Ploche ONE: Superior protinádorovú aktivitu nanočastíc na albumín viazaného paklitaxelu v experimentálnom rakoviny žalúdka

abstraktné

žalúdka Rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiace celom svete a postráda vysoko účinnú liečbu pokročilého ochorenia. Pon-paclitaxel je nový mikrotubuly inhibičný cytotoxické činidlo, ktorá nebola testovaná v karcinómu žalúdka ako napriek tomu. V tejto štúdii, rakovina žalúdka u bunkové línie AGS, NCI-N87 a SNU16 boli študované. Pon-paclitaxel inhibuje proliferáciu buniek s IC50 5 nM v SNU16, 23 nM v AGS, a 49 nM v NCI-N87 buniek po 72-hodinovej spracovanie, ktoré bolo nižšie, než je oxaliplatiny (1,05 uM až 1,51 uM) a epirubicín ( 0,12 um do 0,25 um). Liečba pon-paclitaxel zvýšená expresia mitotického vretena spojený fosfo-stathmin, bez ohľadu na východiskovú celkového alebo fosforylovaného úrovni stathmin a indukovanú bunkovú smrť mitotické ako je potvrdené prostredníctvom zvýšenej expresie štiepené PARP a kaspázy-3. Po dvojtýždňovej pon-paclitaxel, oxaliplatina alebo epirubicínom, priemer in vivo lokálnu miery inhibícia rastu nádoru bola 77, 17,2 a 21,4 percent, v uvedenom poradí (p = 0,002). Účinky liečby na nádorové proliferácie a apoptózy indexov zodpovedal s dátami inhibíciu rastu nádoru, zatiaľ čo expresia fosfo-stathmin tiež zvýšila v tkanivách. Došlo k zvýšeniu mediánu prežitia zvierat po pon-paklitaxelu liečby (93 dní) v porovnaní s kontrolami (31 dní, p = 0,0007), oxaliplatina (40 dní, p = 0,0007) alebo liečby docetaxelom (81 dní, p = 0,0416) , Silná protinádorová účinnosť pon-paklitaxelu v experimentálnom karcinómu žalúdka podporuje takéto mikrotubulov inhibičný stratégie pre klinickú aplikáciu. Pon-paklitaxelu dávky boli pozorované nezávisle na fosforylovanej stathmin prejave na začiatku liečby, by bola spochybnená úvahy o použití pon-paklitaxelu u karcinómu žalúdka na základe tohto domnelého biomarkerov

Citácia :. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior protinádorovú aktivitu nanočastíc na albumín viazaného paklitaxelu v experimentálnom rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10,1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Veľká Británia

prijatá: 20.novembra 2012; Prijaté: 29. január 2013; Publikované: 27. februára 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod
rakovina

žalúdka (GC) je štvrtou najrozšírenejšou. rakovinu a druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete [1] - [3]. Väčšina pacientov majú pokročilé alebo metastatické ochorenie v čase diagnózy [4], [5]. Kombinácia oxaliplatiny a 5-fluorouracilu, s alebo bez epirubicínu, sa stal najpoužívanejším režimom v prvej línii chemoterapie pokročilého karcinómu žalúdka [6], [7]. Avšak, táto kombinovaná liečba má viesť k značným vedľajšie účinky a ešte nesie obmedzenú účinnosť, zatiaľ čo prognóza pacientov zostáva žalostný s mediánom prežitia približne 10 mesiacov [8] - [11]. V snahe zlepšiť prežitie a zníženie toxicity, molekulárne cielená liečba je aktívne skúmaný pre liečbu rakoviny žalúdka [12].

Microtubules už dlho považované za cieľ záujmu u niektorých protinádorových liečiv, pretože ich univerzálna úloha v proliferujúcich buniek a ich zásadnú úlohu v mitóze [13] - [15]. Paclitaxel a docetaxel sú klasické mikrotubulami inhibítory, ktoré vykonávajú svoju činnosť tým, že podporuje polymerizáciu tubulínu a stabilizáciu mikrotubulov, čo vedie G2-M fáze zastaviť a mitotické bunkovej smrti [15]. Mitotické bunková smrť je spôsob bunkovej smrti, vyskytujúce sa najmä v mitotických štádií indukovaných DNA poškodzujúce činidlá a jedov vretena /mitotické inhibítory [16], [17]; to je hlavne kaspasy závislá, ale za výnimočných okolností môže byť tiež kaspázy nezávislé [18]. Paclitaxel bol testovaný pre pokročilých a recidivujúcich karcinómov žalúdka, s rýchlosťou odozvy o 43% v kombinácii s 5-fluóruracilom a kyselinou listovou [9], [19]. V porovnaní s mierou odozvy 38 ~ 45% výnosov z kombinácií oxaliplatiny s 5-fluóruracilom a kyselinou listovou, paclitaxel neviedlo k vynikajúcej prežitie, ale spôsobené ďalšie vedľajšie účinky, a to najmä u starších pacientov, [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel potrebné emulgácia s rozpúšťadlami, aby vnútrožilovom podaní, ktorá vyústila v hypersenzitívne reakcie a potenciálne dramatické nežiaduce účinky u pacientov [23], [24]. Nanočastice na albumín viazaného (pon) paclitaxel je nový albumín stabilizovaného, ​​Cremophor-free a vo vode rozpustné formulácie nanočastice paklitaxelu. Je dobre tolerovaný, bez reakcie precitlivenosti po intravenóznej infúzii [25]. Klinické a experimentálne štúdie preukázali, že v porovnaní s paklitaxelom na báze rozpúšťadla, pon-paclitaxel majú vyššiu retenciu tumoru, nižšiu toxicitu [23], [26] a ďalšie silné protinádorové účinky na rakovinu prsníka, nemalobunkový karcinóm pľúc (NSCLC), pankreasu rakovina, melanóm a karcinóm hlavy a krku [27] - [31]. Avšak potenciálny úloha pon-paklitaxelu v nádorových bunkách žalúdku nie je testovaný ako napriek tomu

stathmin, je mikrotubulami destabilizujúci fosfoproteínov, je dôležitým regulátorom polymerizáciu mikrotubulov a dynamiky [32] - [34]. a bolo zistené, že v súvislosti s odporom taxánmi, u niektorých typov nádorov prostredníctvom zmenou liek väzby a oddialenie G2-M prechod fázy [33], [35]. inhibícia stathmin mala synergický antiangiogenetické a protinádorovou účinnosť s taxolu [36]. Bolo zistené, stathmin výraz, ktorý má byť prítomný v celej rade ľudských nádorov, vrátane rakoviny žalúdka, a preto môžu predstavovať atraktívny cieľ pre liečbu rakoviny [34], [37], [38]. Jeon et al. zistené, že stathmin by mohlo slúžiť ako prognostický marker a potenciálny terapeutický cieľ pre karcinómu žalúdka [37]. Fosforylácie stathmin znižuje jeho microtubule destabilizujúci účinok, čo je jav, ktorý bol tiež pripisuje taxánmi, aktivity [34].

Táto štúdia hodnotila protinádorovej aktivity pon-paklitaxelu u ľudských buniek karcinómu žalúdka in vitro a in vivo. Porovnávali sme protinádorovú účinnosť pon-paklitaxelu na iné cytostatikami na miestnej rastu nádoru a prežitie zvierat. Merali sme tiež vyjadrenie celkovej stathmin a fosfo-stathmin in vitro a in vivo s cieľom posúdiť ich úlohu ako prediktívnych markerov v pon-paclitaxel protinádorové reakcie.

materiáloch a metódach

bunkové kultúry a činidiel

rakovina žalúdka u bunkové línie AGS, NCI-N87 a SNU16 boli získané z American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) a kultivované v médiu RPMI 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ), doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (FBS) pri 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére. Pon-paclitaxel bol zakúpený od Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatina bola zakúpená od Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicín a 5-fluorouracil bola získaná z miestnej lekárne. Bunková proliferácia činidlo WST-1 bol získaný od Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

Životaschopnosť buniek Test

Životaschopnosť buniek bola hodnotená pomocou kolorimetrického WST-1 test. Meranie je založené na schopnosti životaschopných buniek na štiepenie tetrazoliové soli sulfónované WST-1 (4- [3- (4-jodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazóliom] -1, 3- benzén disulfonát) mitochondriálnej dehydrogenases [39]. Žalúdočné rakovinové bunky (5.000 buniek na jamku) boli nanesené na 96-jamkové doštičky v pravidelnom rastovom médiu a boli ošetrené pri použití pon-paklitaxelu, 5-fluorouracil, oxaliplatinu a epirubicín po 16 hodinách inkubácie. Rozsah koncentrácií použitý (1 nM až 10 uM) bola porovnateľná s ich klinicky dosiahnuteľných koncentráciách. Po ďalšej inkubácii 72 hodín, 10 ul WST-1 činidlo sa pridá do každej jamky a nasleduje inkubácia po dobu 2 hodín. Absorbancia pri 450 nm bola meraná pomocou readeru.

bunkového cyklu analýza

Analýza bunkového cyklu bola vykonaná pomocou prietokovej cytometrie s fluorescenčné propidium jodidu (PI) farbenie. Bunky boli kultivované a spracuje sa s pon-paclitaxel, oxaliplatina, epirubicínu a docetaxelu po dobu 8 až 24 hodín. Bunky potom boli odobraté a fixované v 75% zmesi etanol-PBS cez noc pri -20 ° C. Bunky boli centrifugovány po dobu 5 minút pri 2000 x g. Bunková peleta sa resuspendujú a inkubované v 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100 a 1 mg /ml RNase A v PBS po dobu 45 minút pri teplote miestnosti. Takto získaná suspenzia bola potom analyzované na Becton Dickinson FACScan. Pomer buniek v sub-G1, G1, S a G2-M fázy bunkového cyklu bolo stanovené ich obsahu DNA.

Imunocytochemická analýza

žalúdočné rakovinové bunky (1 x 10 ^{5 buniek na jednu komoru) boli umiestnené v 4-komornej snímku v pravidelnom rastovom médiu. Po 24-hodinovom boli bunky ošetrené pri použití pon-paclitaxelu počas 16 hodín a potom fixované v 4% paraformaldehydu. Bunky boli inkubované s CAS blokujúcim pufrom a následne 1-hodinové inkubácii s fosfo-stathmin protilátkou (1: 100) a 40 minútach inkubácie s Cy3 (1: 200 zriedenie) sekundárnou protilátkou. Sklíčka bola namontovaná pomocou montážneho roztoku obsahujúceho 4 ', 6-diamidínov-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescenčné mikroskopia bola použitá na detekciu fluorescenčných signálov pomocou mikroskopu IX81 Olympus vybavený Hamamatsu Orca digitálneho fotoaparátu (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot analýza

Sub-konfluující buniek boli ošetrené s pon-paclitaxel, oxaliplatina a epirubicín. Fragmenty buniek a nádorové lyzáty boli získané ako bolo opísané skôr [40]. Supernatanty boli získané centrifugáciou pri 13000 otáčkach za minútu, sa merali koncentrácie bielkovín a rovnaké množstvo celkového proteínu boli oddelené pomocou SDS-PAGE. Proteíny boli prenesené na PVDF membrány (Bio-Rad, Hercules, CA) a membrány boli blokované po dobu 1 hodiny v TBS-T. Membrány sa inkubujú cez noc pri 4 ° C s nasledujúcimi protilátkami: Celkom stathmin, fosfo-stathmin (ser38), štiepi poly (ADP-ribóza) polymerázy-1 (PARP-1), štiepená kaspázy-3 (všetko od Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubulín a β-aktínu (obaja od firmy Sigma, St. Louis, MO). Membrány potom boli inkubované so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami HRP-konjugovanou (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) po dobu jednej hodiny. Špecifické pásy boli detekované pomocou rozšírenej chemoilluminescence činidlo (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) na autorádiografickej filmu.

Podkožný rast nádoru štúdie

Všetky pokusy na zvieratách boli vykonané v súlade s pokyny a schválené protokoly z University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) inštitucionálnej starostlivosti o zvieratá a používania výboru (povolenie číslo 2012 - 0081). Zvieratá boli denne sledovaná po celú dobu experimentu na akékoľvek známky úzkosti. Samice myší SCID (6 až 8 týždňov) boli použité pre porovnávacie modelovanie podkožný rastu nádoru. Žalúdočné rakovinové bunky (10 x 10 ^{6 NCI-N87 alebo 20 × 10 6 SNU16 bunky) boli podkožne vstrekne do každej myši. Myši boli odvážené dvakrát týždenne. Štrnásť dní po injekcii nádorových buniek, sú všetky myši mali merateľný nádor (stredná veľkosť nádoru 100 až 150 mm 3). Myši potom boli náhodne zoskupené (n = 6 ~ 8 na skupinu) a intraperitoneálne liečených PBS (kontrola), pon-paclitaxel (10 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne), oxaliplatina (5 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát za týždeň), a epirubicín (1 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne) počas 14 dní. Veľkosť nádoru sa meria dvakrát týždenne pomocou posuvného merítka a objem nádoru (V) bol vypočítaný podľa vzorca V = a pol [L x (W) 2], L = dĺžka a W = šírka. Relatívny objem nádoru (RTV) sa určí podľa vzorca RTV = V _{n /V 0, kde V 0 a V 1 predstavuje objem nádoru v deň 0 a následný deň merania, resp. Miera inhibícia rastu nádoru bola vypočítaná podľa vzorca (1-RTVt /RTVC) x 100%, kde t a C predstavujú spracovanie a kontrolnú skupinu. Po ukončení liečby, boli všetky myši usmrtené CO2, nádory boli vyňaté, zvážené, členitý a spracované pre histologické, imunohistochemických a blot analýzou Western.}}

imunohistochemická analýza

tkanivové vzorky nádorov boli stanovené 4% paraformaldehydu a vložené do parafínu. Intratumorová proliferácia bola meraná farbením nukleárna antigén Ki67 podľa protokolu výrobcu (abca, Cambridge, MA). Parafínových tkanivové rezy boli narezané (5 um), deparafinizovány, rehydratuje a antigén vyvolané. Rezy tkanív boli inkubované s CAS blokujúcom pufri s následnou 1 hodinovou inkubáciou s 1: 200 riedenie primárneho Ki67 alebo fosfo-stathmin protilátky (1: 200) a 40 minútach inkubácie s Cy3 (1: 200 riedenie) sekundárnej protilátky. Sklíčka bola namontovaná pomocou montážneho roztoku obsahujúceho 4 ', 6-diamidínov-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen). Intratumorová proliferačnej index a stathmin aktivita bola hodnotená na základe výpočtu pozitívnych buniek z piatich rôznych vysoko výkonných polí (HPF) v naslepo. Intratumorová proapoptotický aktivita bola hodnotená farbením tkanivovej rezy s "Apoptag apoptózy Detection Kit" podľa (Millipore) pokynov výrobcu. Fluorescenčné mikroskopia bola použitá na detekciu fluorescenčných signálov pomocou mikroskopu IX81 Olympus vybavený Hamamatsu Orca digitálneho fotoaparátu (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) a Dohody pradenie konfokálna jednotky pomocou softvéru Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

prežitie zvierat analýza

štúdie prežitie na zvieratách boli vykonané pomocou 6 až 8 týždňov starých samíc SCID myší [41]. Myši boli intraperitoneálne injektované SNU16 (40 x 10 ^{6) bunky a telesná hmotnosť bola meraná dvakrát týždenne. Tri týždne po injekcii nádorových buniek boli myši náhodne rozdelené (n = 6 až 8 na skupinu).}

V prvej štúdii prežitia myší bol podávaný intraperitoneálne PBS (kontrola), pon-paclitaxel (10 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne), a oxaliplatina (5 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne) po dobu 2 týždňov. V druhej štúdii prežitia myší bol podávaný intraperitoneálne PBS (kontrola), pon-paclitaxel (10 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne), docetaxel (3 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne ) alebo oxaliplatina (5 mg /kg v 100 ul PBS, 2 krát týždenne) po dobu 2 týždňov. utrpenie zvierat bola znížená o euthanizing pri otáčaní umierajúce podľa vopred stanovených kritérií, vrátane rýchle chudnutie alebo zisk (viac ako 15%), neschopnosť jesť alebo piť, letargia, neschopnosť zostať vo vzpriamenej polohe a nedostatok sily. Prežitie zvierat bola hodnotená od prvého dňa liečby až do smrti.

Štatistická analýza

Analýza prežitia bola hodnotená s GraphPad Prism Software 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro bunky sú údaje proliferácie vyjadrené ako stredná ± štandardná odchýlka. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou ANOVA pre porovnanie viacnásobné skupiny a Študentov t-test pre individuálnu porovnávacej skupine. porovnávacia skupina prežitie bolo vykonané pomocou log-rank testu v rámci analýzy typu Kaplan-Meier. Hodnoty p menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné rozdiely predstavujú skupinu

Výsledky

stathmin expresiu v rakovinových bunkách žalúdku

Analýza ľudského žalúdka rakovinových buniek AGS, NCI. N87 a SNU16 odhalilo, že všetky tri riadky vyjadril stathmin. Žiadny rozdiel celkovej expresie stathmin bol nájdený medzi týmito tromi bunkovými líniami. Expresie fosfo-stathmin pohybovala medzi bunkovými líniami, v nasledujúcom poradí: SNU16 > AGS > NCI-N87 buniek (obrázok 1A).

Nab-paclitaxel inhibuje proliferáciu rakovinových buniek žalúdočnej

Nab-paclitaxel inhibuje žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek do spôsobom závislým od dávky, a inhibícia proliferácie buniek sa objavil nasledovať rovnakom poradí ako výraz fosfo-stathmin (obrázok 1B). Pri 100 nM koncentráciu inhibícia v bunkovej proliferácii bol 94,5, 66,7 a 41,8 percenta v SNU16, AGS a NCI-N87 buniek resp. Pon-paclitaxel ukázal najvyššiu antiproliferatívne účinnosť s najnižšej účinnej dávky, ako je v 3 testovaných bunkových líniách v porovnaní s 5-fluouracil, oxaliplatinu a epirubicín. IC _{50 pon-paklitaxelu bola 5 nM v SNU16, 23 nM v AGS, a 49 nM v NCI-N87 buniek, čo bolo menej ako 5-fluouracil (6,46 uM v SNU16, > 10 uM v AGS a 10,2 uM v NCI-N87 buniek), oxaliplatina (1,51 uM v SNU16, 1,64 uM v AGS a 1,05 uM v NCI-N87 buniek), alebo epirubicín (0,12 uM v SNU16, 0,16 uM v AGS a 0,25 uM v NCI-N87 buniek) ( obrázok 1C).}

Nab-paclitaxel indukuje G2 zástavu a mitotické bunkovej smrti in vitro

Ak chcete zhodnotiť základný mechanizmus inhibícia rastu o pon-paklitaxelu, profil bunkového cyklu bol analyzovaný. Ako je ukázané na obrázku 2A, pon-paclitaxel (100 nM) viedlo G2-M zastavenie bunkového cyklu v bunkách SNU16. Percento propidiumjodidom pozitívnych buniek v G2-M fáze zvýšil z 35,6 do 71.6 po 100 nM pon-paklitaxelu spracovania po dobu 12 hodín. Podobné zmeny nastali v AGS a NCI-N87 buniek s pon-paklitaxelu a liečby docetaxelom, ale nie s oxaliplatinou a liečbou epirubicínom (obr S1 a S2).

Vplyv pon-paklitaxelu na mitotické bunkovej smrti, expresie fosfo -stathmin a proteínov apoptózy súvisiace bola meraná immunocystochemistry a Western blot. Pon-paclitaxel zaobchádzanie spôsobilo narušenie mikrotubulov a mitotické zatknutie v rakovinových bunkách žalúdku ako uvádza jadro fragmentácie a karyopyknosis (obrázok 2B). Expresie fosfo-stathmin sa zvýšila potom, čo pon-paklitaxelu liečby, a vyššia expresia fosfo-stathmin bola spojená s väčšou mierou mitotických zastaví, fragmentácii jadra alebo karyopyknosis a bunková smrť (obr 2b a 2c). Nukleárna fragmentácia a karyopyknosis došlo v 16,7% buniek s nízkou expresiou fosfo-stathmin, ale v 95,7% buniek s vysokou expresiou fosfo-stathmin (r = 0,672, p 0,001). Tam bol tiež dôkaz pre časovo závislé zvýšenie expresie fosfo-stathmin podľa pon-paklitaxelu liečbe (obrázok 2D).

Skúmali sme, či smrť mitotické bunky indukované pon-paklitaxelu mohla byť sčasti v korelácii s indukciou apoptózy , Vyhodnotenie PARP-1 a štiepenie kaspázy-3 a štiepenie ako markerov indukcie apoptózy bolo zistené, že v rakovinových bunkách žalúdočnej pon-paclitaxel, oxaliplatina a epirubicín liečenie spôsobil zvýšenie expresie oboch štiepená PARP-1 a kaspasy-3. Tento výraz proteínov apoptózy súvisiace sa objavili vyššie po pon-paklitaxelu liečby v porovnaní s oxaliplatinou alebo epirubicínu ošetrenie (obr 2E).

Nab-paclitaxel inhibuje rast rakovinových žalúdočných xenoimplantátů

in vivo protinádorové účinky pon-paklitaxelu bola hodnotená v myšiam modeli s xenoštěpem s použitím SNU16 buniek. Pon-paclitaxel liečby v dávke 10 mg /kg dvakrát týždenne počas dvoch týždňov bola dobre tolerovaná bez zjavných príznakov toxicity ako možno súdiť podľa hmotnosti u myší a denné vyhodnotenie. Po ošetrení dvojtýždňovej, pon-paclitaxel liečba viedla k štatisticky významnému inhibícia rastu nádoru (p = 0,0004), ktorá je väčšia ako tie, ktoré oxaliplatiny (p = 0,0361) a epirubicín (p = 0,032) v porovnaní s kontrolnou nosič (obrázok 3A). Miera inhibícia rastu nádoru po 2-týždňovej ošetrenie s pon-paclitaxel, oxaliplatina a epirubicín bol 77, 17,2 a 21,4 percent (p = 0,002), v danom poradí. Iba pon-paclitaxel ošetrenie vytvoril zníženie veľkosti podkožných lézií v porovnaní s ich vopred stanovenej veľkosti nádoru. Priemerná hmotnosť nádoru bola v porovnaní s nosičom významne znížila pôsobením pon-paclitaxelu (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), liečenie, ale nie oxaliplatiny (0,408 ± 0,12 g) alebo epirubicín (0,46 ± 0,172 g) konaní, v tomto poradí (obrázok 3A). Tiež sme hodnotila protinádorové účinky pon-paklitaxelu na NCI-N87 xenografe myšiach lokálnych nádorov. Po dvoch týždňoch liečby, pon-paclitaxel liečba viedla k významnej inhibícii nádorového objemu (p = 0,0023) (obrázok 3B) a miera inhibícia rastu nádoru bola 72,8 percenta. Priemerná hmotnosť nádoru v skupine liečenej pon-paklitaxelu bola významne nižšia ako v skupine s nosičom (0,093 ± 0,026 g oproti 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (obrázok 3B). K žiadnej významnej zmene telesnej hmotnosti myší bola pozorovaná v žiadnom z pon-paclitaxel, oxaliplatina alebo epirubicín terapiami.

Nab-paclitaxel indukuje mitotické bunkovej smrti in vivo

mechanizmov in vivo protinádorovú aktivitu pon-paclitaxel boli ďalej skúmané v nádorových tkanív získaných z SNU16 a NCI-N87 xenoimplantátů. Významný nárast expresie fosfo-stathmin bola pozorovaná u SNU16 (Obrázok 4A) a NCI-N87 (Obrázok 4B) štepov tumorov pri liečbe pon-paklitaxelu oboma Imunohistochemické a Western blot analýzy.

Tumor tkanivo od myší ošetrených pon-paklitaxelu vykazovali zníženú nádoru bunkovej proliferácie rýchlosť. Ki67 expresie na báze intratumorová proliferačnú index sa znížil o 90,7% (p = 0,001) v porovnaní s kontrolnou skupinou v pon-paklitaxelu skupine liečenej, oproti 72,6% (p = 0,004) v skupine liečenej oxaliplatinu a 67,7% (p = 0,003 ) v skupine liečenej epirubicínu (Obrázok 5A). Pon-paclitaxel spôsobené silnejší inhibičný účinok na proliferáciu nádorových buniek, ako oxaliplatina a epirubicínu.

Vyšetrenie apoptózy v nádorových tkanivách, sa zistilo, že indukcia v apoptotického indexu bola 7,9-krát v skupine pon-paklitaxelu (p = 0,013 ), 5,7-krát u liečených zvierat, oxaliplatina (p = 0,024), a 5,2-krát v skupine liečenej epirubicínu (p = 0,042) na základnej línie v kontrolnej skupine (obrázok 5B).

Nab-paklitaxelu zvyšuje prežitie zvierat

v prvej štúdii prežitie, medián prežitie SCID-NOD myší bola 24 dní v kontrolnej skupine. Táto zvýšená na 86 dní po pon-paklitaxelu liečby (p = 0,0004 oproti kontrolnej skupine, p = 0,0005 oproti skupine s oxaliplatinou), a 37,5 dní po liečbe oxaliplatinou (p = 0,0004 oproti kontrolnej skupine). Rozsah prežitie skupina bola tiež lepšia ako po pon-paklitaxelu liečby (v rozmedzí: 75 až 95 dní) v porovnaní s liečbou oxaliplatinou. (Rozsah: 34 až 41 dní) (obrázok 6A)

V druhej štúdii prežitie, medián prežitie SCID-NOD myší bola 31 dní v kontrolnej skupine. To sa zvýšil na 93 dní po pon-paklitaxelu liečby (p = 0,0007 versus kontrola a oxaliplatiny skupinu a p = 0,0416 vs. docetaxel skupiny), až 81 dní po ukončení liečby docetaxelom (p = 0.0007 versus kontrola) a na 40 dní liečba oxaliplatina (p = 0,038 verzus kontrolná skupina). Rozsah prežitie bola skupina 75 až 96 dní po pon-paklitaxelu liečby v porovnaní s liečbou docetaxelom (rozmedzie 74 až 93 dní) a liečbe oxaliplatinou (rozmedzie: 35 až 45 dní). (Obrázok 6b),

Diskusia

Pokročilá rakovina žalúdka je život ohrozujúce a predstavuje obrovskú výzvu liečby. Tradičné dvojlôžkové alebo trojlôžkové cytostatík režimy majú obmedzený účinok a môžu spôsobiť nežiaduce účinky a chemorezistenci [42] - [44]. Táto štúdia jasne ukazuje, že pon-paclitaxel má podstatne silnejší protinádorové účinky na žalúdočné nádorových bunkových línií, než v súčasnej dobe používajú cytotoxické látky oxaliplatinu a epirubicín in vitro a in vivo, namerané antiproliferatívny účinky, apoptóza, mitotické bunková smrť, lokalizovaná reakcie protinádorová a prežitie súvisiace na nádorovú záťažou.

In vitro štúdie ukázali, že pon-paclitaxel je vysoko účinný pri inhibícii bunkovej proliferácie ľudských bunkových línií žalúdočných ako oxaliplatina a epirubicínu. SNU16 bunky sú viac citlivé na pon-paklitaxelu ako NCI-N87 buniek. Niektoré štúdie zistili, že stathmin korelovala s odporom taxany a stathmin Knockdown môže zvýšiť citlivosť na taxán [33], [36]. Testovali sme expresiu stathmin a nezistili žiadny rozdiel medzi týmito tromi bunkovými líniami. Je zaujímavé, že keď sme skúmali expresiu fosfo-stathmin sme zistili, že schopnosť pon-paklitaxelu pre inhibíciu proliferácie buniek in vitro bola v rovnakom určenom poradí ako vyjadrenie fosfo-stathmin v týchto troch buniek karcinómu žalúdka: SNU16 > AGS > NCI-N87. Je to preto, že sa objavili na začiatku fosfo-stathmin expresie korelovala s pon-paklitaxelu účinnosti, požičiavanie nejakú podporu pre hypotézu, že fosfo-stathmin môžu slúžiť ako potenciálny biomarker predvídať pon-paklitaxelu reakcie protinádorovú v žalúdku liečbe rakoviny.

Uskutočnili sme xenotransplantátov štúdiu NCI-N87 na hodnotenie protinádorového účinku pon-paklitaxelu. Trochu neočakávane, pon-paklitaxel významne inhibovala NCI-N87 rast xenoimplantátu nádoru v porovnaní s kontrolnou skupinou. Tieto trochu rozchádzajú výsledky naznačujú, že in vivo protinádorový účinok pon-paklitaxelu u karcinómu žalúdka môže byť nezávislá na základnej expresie fosfo-stathmin alebo totálnej stathmin. Vzhľadom k tomu iba tri bunkové línie boli testované, nemôžeme urobiť jednoznačný záver o vzťahu medzi stathmin alebo fosfo-stathmin a pon-paclitaxel účinnosti u rakoviny žalúdka. Ďalší výskum sa stathmin zaklopal-out by mali byť užitočné touto otázkou zaoberať a skúmať úlohu stathmin ako biomarkeru pre pon-paklitaxelu účinnosti.

V tejto štúdii sme sa potom porovnajú protinádorové účinky pon paklitaxelu s oxaliplatinou a epirubicínu na SNU16 štepov miestnych nádorov. Pon-paclitaxel ukázal silnejší protinádorovú účinnosť než oxaliplatinou a epirubicín, ktorý by bol v súlade s výsledkov in vitro bunkovej proliferácie a proliferácie nádorových buniek tkanív a dát apoptózy. Hoci 5-fluouracil je najviac založená droga single-agent v chemoterapeutickej žalúdku onkologickej starostlivosti, odozva nádoru 5-fluóruracilu sú je údajne nedostatočne predpovedal v SCID myšiach modeloch až do bodu, kedy neboli pozorované dokonca žiadne protinádorové účinky [45]. Cisplatina a oxaliplatina, silnejší induktory apoptózy a tiež často používané pri liečbe rakoviny žalúdka chemoterapeutickej, boli vybrané častejšie ako činidlá na účely porovnania s novými látkami, ktoré sa majú testovať, [22] [45]. Na báze rozpúšťadiel paclitaxel má viac nežiaducich účinkov a nepridali výhody prežitie v porovnaní s oxaliplatinou v klinickej liečbe rakoviny žalúdka [22]. V našich štúdiách, oxaliplatina štatisticky nelíšia od epirubicínu. Preto volíme oxaliplatinu ako predvolené agenta v štúdii prežitia zvierat a zistil, že pon-paclitaxel zvýšil medián prežívania myši asi 40 dní po oxaliplatiny, čo je viac ako dvojnásobok účinok prevyšujúcej úroveň prostredníctvom oxaliplatiny. Docetaxel sa zdá byť viac aktívny taxán, s rýchlejším bunkového vychytávania a dlhšiu intracelulárnej retencie v porovnaní s paklitaxelom na báze rozpúšťadla [46]. Vykonali sme ďalšiu štúdiu prežitie pre porovnanie protinádorové účinky pon-paklitaxelu s docetaxelom a zistil, že stredná doba prežitia bola mierne predĺžená po pon-paklitaxelu liečby (93 dní vs 81 dní, p = 0,0416). Naše výsledky boli konzistentné s výsledkami nedávnej štúdie rakoviny prsníka fázy II, ktorá ukázala, že 100 mg /m ^{2 pon-paclitaxel mal dlhšie medián celkového prežívania (miera rizika 0,575, p = 0,008) v porovnaní s docetaxelom [47]. Na základe našich výsledkov, pon-paclitaxel ukázalo silnejší protinádorovú účinnosť v experimentálnej karcinómu žalúdka a zdá sa, predstavujú pomerne silný novej chemoterapeutickej činidlo pre klinickú liečbu rakoviny žalúdka.}

stathmin je dôležitým mikrotubuly mikrotubuly destabilizujúce fosfoproteínov. Ak je stathmin fosforylovaný, jeho mikrotubuly destabilizujúci aktivita poklesla [32], [34], a to môže zvýšiť citlivosť k taxany. Stathmin je fosforylovaný predovšetkým na cyklin-dependentné proteínkináza (CDK) väzobné miesto Ser38 v mitóze [32], a preto sme sa zamerali naše výraz analýzy na zvyšku ser38. Zistili sme, že pon-paclitaxel liečba zvýšenej fosfo-stathmin expresie in vitro a in vivo a korelovala s mitotických zastaví, nukleárna fragmentácie, karyopyknosis a mitotické bunkovej smrti. Mitotické bunkovej smrti došlo u týchto buniek s vysokou expresiou fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] zistili, že down-regulované stathmin expresiu génu po STMN1 porazený v pečeňové karcinóm pridal 7,7-násobné citlivosti na pon-paclitaxel a 2,7-násobné citlivosť na báze rozpúšťadiel paclitaxelový ale žiadnu citlivosť k doxorubicínu. Molekulárna charakter, ktorý vyvoláva bunkovú smrť v priebehu predĺženej mitózy zostáva zle definovaná [17], [32]. Vretenové montážne kontrolné stanovište dlho boli myšlienka hrať kľúčovú úlohu v tomto procese [48]. V tejto štúdii, pon-paclitaxel indukovanú fosforyláciu stathmin do buniek karcinómu žalúdka, ktoré sa očakáva, že k stabilizácii mikrotubulov zariadení, čo môže spôsobiť mitotické zastaví a spúšťacie bunkovú smrť. Aj keď sa jedná o skoré a predbežné údaje, z ktorých niektoré podporu pre reguláciu fosfo-stathmin pon-paclitaxel protinádorová aktivita bola pozorovaná a zaslúži byť ďalej vyhodnotené.

Na záver, táto štúdia ukazuje, že monoterapia pon-paclitaxel mal silnejší protinádorovú aktivitu v experimentálnych rakovinou žalúdka, než je aktuálna štandardná chemoterapeutík oxaliplatinou a epirubicínu, a zdalo sa, že je lepšia ako taxán v porovnaní s docetaxelom. Tento silný protinádorový účinok podporuje zdôvodnenie klinického hodnotenia pon-paklitaxelu ako sľubný mikrotubulov-inhibičné činidlo u karcinómu žalúdka.

podporné informácie
Obrázok S1.
Nab-paclitaxel vedie k G2-M fáze v zástave buniek karcinómu žalúdka. (A) Histogramy ukazujú profily bunkového cyklu AGS a NCI-N87 buniek v rôznych časových intervaloch po pon-paklitaxelu liečby. Žalúdočné rakovinové bunky boli kultivované po dobu 24 hodín a potom sa spracuje s 100 nM pon-paclitaxelu po dobu 12 hodín alebo 24 hodín. Analýza bunkového cyklu bola vykonaná pomocou prietokovej cytometrie. Zobrazené výsledky sú reprezentatívne z dvoch samostatných experimentov. (B) distribúcia bunkového cyklu u buniek karcinómu žalúdka liečených 100 nM pon-paklitaxelu. . Symbol * znamienka podmienky, za ktorých sa bunky rozpadla
doi: 10,1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Obrázok S2.
progresiu bunkového cyklu rakovinových buniek žalúdka liečených oxaliplatiny, epirubicínu a docetaxelu. (A) Histogramy ukazujú profily bunkového cyklu SNU16 a AGS buniek po podaní oxaliplatiny epirubicínu a liečby docetaxelom. Žalúdočné rakovinové bunky boli kultivované po dobu 24 hodín a potom sa spracuje s 10 uM pon-paclitaxel, oxaliplatina, epirubicínu a docetaxelu po dobu 8 hodín. Bunkového cyklu bola vykonaná pomocou prietokovej cytometrie. Zobrazené výsledky sú reprezentatívne z dvoch samostatných experimentov.

• Ploche ONE: Renovácia Mir-1228 * Expression Potláča epitelu mezenchymálnych prechod v žalúdočnej Cancer
• Ploche ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 polymorfizmus a karcinóm žalúdka Riziko: Meta-Analysis