Ploche ONE: RhoC Reguluje proti šíreniu Žalúdočné nádorových buniek prostredníctvom interakcie s IQGAP1

abstraktné

Naše predchádzajúce výsledky výskumu ukázali, že ako Ras homológnej člen rodiny C (RhoC) a IQ-domain GTPase aktivujúce proteín 1 (IQGAP1) boli nadmerne vyjadrený v žalúdočných rakovinových tkanív a buniek, ale ich role v tumorigenensis nebola jednoznačne určená. V tomto texte sme popísali proliferáciu stimulujúci účinok RhoC a IQGAP1 na buniek karcinómu žalúdka a interakciu medzi dvoma proteínmi pri regulácii proliferácie buniek karcinómu žalúdka. Plazmidy a vírusové konštrukty kódujúce cieľový siRNA a DNA boli použité k zmene expresie RhoC a IQGAP1. Spôsob MTT a inkorporácie BrdU test bol použitý pre analýzu účinku RhoC a rôzne štruktúry IQGAP1 na proliferáciu. boli zistené hladiny proteínovej IQGAP1 a RhoC v bunkových líniách pomocou Western blotting. Imunofluorescencie a koimunoprecipitačními testy boli použité k objavovaniu lokalizácia a väzba medzi RhoC a IQGAP1. Výsledky ukázali, že RhoC, IQGAP1 a C-koncový fragment IQGAP1 výrazne stimuloval proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, a zvýšenú expresiu cyklin E a cyklin D1. Naproti tomu, redukcia endogénneho IQGAP1 alebo RhoC o siRNA oslabené bunkovú proliferáciu. Vyčerpanie IQGAP1 expresia siRNA významne blokoval proliferačnej aktivity konštitutívne aktívny RhoC, zatiaľ čo RhoC tlmenie hluku podľa siRNA nemá žiadny vplyv na IQGAP1 indukovanú proliferáciu v nádorových bunkách žalúdka. Ko-Imunoprecipitácia a imunofluorescenčné testy ukázali, že RhoC a IQGAP1 viazané navzájom. Záverom možno povedať, naše výsledky naznačujú, že RhoC stimuluje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom prijímania IQGAP1 ako efektor

Citácia :. Wu Y, Y Tao, Chen Y, Xu W (2012) RhoC Reguluje proti šíreniu žalúdočnej rakovinové bunky prostredníctvom interakcie s IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10,1371 /journal.pone.0048917

Editor: Zoran Culig, Innsbruck lekárska univerzita, Rakúsko

prijatá: 26. júna 2012; Prijaté: 02.10.2012; Uverejnené: 07.11.2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bola podporená Specialized výskumného fondu pre vedúcich pracovníkov Program Jiangsu univerzity (č. 11JDG114) a Národná prírodná Science Foundation Číny (č. 31040002). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Rho GTPázy môže vyvolať určité intracelulárnu transdukciu signálu a vplyv rôzne bunkové aktivity, vrátane reorganizáciu aktinového cytoskeletu, génovej transkripcie, prežitie a proliferáciu [1], [2]. Aj keď tri Rho izoforiem, RhoA, rhoba a RhoC, vykazujú viac ako 85% identitu aminokyselín, ktoré udeľujú rozdiely v funkcie v bunkách, [3]. RhoA a RhoC proteíny bolo preukázané, že majú pozitívnu úlohu pri proliferácii a malígne transformácie [4], [5], [6], zatiaľ čo úloha rhoba v týchto procesoch sa zdá byť viac divergentné [7], [8]. Väčšina štúdií ukázala, že RhoC mal viac funkcií v nádorových metastáz, orchestrating pôsobenie niekoľkých následných efektorov, degradácia a rekonštrukcie extracelulárnej matrix (ECM). Zostáva však nejaký spor o úlohe RhoC v regulácii bunkovej proliferácie [9], [10] [11] [12]. Výsledky z hromady laboratórií ukázali, že RhoA a RhoC siRNA predstavujú účinné nástroje pre inhibíciu proliferácie rakovinových buniek, šíri rýchlejšie a angiogenézu ako in vitro stroje a in vivo
[9]. Sun et al
zistené, že intratumorální injekcie RhoA alebo RhoC siRNA do holých myší môžu inhibovať rast nádoru [13]. Na rozdiel od toho Faried et al
hlásil, že RhoA podporuje rast nádoru viac ako RhoC, zatiaľ čo RhoC vyvoláva vzdialenej metastázy v porovnaní s RhoA [11], v súlade s týmito pozorovaniami Clark et al [14]. Štúdia Ikoma a kolegovia ukázali, že RhoC neovplyvnil rast nádoru, ale zvyšuje metastatické povahu rakoviny pľúc stimuláciou pohyblivosť buniek [10]. Preto sa ďalšie štúdie potrebné na identifikáciu úlohu v regulácii RhoC biologickej aktivity nádorových buniek.

IQ-domain GTPase aktivujúci proteíny (IQGAPs) sú dôležitými regulátormi bunkových procesov, ktoré zahŕňajú cytoskeletární prestavby v migrácii buniek , množenia a cytokinesis [15], [16], [17]. IQGAP1 je jeden z členov z troch príbuzných cicavcov IQGAPs a meniace sa v intracelulárnej IQGAP1 expresie alebo funkcie je označená pre zmenu bunkovej aktivity [17], [18], [19], [20]. Ako lešenie proteínu, IQGAP1 viaže viac proteínov, ako je napríklad onkogénov beta-kateninu a Src, nádorové supresorové E-cadherinu a Rho GTPáz Cdc42 a Rac1, a spôsobí zmenu bunkovej správania, a to najmä na rakovinové bunky. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že vyššia vyjadrenie RhoC a IQGAP1 v žalúdočnej tkanive rakoviny významne spätne korelované s diferenciáciou žalúdočných nádorových buniek [21]. Okrem toho, že hladina proteínu boli tiež dôležité pre proliferáciu a migráciu nádorových buniek. Preto sme hypotézu, že obaja RhoC a IQGAP1 môže zohrávať dôležitú úlohu pri transformácii rakoviny a proliferáciu buniek a je tu potenciálne spojenie medzi nimi. V tomto výskume sme študovali vplyv RhoC a rôzne štruktúry IQGAP1 na proliferáciu nádorových buniek a bunkového cyklu príbuzných proteínov. Tiež sme skúmali vzťah medzi týmito dvoma molekulami spoločným použitím siRNA rušenia a vírusové infekcie technikou.

Materiály a metódy

Chemikálie

žalúdočné rakovina bunkové línie BGC-823 [22] a africkej zelenej opice obličkové bunkové línie fibroblastov COS-7 boli poskytnuté Institute of Cell Biology (Shanghai, Čína). Zeleného fluorescenčného proteínu (GFP) plazmid a transfekční činidlo bunka Lipofectamin ™ 2000 boli od Invitrogen (Carlsbad, CA); Plazmidy kódujúce Flag označené IQGAP1 (PFLAG-IQGAP1), Flag označené IQGAP1 C-terminálny fragment (PFLAG-IQGAP1-C) a Flag označené IQGAP1 N-terminálny fragment (PFLAG-IQGAP1-n) a adenovirových vektorov kódujúcich beta-galaktosidasu (PAD-LacZ), konštitutívne aktívna forma RhoC (PAD-RhoC-V14), plnej dĺžke IQGAP1 (PAD-IQGAP1) a C-terminálny fragment IQGAP1 (PAD-IQGAP1-C) za milý dary od Dr. Gerry Boss a Dr. Renate Pilz na University of California, San Diego, USA. Človek-EGF, BrdU, myší anti-BrdU protilátkou, DNázy, MTT, Hoechst 33342, FITC a Cy3-konjugované sekundárne protilátky boli od firmy Sigma (St. Louis, MO). Anti-IQGAP1 protilátka (proti N-koncovému fragmentu, 314-422 aa), anti-RhoA protilátky, anti-IgG, anti-CDK1 /CDK2 protilátky, krátke interferujúce RNA- (siRNA) pre RhoC a negatívne kontroly boli od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rho C siRNA je bazén 3 cieľovo špecifickú 20-25 nt siRNA navrhnutá tak, aby zraziť génovú expresiu so sekvenciami takto: sequence1, zmyslový 5'-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3'and antisencie 5'-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 '; sequence2, zmysel 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'a antisencie 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; sequence3, zmysel 5'-CAC- ACCAGCACUUUAUACAtt-3 'a antisencie 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- TT-3'. Anti-IQGAP1 protilátka (proti C-koncový fragment zodpovedajúci aminokyselinám 863-1657 ľudského IQGAP1) bol od firmy Millipore (Billerica, MA). Protilátka anti-RhoC bol od abca (Cambridge, MA). B protilátok anti-cyklin bol od BIOWORLD Technology (St. Louis Park, MN). Anti-cyklin D1 protilátka a anti-cyklin E protilátky boli od Boster (Wuhan, Čína). Sírne pre IQGAP1 syntetizoval Qiagen (Valencia, CA), cieľová sekvencia bola 5'-IQGAP1 AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 '(5058 až 5078 bp). S chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou sekundárne protilátka bola z Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Protein G Plus /proteín A-Agarose bol od Calbiochem (San Diego, CA). Elektrochemiluminiscenční (ECL) činidlá boli od Millipore (Billerica, MA). Všetky činidlá použité v tejto štúdii boli analytickej čistoty.

Bunková kultúra, transfekcia a infekcie

BGC-823 a COS-7 bunky boli kultivované v 1 x Dulbecco modifikovanom Eaglovho média (DMEM) doplnenom s 10% fetálnym hovädzím (FBS) pri 37 ° C v 5% CO _{2 atmosfére. Médium bolo menené každý druhý deň a bunky boli kultivované pri sub-sútoku. Pre transfekciu, boli bunky subkultivovať deň pred procesom a prenos buniek karcinómu žalúdka plazmidy alebo siRNA bola vykonaná podľa pokynov výrobcu. V prípade infekcie, 293A bunky boli transfekovány adenovirových vektorov Pad-LacZ, podložka-RhoC-V14, podložka-IQGAP1 a Pad-IQGAP1-C a vírusových častíc produkovaných bunkami boli zozbierané a zosilnený. Vírusy boli pomenované Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 a Ad-IQGAP1-C resp a boli použité na infikovanie BGC-823 buniek. V deň pred infekciou, BGC-823 bunky boli čerstvo nasadený na 70-80% zhlukovania a proces infekcie bola vykonaná podľa inštrukcií výrobcu na druhý deň.}

Western Blotting

kultivované bunky boli trikrát premyté v PBS a lyžovanie RIPA pufri (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptinu, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 10 mM NaF , 1 mM Na _{3VO 4). Rovnaká množstvo proteínu boli oddelené o 8% alebo 12% SDS-PAGE v závislosti na molekulovej hmotnosti proteínu. Primárne protilátky boli inkubované cez noc pri 4 ° C, a zodpovedajúce sekundárne protilátky boli inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Tri premytie boli vykonávané s TBS /T po každej inkubácii protilátky. ECL činidlá boli použité na ukázať pozitívny pruhy na membráne.}

MTT testu

0,5 až 1 x 10 ^{3cells v 150 ul média boli nanesené na jamky 96-jamkové dosky. Po pripojení, bunky boli infikované adenovírusom zodpovedajúcim po dobu 48 hodín, alebo transfekované siRNA po dobu 72 hodín, v danom poradí. V kombinovaných skupinách, bunky boli transfekovány siRNA cielenie RhoC alebo IQGAP1 po dobu 24 hodín a potom infikované Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 alebo Ad-RhoC-V14 po dobu ďalších 48 hodín pri 37 ° C v 5% CO _{2. Kultivované bunky boli premyté PBS, pridá sa 20 ul MTT (0,5 mg /ml), a potom sa inkubujú pri 37 ° C po dobu 1 hodiny. Médium bolo odstránené a 100 ul dimetylsulfoxidu (DMSO) bolo pridané do každej jamky. Absorbancia bola stanovená pri 490 nm za použitia čítačky mikrodoštičiek. Všetky testy boli vykonané v troch opakovaniach.}}

BrdU Začlenenie Assay

rýchlosť syntézy DNA bola meraná inkorporácie BrdU imonufluoreskujúca. Množstvo naočkovaní buniek bola upravená na dosiahnuť hustotu 70 až 80% zhlukovania v deň transfekcia. Plasmid pFLAG-IQGAP1, pFLAG-IQGAP1-C alebo pFLAG-IQGAP1-N sa ko-transfekovaly plazmidom GFP do buniek BGC-823 za použitia Lipofectamin ™ 2000, ako je popísané vyššie. 24 hodín po transfekciu, boli bunky v sére vyhladované cez noc, pridá sa 200 μ
M BrdU a inkubované po dobu asi 16 hodín. Bunky potom boli premyté PBS, fixované v čerstvo pripraveného 4% (v /v), paraformaldehydu pri teplote miestnosti po dobu 10 minút, a permeabilizovány 0,5% (v /v) Triton X-100, s následnou inkubáciou s DNázy I (0,5 U /ul) počas 30 minút pri teplote 37 ° C. Bunky boli inkubované s primárnou protilátkou proti BrdU cez noc pri 4 ° C s následným Cy3-konjugovanou sekundárnou protilátkou po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Napokon, jadra bola kontrastne prifarbená s Hoechst 33342 po dobu 15 minút, opláchnutá PBS trikrát a vizualizované pod fluorescenčné mikroskopia. Každý test bol vykonaný v Quadrupletu a opakuje trikrát.

Co-Imunoprecipitácia

Ak chcete skúmať interakcie medzi RhoC a IQGAP1, COS-7 a BGC-823 bunky boli koinfikovaným Ad- IQGAP1 alebo Ad-IQGAP1-C, a Ad-RhoC-V14 po dobu 48 hodín a potom boli Lyžovanie pufrom RIPA, ako je popísané. Protilátka proti RhoC, IQGAP1 alebo izotypov zodpovedajúcim IgG bol použitý pre imunoprecipitáciou, resp. Imunoprecipitáty boli analyzované metódou Western blot ako je uvedené vyššie, za použitia anti-RhoC alebo anti-IQGAP1 protilátky.

imunofluorescenčné mikroskopie

Bunky kultivované na krycie sklíčka boli fixované čerstvo pripraveného 4% (v /v ) paraformaldehydu v PBS po dobu 15 minút, permeabilizovány 0,3% Triton X-100 v PBS po dobu 10 minút a blokované 3% (w /v) bovinného sérového albumínu (BSA) v PBS. Pre imunofluorescencie, bunky na krycie sklíčka boli postupne inkubovali s králičie polyklonálne protilátkou proti IQGAP1 pri teplote 4 ° C cez noc, FITC-konjugované kozie anti-králičie IgG na 1 h pri teplote miestnosti, myšou monoklonálnou protilátkou proti RhoC po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti a nakoniec kozie IgG konjugovaný anti-myší s Cy3 po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Tri premytie bolo vykonané po každej inkubácii protilátky. Jadrá bola kontrastne prifarbená s Hoechst 33342. Výsledkom bola pozorovaná pod fluorescenčným mikroskopom, spojených s CCD kamerou (Leica).

Štatistická analýza

Dáta boli analyzované s použitím dvoch-tailed ANOVA alebo Študent je t
-test s SPSS štatistického softvér a vyjadrená ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). P
. ≪ 0,05 bola považovaná za významnú

Výsledky

RhoC Akciové proti šíreniu BGC-823 buniek

Vplyv RhoC na proliferáciu buniek bola tiež vyšetroval. BGC-823 bunky boli infikované adenovírusom kódujúcim konštitutívne aktívny RhoC a proliferácie buniek bola detekovaná testom MTT. Výsledky ukázali, že RhoC tiež podporoval proliferáciu buniek karcinómu žalúdka BGC-823. Nadmerná expresia RhoC-V14 v BGC-823 buniek spôsobila zvýšenie o 48,7% v bunkovej proliferácii (Obr. 1A a B). Medzitým, vyčerpanie RhoC tým siRNA znižuje proliferáciu BGC-823 bunky, o 43,1% (obr. 1C a D).

IQGAP1 Enhanced proti šíreniu BGC-823 buniek

(1) výsledky MTT testom.

aby bolo možné posúdiť prínos IQGAP1 k proliferácii, MTT test bol použitý na detekciu životaschopnosť rakovina žalúdka bunkové línie BGC-823. Výsledky ukázali, že v porovnaní s kontrolnými bunkami (Ad-LacZ skupina), vysoká expresia C-koncového fragmentu IQGAP1 (Ad-IQGAP1-C skupina), alebo po celej dĺžke IQGAP1 (Ad-IQGAP1 skupina) zvýšenie proliferácie buniek o 116% a 39%, v uvedenom poradí ( *
P < 0,05, *
P. < 0,05, obr 2A a B). Naproti tomu N-koncový fragment IQGAP1 nemá žiadny zjavný účinok na proliferáciu buniek. Na druhej strane, interferencie IQGAP1 expresie siRNA sa znižuje bunkovú proliferáciu o 43%, v porovnaní s negatívnou kontrolou ( * P
. ≪ 0,05, obr 2C a D). Tieto výsledky ukazujú, že IQGAP1 bol schopný urýchliť bunkovú proliferáciu; aktívna doména sa nachádza v fragmentu C-terminálny časti proteínu.

(2) Výsledky testu inkorporácie BrdU.

Test BrdU inkorporácie poskytla vzor odpoveď podobná ako u MTT test. Expresie Flag-IQGAP1 a Flag-IQGAP1-C výrazne podporoval syntézu DNA do úrovne takmer 1-FLOD a 2-násobná ako bolo pozorované u Flag-D1 (* P < 0,05, * p. ≪ 0,05, obr 2E a F) , zatiaľ čo nebolo preukázané IQGAP1-N žiadny vplyv na syntézu DNA, čo naznačuje, že IQGAP1 inak reguluje syntézu DNA pomocou rôznych doménach.

Súvislosť medzi RhoC a IQGAP1 pri stimulácii šírení BGC-823 buniek

(1) RhoC a IQGAP1 neovplyvnila výrazu navzájom.

uvedené výsledky jasne ukazujú, že ako RhoC a IQGAP1 prispel k šíreniu BGC-823 buniek. Za účelom objasnenia možného spojenia medzi RhoC a IQGAP1 v regulácii bunkovej proliferácie, my najprv skúmali, či IQGAP1 a RhoC ovplyvniť ich vyjadrenia navzájom. BGC-823 bunky boli transfekovány siRNA sa porazený expresiu RhoC alebo IQGAP1, a potom boli infikované adenovírusom kódujúcim IQGAP1, IQGAP1-C alebo konštitutívne aktívny RhoC resp. Western blotting bol aplikovaný na detekciu toho, či zmeny expresie a aktivity jedného proteínu by mohlo mať vplyv na expresiu iných proteínov, alebo nie. Výsledky ukázali, že zvýšenie exogénne alebo endogénne Vyradenie IQGAP1 alebo IQGAP1-C, neovplyvnila expresiu RhoC. Podobne zvýšenie konštitutívne aktívny RhoC alebo zásah endogénneho RhoC neovplyvnila expresiu IQGAP1 alebo IQGAP1-C (obr. 3A).

(2) IQGAP1 bol efektor RhoC pri stimulácii proliferácie buniek.

MTT test bol použitý na objasnenie vzťahu medzi RhoC a IQGAP1 pri stimulácii proliferácie. Výsledky ukázali, že RhoC-siRNA nemal zrejmý vplyv na proliferáciu spôsobené IQGAP1 (** P < 0,01, obr 3B.). Avšak vyčerpávanie IQGAP1 expresie siRNA blokoval množenie spôsobené expresiou konštitutívne aktívny RhoC (* p 0,05, ** P < 0,01, obr. 3c). To ukazuje, že v priebehu procesu stimulácie proliferácie BGC-823 buniek, RhoC vyžaduje účasť IQGAP1. Okrem toho, pretože RhoC jav potrebný IQGAP1 zatiaľ čo IQGAP1 jav nevyžadovali RhoC, RhoC môže byť pre odosielanie dát z IQGAP1 a vzal IQGAP1 ako efektor.

Vplyv RhoC a IQGAP1 na expresiu bunkového cyklu príbuzných proteínov

pre ďalšie potvrdenie proliferáciu stimulujúci účinok RhoC a IQGAP1 a skúmať možný mechanizmus, prostredníctvom ktorého sú tieto proteíny regulujú proliferáciu buniek, sme aplikovali Western blotting pre detekciu expresie proteínov súvisiacich bunkového cyklu v bunkách ošetrených s metódami zvyšovania či znižovania RhoC a IQGAP1. Výsledky ukázali, že zvýšenie RhoC a IQGAP1 stimulovali expresiu cyklin E a cyklin D1, pričom nemal žiadny vplyv na expresiu cyklin B a CDK1 /2. Na druhej strane, pokles RhoC a IQGAP1 inhibujú expresiu cyklin E a cyklin D1. Medzitým, v prípade RhoC umlčanie pomocou siRNA, zvyšujúce IQGAP1 alebo IQGAP1-C ešte zvyšujú expresiu cyklin E a cyklin D1 (obr. 4). Tézy Výsledky ukázali, že RhoC a IQGAP1 mohli regulovať proliferáciu cez meniace expresiu proteínu bunkového cyklu súvisí a spôsobuje viac buniek k vstupu S fázy.

RhoC a IQGAP1 Co-lokalizovať a Bound navzájom v bunkách

imunofluorescenčný a spôsob Co-Imunoprecipitácia boli použité ďalej skúmať možné väzby medzi RhoC a IQGAP1. Oba BGC-823 a COS-7 bunky boli koinfikovaným Ad-IQGAP1 a Ad-RhoC-V14 alebo Ad-IQGAP1-C a Ad-RhoC-V14 po dobu 48 hodín a celkový bunkový lyzát bol imunoprecipitována s anti-RhoC protilátky a testované s protilátkou proti IQGAP1 alebo imunoprecipitovány s protilátkou anti-IQGAP1 a testované s protilátkou proti RhoC, resp. Výsledky ukázali, RhoC a IQGAP1 viazané navzájom, s C-koncovým fragmentom IQGAP1 ako väzobné miesto RhoC (obr. 5A a C). Okrem toho Imunofluorescenčný test ukázal, že IQGAP1 bol distribuovaný predovšetkým v cytoplazme, kde sa podieľal na lokalizované s RhoC (obr. 5B a D).

Diskusia

nekontrolovaného šírenia rakovinových buniek vyžaduje koordinované a pevne regulovaná funkciou mnohých proteínov [23], [24], [25], [26]. Je preto veľmi dôležité, aby študovať mechanizmus, ako tieto proteíny interagujú pri regulácii proliferácie rakovinových buniek. Naše predchádzajúce výsledky dokumentujú, že expresie IQGAP1 a RhoC boli v žalúdočných rakovinových tkanivách a bunkových línií karcinómu [21] zvýšil. Úroveň ich výrazov mal významnú koreláciu so zlou diferenciáciou karcinómu žalúdka. Avšak, to nie je celkom jasné, či IQGAP1 a RhoC sú spojené s proliferáciou buniek v tumorigenensis. V tejto štúdii, úrovňou expresie IQGAP1 a RhoC a ich biologickej aktivity v žalúdočnej rakovina bunkovej línii BGC-823 boli upravené pomocou infekcie adenovirových konštruktov alebo transfekciu plazmidovej DNA alebo siRNA. Proliferácia buniek sa potom skúmaná za použitia BrdU inkorporácie testu a metódy MTT. Výsledky ukázali, že konštitutívne aktívny RhoC výrazne umocňuje proliferačnú aktivitu karcinómu žalúdka bunkové línie BGC-823, a vylučovanie RhoC tým siRNA inhibuje vlastnosti. Výskumná dáta ukázali, že RhoC mal dôležitú úlohu v oblasti migrácie a metastáz [27] buniek [28], [29] [30] [31], ale tam boli niektoré rozpory ohľadom toho, či RhoC regulovať proces transformácie a proliferácia v nádorových bunkách [27], [29], [32]. Naše výsledky poskytujú dôkaz, že RhoC majú proliferáciu stimulujúci účinok na rakovinových bunkách žalúdka. To bude užitočné pri objasnení role RhoC pri regulácii proliferácie rakovinových buniek.

Naše výsledky ukazujú, že podobné RhoC, zvýšená expresia exogénneho IQGAP1 a IQGAP1-C tiež podporované proliferáciu BGC-823 buniek, vzhľadom k tomu, porazený endogénneho IQGAP1 oslabenej proliferačnej schopnosť bunky, čo naznačuje, že IQGAP1 tiež prispieva k regulácii bunkovej proliferácie. Vzhľadom k tomu, že ako RhoC a IQGAP1 majú úlohu pri regulácii proliferácie rakovinových buniek a ich výrazy boli vysoko korelované, sme ďalej skúmali funkčný vzťah medzi RhoC a IQGAP1. Výsledky ukázali, že v BGC-823 buniek s knock-down z IQGAP1 expresie, infekcia kódujúce adenovírus konštitutívne aktívny RhoC nemôže stimulovať proliferačnú aktivitu už; zatiaľ čo v BGC-823 bunky s knock-down z RhoC prejavu, nadmerná expresia IQGAP1 alebo IQGAP1-C cez infikovať bunky adenovírusom kódujúce zodpovedajúce DNA stále spôsobené vyššou proliferačnú aktivitu. To ukazuje, že RhoC išiel proliferáciu nádoru prostredníctvom IQGAP1, najmä prostredníctvom fragmentu C-terminálny časti IQGAP1. Tento funkčný vzťah medzi RhoC a IQGAP1 bol ďalej podporený koimunoprecipitačními a imunofluorescencia. Tieto výsledky naznačujú, že RhoC vzal IQGAP1 ako efektorov pri regulácii proliferácie nádorových buniek, hádzanie nové náznak o vzťahu týchto proteínov.

Ak chcete v prvom rade preskúmať následný mechanizmus, prostredníctvom ktorého RhoC /IQGAP1 regulovať proliferáciu buniek karcinómu žalúdka sme skúmali vplyv RhoC /IQGAP1 na expresiu proteínov súvisiacich bunkového cyklu, vrátane cyklin E, cyklin D1, cyklin B, cyklin závislé kinázy (CDK). Výsledky ukázali, že obe RhoC a IQGAP1 stimulovali expresiu cyklin E a cyklin D1, ale nemal žiadny vplyv na expresiu cyklin B a CDK. Proliferácia eukaryotických bunkách je riadená v určitých bodoch v bunkovom cykle, a to najmä v prvej fáze medzery (G1) na DNA-syntetickej fázy (S) a druhá medzera (G2 fáza) do mitózy (M) prechody. Z toho, prechody G1-S je hlavný regulácia bod bunkového cyklu. Cyklin D1 a cyklin E kontrolovať postup bunkového prostredníctvom podpory G1 do S fázy bunkového cyklu. Naše výsledky naznačujú, že keď sa RhoC aktiváciu extracelulárnej alebo intracelulárnej signál, sa viaže na IQGAP1 a potom vplyv na expresiu proteínov bunkového cyklu súvisiace priamo alebo nepriamo prostredníctvom niektorých nejasných transdukcia signálu krokov, ktoré by mohlo nakoniec viesť k zmene progresie buniek a proliferáciu (obr. 6).

na záver, tieto údaje zo súčasnej štúdie, v spojení s predtým publikovanými údajmi [21], podporujú hypotézu, že RhoC podieľa na oboch migráciu a proliferáciu buniek karcinómu žalúdka. IQGAP1 tiež podieľať na regulácii proliferácie rakovinových buniek ako následný efektor RhoC. Tieto údaje môžu svietiť svetlá na vývoji liečebných postupov pre rakovinu žalúdka.

Poďakovanie

Ďakujeme Dr. Gerry šéf a Dr. Renate Pilz na University of California, San Diego, CA, USA, pre ochotní dary adenovirových konštruktov.

• Ploche ONE: polymorfizmu ERCC1 a XPF génov a riziko rakoviny žalúdka vo východnej čínskej Population
• Ploche ONE: Reg IV je priamym cieľom črevnej transkripčný faktor CDX2 v rakoviny žalúdka