresie miRNA boli vypočítané z množstva cieľovej miRNA pomere k RNU6B ako kontrola pre normalizáciu počiatočné vstup celkovej RNA.

Metylácia Analýza

bisulfitového DNA bola vykonávané s Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Metylácia špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (MSP) analýzy boli vykonané, ako bolo opísané skôr [26]. Tieto sekvencie primérov a veľkosti produktov PCR sú uvedené v tabuľke S3.

Syntetický miRNA transfekcia

buniek KATO III-a AGS boli transfekovány s prekurzorom molekuly napodobňujúce MIR-224, -452, -340 alebo -181c, alebo kódovaný sekvencií miRNA (Sigma) do konečnej koncentrácie 25-50 nmol /l pomocou elektroporátoru, neon (Invitrogen), podľa inštrukcií výrobcu. Na 24-72 hodín po transfekciu boli bunky zozbierané pre RT-PCR alebo analýzou Western blot.

Mobilné Test proliferácie bunky

MIR-mimetikum transfekciou KATO-III a AGS boli nanesené na 1 x 10 3 alebo 1 x 10 4 buniek na jamku na doskách s 96 jamkami. Bunková proliferácia bola hodnotená v dňoch 1-4 po transfekciu stanovením počtu buniek sa bunková proliferácia činidlá WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japonsko), podľa inštrukcií výrobcu.

miRNA Cieľová Predikcia a westernový prenos

predpovedané ciele miRNA a ich cieľových miestach boli analyzované pomocou TargetScan. Úrovne expresie mRNA z predpokladaných cieľov v prechodne transfekciou bunkách boli analyzované 24 hodín po transfekciu pomocou RT-PCR. Western blot analýzy boli vykonané, ako bolo opísané skôr [26]. Primárna protilátka bola použitá králičie anti-DPYSL2 (1: 500,Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Použili sme myšou anti-a-tubulín (1: 1000 Sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) ako vnútorná kontrola pre Western blotting. Sekundárne protilátky boli alkalickou fosfatázou konjugovanou anti-králičie IgG a anti-myší IgG (1: 2000 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Bloty boli vyvinuté s ImmunoStar AP substrátom (Bio-Rad Laboratories).

podporné informácie
Obrázok S1.
Schematické znázornenie COPZ2
oblasti obsahujúce MIR-152. Naplnené krabice predstavujú exóny COPZ2 stroje a prázdny rámik označuje nepreložené oblasti COPZ2
. Ohnutá šípka označuje počiatku transkripcie vo COPZ2
. Zvislá šípka označuje umiestnenie MIR-152. Zvislé čiary označujú CPG miest. Šípky označujú kontrolovaných regiónoch pre MSP
doi :. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Obrázok S2.
Vplyv transfekcia Mir-224 a -452 v bunkách KATO-III. RT-PCR analýzy po transfekciu s Mir-224 a /alebo -452. Expresie cieľových génov sa analyzovala 48 hodín neskôr pomocou RT-PCR. Mir-224 a -452 špecificky down-regulované DPYSL2 stroje a KRAS
, ale nie iné päť génov preskúmať, ktoré sú v súlade s výsledkami analýzy databázy (obrázok 3).
doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
tabuľke S1.
Expression profilovanie ľudských miRNA v bunkách KATO-III po liečbe 5-aza-CdR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Tabuľka S2.
Zoznam cieľových génov, ktorého expresia sme skúmali pomocou RT-PCR po liečbe s alebo bez 5-aza-CdR, a transfekcia s 20 nmol /l alebo kódovaný siDICER1 siRNA
doi :. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Tabuľka S3.
Sekvencia primérov použitých v tejto štúdii
doi: 10,1371. /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Poďakovanie

Radi by sme sa poďakovali Dr. Bert Vogelstein za poskytnutie DICER1 knock-out bunkové línie HCT116.

Other Languages