Ploche ONE: Adenovirový Dodávka EMX2 Génové tlmí rast v žalúdočnej rakoviny u ľudí

abstraktné

Pozadie

EMX2 je ľudský ortolog na Drosophila
prázdny prieduchov homeoboxový gén, ktorý bol zapletený do embryogenézy. Nedávne štúdie naznačujú možné zapojenie EMX2 v ľudských nádorových ochorení; Avšak, role EMX2 v karcinogenézy vyžaduje ďalšie skúmanie.

Výsledky

V tejto štúdii sme informovali, že down-regulácia EMX2 expresie významne koreluje s EMX2 promótor hypermetylace rakoviny žalúdka. Obnovenie EMX2 expresie s použitím dodania adenovírus systém v žalúdočných bunkových línií karcinómu ktorým chýba endogénna EMX2 expresie viedla k inhibícii bunkovej proliferácie a Wnt signálne dráhy a to ako in vitro a v žalúdku modeli rakoviny xenograftovém in vivo. Okrem toho sme pozorovali, že zvieratá liečené adenovirového expresného vektora EMX2 mali významne lepšie prežitie než pacienti liečení prázdnym adenovirovým vektorom.

Záver

Naša štúdia naznačuje, že EMX2 je domnelý nádorový supresor v rakovina žalúdka u ľudí. Adenovirový-EMX2 môžu mať potenciál ako nové génovej terapie na liečbu pacientov s karcinómom žalúdka

Citácia :. J Li, Mo M, Chen Z, Z Chen, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) Adenovirový Dodávka EMX2 Génové tlmí rast v žalúdočných ľudskej rakoviny. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko

prijatá: 13. apríla 2012; Prijaté: 23 augusta 2012; Uverejnené: 21.septembra 2012

Copyright: © Li et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená prostriedky z National Key základný výskum a vývoj (973) Program Číny (2011CB910800 a 2012CB917304), Národná prírodná Science Foundation of China (31170732), Natural Science Foundation provincia Zhejiang (Y2101329) a Postdoctoral Science Založenie provincia Zhejiang (2010-BSH-031). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou na svete [1], [2], [3]. Hoci jeho celosvetový výskyt znížil výskyt stále zostáva vysoko v ázijských krajinách [2], [4], [5]. Väčšina pacientov s rakovinou žalúdka diagnostikovaných v pokročilých štádiách [6]. Aj napriek zlepšeniu liečebných stratégií [7], [8], 5-ročné prežitie u pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka, ktorí dostali konvenčné terapiou zostáva nižší ako 30% [4]. Z tohto dôvodu, sú naliehavo potrebné alternatívne prístupy.
Génovej terapie

, vrátane vírusovej a nevírusové systému dodanie génu, je sľubným prístupom pre liečbu rakoviny [9]. Zo všetkých aktuálne dostupných systému, rekombinantný adenovírus (AD) vektory sú obzvlášť sľubné. Výhody Ad vektorov zahŕňajú schopnosť produkovať vysoké titre, schopnosť infikovať efektívne delenie a non-deliace sa bunky, stabilitu genómu a nízkej úrovne integrácie DNA do genómu hostiteľa [9], [10]. Bolo oznámené, že obnova génov prostredníctvom tohto prístupu vedie k regresii nádoru a indukuje apoptózu in vivo
bez ovplyvnenia normálnej tkaniva [11], [12], [13].

EMX2, ľudský ortolog na Drosophila
homeoboxový génu prázdne prieduchy (EMS), patrí do rodiny génov homeoboxový, ktorý kóduje transkripčný regulačný proteíny (Homeoprotein) nevyhnutné pre mnoho aspektov rastu a diferenciácie [14]. EMX2 hrá dôležitú úlohu počas mozgu [15] a vývoj kostry [16]. Myši nesúci homozygotná EMX2 mutácie vykazujú dramatické zníženie veľkosti chvostové-mediálne oblastí, vrátane tylový mozgovej kôre a hipokampe [17], [18], [19]. Perturbace EMX2 expresia môže meniť rýchlosť proliferácie dospelých nervových kmeňových buniek [20]. EMX2 tiež riadi reprodukciu cicavcov úpravou endometria proliferáciu buniek bez ovplyvnenia diferenciácie [21].

Nedávne štúdie naznačujú možné zapojenie EMX2 u ľudských nádorov [22], [23], [24], [25]. Napríklad EMX2 bola preukázaná ako nádorový supresor pri karcinóme pľúc, a nízka expresia EMX2 je spojené so znížením celkové prežitie a prežitie bez recidívy u pacientov s pľúcnou adenokarcinómy [22], [23]. To je tiež hlásil, že EMX2 výraz je hojný v normálnom endometriu žien po menopauze, ale chýba alebo je znížená endometria nádorov, a hladiny EMX2 sú negatívne koreluje s proliferáciou [24], [25]. Okrem toho môže regulovať EMX2 tumorigenezi cez Wnt signalizácie, kritická cesta upravujúce stanovenie bunkového osudu vývoj tkaniva a tumorigenezi [26], [27], [28]. EMX2 sa vyskytuje ako priamy represor Wnt1 prejavu a zrazil dole z EMX2 génu indukuje ektopickú expresiu Wnt1 v rozvojovom telencephalon a kortikálnej dysplázia [29]. Epigenetické umlčanie expresie EMX2 môže byť dôležité pre aberantne aktiváciu signalizácie Wnt u karcinómu pľúc, a následné proliferácie a metastáz [22]. Avšak funkcie EMX2 pri vzniku nádorov a zodpovedajúci mechanizmus je potrebné ešte ďalej objasnený. V tejto štúdii sme správu EMX2 ako domnelého nádorový supresor v ľudskom karcinómu žalúdka. Demonštrujeme EMX2 down-reguláciu a jej koreláciu s metylačného statusu promotorové oblasti génu pri rakovine žalúdka. Tiež ukazujú, že obnova EMX2 za použitia adenovirového zavádzací systém inhibuje proliferáciu buniek a Wnt signalizácia in vitro
, a má za následok lepšiu prežitie žalúdočné rakovina modelu xenoimplantátu in vivo
. Naše dáta silne naznačujú terapeutický potenciál využitia Ad-EMX2 ako génovej terapie pre budúcu liečbu pacientov s rakovinou žalúdka.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Táto štúdia bola schválená etickou komisiou Xuanwu nemocnici, Capital lekárskej univerzity v Pekingu. Písomný informovaný súhlas schválený etickou komisiou, bolo získané u každého pacienta pred odberom vzorky tkaniva.

Cell Culture, 5-aza-2'-deoxycitidin (DAC) /trichostatin A (TSA) ošetrenie, a tkanivové vzorky

ľudských rakovinových bunkových línií žalúdka (AZ521, AGS a MKN28) boli získané z Číny centra pre Type Culture Collection (Wuhan, Čína). Bunkové línie boli kultivované v Dulbecco modifikovanom médiu Eagle doplnenom 10% fetálnom hovädzom sérom, penicilínom, streptomycínom a pri teplote 37 ° C vo vlhkom inkubátore s 5% CO _{2. Analyzovať obnovenie EMX2 génu, boli bunky ošetrené 4 uM DAC alebo 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) po dobu 4 dní, s výmenou čerstvého média, ktoré obsahuje rovnakú dávku DAC alebo TSA každý deň. Kontrolné bunky boli kultivované s čerstvým médiom obsahujúcim DMSO. Bunky boli následne zozbierané na DNA /RNA extrakcie.}

celkom 20 parafínových blokov tkaniva formalínom fixovaných (10 žalúdočné rakovinové tkanive a 10 susediacich normálnych tkanív), ako aj celková RNA z 15 vzoriek žalúdočnej dysplázia a 20 s rakovinou žalúdka chirurgickej vzorky boli získané od Xuanwu nemocnici, Capital lekárskej univerzity v Pekingu. Celková RNA a genómovej DNA extrahované z dospelého človeka normálne žalúdočnej tkanive boli zakúpené od Biochain (Hayward, CA, USA).

DNA konštrukty

Topflash /Fopflash reportérov, ktoré obsahujú divokého typu a mutantný TCF /LEF väzbové miesta v tomto poradí boli láskavo poskytol Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Čína). Mutant CTNNB1 (S45Y) cDNA konštrukt bol tiež láskavo poskytol Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Čína). Rekombinantný adenovirové vektory exprimujúce EMX2 a kontrolné vektor boli zakúpené od firmy Vector Biolabs (vektor Biolabs, Burlingame, CA, USA).

metylácie špecifickej PCR (MSP) a hydrogénsiričitanu sekvenovania (BS)

bisulfitová konverzie z tkanív a buniek boli vykonávané bez predpoklad pre izoláciu DNA za použitia EZ-metylácie DNA Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). Tieto FFPE tkaniva boli najprv de-paraffinized v xylénu (Sigma) a rehydrated v etanolové pred bisulfitového na pokyny výroba je. Pre MSP, modifikovaná DNA sa amplifikuje za použitia primérov MSP (uvedených nižšie), ktoré špeciálne uznávané buď methylata alebo nemethylované EMX2 promotorové sekvencie po bisulfitového. PCR bola vykonaná v konečnom objeme 20 ul s obsahom 1 x reakčný pufor MSP [30], 0,5 uM každého primeru a 1 U z Zymo Taq
™ DNA Polymerase (Zymo). Podmienkou PCR boli nasledovné: 10 min pri 95 ° C; 40 cyklov 30 sekúnd pri 95 ° C, 30 s pri 50 ° C a 30 pri 72 ° C; a 7 min záverečná extenzie pri 72 ° C. BS, amplifikácia bisulfitového konvertované DNA bola vykonávaná v konečnom objeme 50 ul obsahujúcich 1 uM každého primeru BS a 2 U z Zymo Taq
™ DNA Polymerase. Podmienkou PCR boli nasledovné: 10 min pri 95 ° C; 40 cyklov 30 sekúnd pri 95 ° C, 40 s pri 55 ° C a 1 min pri 72 ° C; a 7 min záverečná extenzie pri 72 ° C. PCR produkty boli klonované do PMD-18T (Takara, Dalian, Čína). Buď 5 alebo 3 náhodne vybraných pozitívnych klonov z každej skupiny boli sekvenované v Šanghaji Invitrogen (Shanghai, Čína). Primery boli nasledujúce:

MSP-M (dopredu): 5'-TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '

MSP-M (reverznej): 5'-GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'

MSP-U (dopredu): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (reverznej): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (dopredu): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (reverznej): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (dopredu): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (reverznej): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

imunohistochémia (IHC)

IHC bola vykonávaná podľa štandardného protokolu. Protilátky použité v štúdii myší anti-ľudský Ki67 (1: 100, BD, San Jose, CA, USA) a myší anti-ľudský EMX2 (1: 500, Pierce, Rockford, IL, USA) a Alexa 594 konjugovanou kozí anti-myší sekundárnou protilátkou (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sklíčka bola kontrastne tiež hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokálna mikroskop (Oberkochen, Nemecko) bol použitý na skúmanie farbenie. Intenzita Ki67 bola kvantifikovaná pomocou Image PRO® Plus. EMX2 farbenie bola vizualizované s Histostain Plus kit DAB (širokospektrálny, Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu sa vykonáva, kontrastne zafarbené hematoxylínom (Sigma), a vyfotografoval pomocou Leica SCN400 posuvný snímač (Leica, Nemecko).

Luciferase Assay

Bunky pri hustote 5 x 10 ^{3 na jamku boli Zaočkované do 24-jamkových doštičiek pred transfekcia. Topflash alebo Fopflash plazmidy boli kotransfekovány PRL-TK plazmidu. Potom, čo bunky boli kultivované počas 18 hodín sa aktivita luciferázy bola meraná Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Pomer medzi svetlušky luciferázové aktivity (Topflash /Fopflash) a Renilla aktivita bola použitá pre TCF /LEF transkripčné aktivity.}

imuno-blottingom

Oba celkového proteínu (20 ug) a cytoplazmy extrakty (40 ug) boli podrobené imuno-blottingom. Primárne protilátky zahrnuté anti-EMX2 (1: 500; Pierce), anti-β-aktínu (1: 5000, Sigma), anti-cyklin D1 (1: 500, BD) a anti-c-Myc (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Test proliferácie

rast buniek sa stanoví pomocou CellTiter 96 Vodný Test proliferácie Kit (Promega). Bunkové línie boli nanesené do 96-jamkových kultivačných doštičiek s počtom 5 x 10 ^{2 buniek /jamka. Potom, čo boli bunky kultivované po dobu v dňoch 0, 2, 3 a 4, roztoky MTS boli pridané do média a inkubovať po dobu 1,5 hodiny. Absorbancia pri 490 nm sa merala za použitia čítačky mikrotitračných doštičiek modelu 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

Colony Formation Test

Bunky (1 x 10 ^{3) infikovaných sa adenovirový vektor exprimujúci EMX2 alebo prázdnym vektorom boli vrúbľovať v troch vyhotoveniach na 100 mm miskách. Čerstvé médium bolo menené každé 3 dni. Po kultivované po dobu 3-4 týždňov, boli bunky fixované 4% paraformaldehydom po dobu 10 minút, promyly PBS, zafarbené 0,1% kryštálovou violeťou po dobu 20 minút a fotografované.}

Extrakcia RNA a kvantitatívne v reálnom čase reverznej transkripcie -PCR (RT-PCR)

extrakcie RNA a real-time RT-PCR bola vykonávaná ako bolo opísané skôr [31]. Sekvencia primeru boli predtým popísané [22].

Zvieracie model a adenovirového vektora Delivery

Všetky pokusy myši boli vykonávané za určitých podmienok bez patogénov v živočíšnej objekte Tsinghua University a schválený inštitucionálne starostlivosť o zvieratá a používaní Výbor Tsinghua University. Rakovina žalúdka xenografe boli stanovené do 5 týždňov staré samice Balb /c nahých myší. Stručne povedané, po vyrásť do zhlukovania, MKN28 alebo AGS bunky boli trypisnized a resuspendované v PBS (pH 7,4) a potom sa zmieša 01:01 (v /v) s matrigelem (Vigorous) pri 4 ° C aplikovať jednu myš v celkovom objeme 150 ul. Zmes bola S.C. injekciou do pravého boku 16 samíc myší s 10 ^{7 buniek na myš (deň 0). V deň 7, myši nesúci lokálne nádory v rozmedzí od 50 do 100 mm 2 dostala priamy vnútri nádorovej injekcii 1 x 10 9 plak tvoriacich jednotiek uvedeného adenovírusu (zriedi PBS v celkovom objeme 100 ul). Tvorba nádoru bola monitorovaná po dobu až 1? Mes. Veľkosť nádoru bola meraná pomocou posuvného merítka a určí vynásobením o 0,5 × šírka 2 x dĺžku. Spôsob podľa Kaplan-Meiera bola použitá na odhad prežitie oboch skupín liečených zvierat. Po ukončení experimentu, nádory z každej ošetrení boli odobraté do 10% pufrovaného formalínu, vložené do parafínu a rez do 5 um hrubé plátky pre ďalšie zisťovanie Ki-67. Cytosolické proteíny a celá bunka lyzáty boli tiež extrahované z týchto nádorov pre západné analýzu.}

Štatistická analýza

Všetky dáta sa vypočítala ako priemer ± štandardnej odchýlky. Rozdiely medzi skupinami boli porovnané s dvojstranný t test. A P
hodnota 0,05 alebo menej bol považovaný za významný.

Výsledky

znižujúce množstvo EMX2 v rakovina žalúdka u ľudí

Skúmali sme EMX2 výraz v deväť ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka, rovnako ako nádorové a párové priľahlé normálneho tkaniva od desiatich pacientov s rakovinou žalúdka (obrázok 1). Pomocou real time RT-PCR sme zistili, že expresia EMX2 výrazne downregulated v ôsmich z deviatich bunkových línií skúmané v porovnaní s normálne, že v žalúdočnej tkanive (P < 0,01, obrázok 1A). Na druhej strane, jedna bunková línia AZ521 vykazovali podobnú úroveň expresie EMX2 ako v normálnej kontroly (obrázok 1A). Aby bolo možné odhaliť EMX2 expresie proteínu v pacientových vzorkách tkanív, imunohistochémia (IHC) bola vykonaná a intenzita IHC farbenie bolo vyčíslené Image Pro ® Plus. Všetkých desať analyzované vzorky sa zistilo, že vykazujú buď nedostatok EMX2 expresie alebo zníženej hladiny EMX2 expresie v rakovinových tkanivách v porovnaní s ich normálnymi náprotivkami (P < 0,01, obrázok 1B). Stanoviť možnú úlohu v patologických EMX2 progresie ľudského karcinómu žalúdka, sme analyzovali expresiu EMX2 za použitia celkovej RNA, ktoré sme získali z pätnástich vzoriek žalúdočnej dysplázia a dvadsiatich rakoviny žalúdka chirurgických vzoriek. Zistili sme, že EMX2 expresia bola významne downregulated vo vzorkách dysplázia (P menšia ako 0,05). A takmer stratil vo vzorkách s nádorovým ochorením v porovnaní s u dospelých normálnou žalúdočné tkaniva (obrázok 1C), čo naznačuje, by mohlo dôjsť pri neinvazívnej prekancerózne fáze, ktorá EMX2 downregulaci

Oprava medzi EMX2 prejavu a jeho metylácie promótorom stav

Skúmali sme stav metylácie promótorom EMX2 v deviatich žalúdočných nádorových bunkových línií a normálne žalúdočnej tkanive. Regióny CPG ostrovov (CGI) boli identifikované MethPrimer od -800 do -470 a -55 až 459 vzhľadom k očakávaným transkripcie štartovných miest (+1) z EMX2 génu (obrázok 2A). Stav metylácie bola analyzovaná za použitia hydrogénsiričitanu sekvencovania (BS) (obrázok 2B) a metylácie-špecifické PCR (MSP) (Obr 2C-2D). Naše BS a výsledky ukázali, že MSP EMX2 promótor ako v normálnej tkanív a buniek AZ521 žalúdočných bol nemethylovaný, kým v ôsmich ďalších bunkových línií bola skúmaná husto methyluje (Číselné údaje 2B-2C). Tieto výsledky sú v súlade s úrovňou EMX2 expresie v týchto bunkových líniách: vysoko v normálnej tkanive a AZ521, ale s nízkym obsahom ďalších ôsmich skúmaných bunkových línií. Zmes metylovaného a nemethylovaný pásme bola nájdená v niekoľkých bunkových líniách vrátane MKN28, N87 a SNU16 uvedením čiastočné metylácie. Ďalej sme zistili, že stav metylácie z tkanivových vzoriek pacienta zistené MSP je v súlade s úrovňou EMX2 expresie vo vzorkách (obrázok 2D, bola skúmaná štyria z desiatich párov vzoriek tkanív z dôvodu nedostupnosti genómovej DNA z iných šesť párov ). Tieto údaje naznačujú, že upregulace EMX2 expresie môže byť dôsledkom jeho promótorom hyper-metylácie v karcinómu žalúdka.

Ak chcete ďalej skúmať koreláciu medzi expresiou EMX2 a metylácie promótorom, sme liečili bunkových línií MKN28 a AGS s inhibítor metyltransferázy DAC a TSA inhibítor Histon-deacetylázy. Bunková línia AZ521 bola použitá ako negatívna kontrola ako jeho promotorové oblasti je nemethylovaný. Pozorovali sme, že unmethylation konkrétna skupina bola významne zvýšená (obrázok 3A) s úrovňou expresie EMX2 up-regulované spôsobom (obrázok 3B) po liečbe pomocou DAC v oboch AGS a MKN28 bunky, zatiaľ čo tie, ktoré v bunkách AZ521 zostala nezmenená (obrázok 3). Liečba TSA mal minimálny vplyv na oboch metylačného statusu a EMX2 expresných hladín. Celkovo vzaté, naše výsledky silne naznačujú, že down-regulácia EMX2 expresie významne koreluje s EMX2 promótor hypermetylace v ľudskej rakoviny žalúdka.

Inhibícia rastu buniek pomocou adenovírusom dodaného EMX2 in vitro

ďalej sme skúmali úlohu EMX2 na bunkový rast rakovinových buniek žalúdka. Rast AGS a MKN28 buniek bola významne potlačená po infekcii adenovírusom exprimujúce EMX2 (Ad-EMX2) v porovnaní s prázdnou vektorové riadenie (Ad-ctrl) (p 0,001, Obrázok 4A), zatiaľ čo rast AZ521 buniek nebola ovplyvnená (P 0,05, obrázok 4A). Tieto pozorovania bola tiež potvrdená testom tvorby kolónií (obrázok 4B). Naše výsledky ukazujú funkciu anti-proliferácie EMX2 do buniek karcinómu žalúdka

Potlačenie Wnt signalizácie podľa adenovírusom dodáva EMX2

Funkcia EMX2 bolo spojené s Wnt signálne dráhy .; Preto sme študovali vzťah medzi EMX2 a Wnt signalizácie v rakoviny žalúdka. Použili sme reportéri test Topflash /Fopflash merať TCF /LEF závislú na transkripčný aktivitu regulovaná kánonickú Wnt dráhy. Zistili sme, že TCF /LEF závislé aktivity transkripcie bola významne inhibovaná Ad-EMX2 v bunkách AGS a MKN28 zbavených endogénnej EMX2 expresiu (P menšia ako 0,05), ale nie v AZ521 buniek, ktoré exprimujú endogénne EMX2 (P 0,05, obrázok 5A). Dôsledne, hladina proteínu cytosolické beta-kateninu a kánonické Wnt dráhy následní cielia, c-myc a cyklin D1 boli potlačené v týchto AGS a MKN28 buniek infikovaných Ad-EMX2, ale nie v AZ521 bunkách (renovácia EMX2 expresie v týchto bunkových línií po ad-EMX2 infekcia bola potvrdená Western) (obrázok 5B). Ďalej skúmať relevantnosť Wnt dráhu down-regulácia a potlačenie proliferácie Ad-EMX2 sme transfekovány a vyjadril stabilizovanej beta-katenin (S45Y mutácie) v týchto žalúdočných rakovinových bunkách infikovaných Ad-EMX2. Pozorovali sme, že s nadmernou expresiou p-katenin výrazne tlmí rast potlačenie účinku Ad-EMX2 ako AGS a MKN28 buniek (P 0,01), ale nie v AZ521 bunkách (obrázok 5C). Dohromady tieto výsledky podporujú dôležitú úlohu EMX2 pri potláčaní Wnt dráhy u karcinómu žalúdka.

Potlačenie rakovina žalúdka rast o adenovírusom dodaného EMX2 in vivo

sme založili MKN28 a AGS xenografe modely preskúmať terapeutický potenciál adenovírusom dodáva EMX2 rakoviny žalúdka in vivo
. Jeden týždeň po inokulácii myší s lokálnou nádory v rozmedzí od 50 do 100 mm ^{2 dostala priamy intratumorální injekciu 1 x 10 9 plak tvoriacich jednotiek uvedeného adenovírusu. Rast nádorov u myší infikovaných Ad-EMX2 boli výrazne pomalšie než u kontrolnej skupiny (P menšia ako 0,05, obr 6A vľavo dva panely). Po ukončení experimentu hmoty nádoru u myší infikovaných Ad-EMX2 tiež podstatne nižšia, než v kontrolnej skupine (P menšia ako 0,05 pre MKN28 nádoru, P < 0,01 pre AGS nádoru, Obrázok 6A pravý panel). Farbenie intenzita proliferačnej markeru Ki67 nádorových vzoriek pri ukončení experimentu ukázali, že dodávka Ad-EMX2 výrazne zmenšil Ki-67 farbenie (P < 0,01, 6B), z čoho inhibícia bunkovej proliferácie v nádoroch. Navyše, prežitie Ad-EMX2 infikované skupiny bolo významne lepšie ako u kontrolnej skupiny (p = 0,014, obr 6C). V súlade s naším in vitro
analýza, cytozolové β-katenin a kánonické Wnt dráh downstream cielia na c-myc a cyklin D1 boli tiež downregulated Ad-EMX2 infikovaný MKN28 a AGS nádory (reštaurovanie EMX2 prejavu v týchto in vivo nádory bolo tiež potvrdené Western) (obrázok 6D). Celkovo vzaté, naše výsledky ukazujú terapeutický potenciál adenovírusom doručená EMX2 na liečbu rakoviny žalúdka.}

Diskusia

homeoboxový gény boli dobre známy pre svoju dôležitosť vo vývoji po celé desaťročia, kým štúdie tieto gény počas onkogenézy je stále ešte v plienkach. Aberantne homeobox génovej expresie boli dokumentované v rôznych druhov rakoviny [32], [33], ktorý označuje zmeny hemeobox výrazov môže byť dôležité pre onkogenézy. To môže poskytnúť molekulárnej základ pre potenciálnych klinickej aplikácie. Avšak niekoľko zásadných otázok je potrebné ešte úplne vyriešené, vrátane molekulárne mechanizmy, ktoré riadia aberantne expresiu a následné ciele a signálnych dráh, ktoré podporujú onkogenézy. V tejto štúdii sme poskytnúť pohľad na tieto otázky skúmaním EMX2 v ľudskej rakoviny žalúdka.

Naša štúdia uvádza významný pokles a strata EMX2 expresie v žalúdočnej nádorových bunkových línií a primárnych nádorových tkanivách, a ukázal, že down-reguláciu významne koreluje s hyper-metylácie promótorom EMX2, čo naznačuje, epigenetické umlčanie ako dôležitý mechanizmus pre EMX2 dysregulácia v ľudskom karcinómu žalúdka. Vskutku, epigenetické modifikácie bola navrhovaná ako kľúčový mechanizmus zodpovedný za homeoboxový génov down-reguláciu alebo umlčanie v iných typov rakoviny tkanív, kde sa tieto gény fungujú v potlačovaní nádorov [14], [32]. Navyše naše pozorovania EMX2 dowregulation neinvazívnej žalúdočné dysplázia podporuje možnú dôležitú úlohu v patologických EMX2 progresie ľudského karcinómu žalúdka. Jedným z obmedzení našej štúdie je počet analyzovaných vzoriek tkanív. Väčší počet vzoriek od pacientov je potrebné preskúmať, aby ďalej potvrdiť zistenie metylácie-umlčanie EMX2 u rakoviny žalúdka. Avšak, naše výsledky poskytujú prvý priamy dôkaz na podporu tohto mechanizmu v karcinómu žalúdka a identifikovať EMX2 ako putativní nové nádorový supresor v karcinómu žalúdka.

Okrem toho sme skúmali dôležité onkogénne dráhy, cez ktorý EMX2 fungovala v karcinómu žalúdka a zistili, že Wnt signalizácie môže hrať kľúčovú úlohu sprostredkujúca funkciu EMX2. znázornené sme v proliferačnej testoch, že vysoká expresia exogénneho EMX2 výrazne potlačený rast žalúdočných nádorových bunkových línií zbavených endogénnej génovej expresie (AGS a MKN28 bunky), v súlade s predchádzajúcimi správami, že rozdiel v EMX2 expresie je v negatívnej korelácii s proliferáciou u iných typov nádorových buniek [ ,,,0],24], [25]. Tiež sme preukázali, že Wnt signalizácia bola dramaticky inhibovaná EMX2 in vivo stroje a in vitro
, poskytuje ďalší dôkaz, že Wnt signalizácie môže sprostredkovať funkciu EMX2 u rakoviny, ako bolo predtým navrhnuté [22 ].

a konečne, naše výsledky ukazujú možnosť použitia génovej terapie EMX2 pre liečbu rakoviny žalúdka. Infekcia nádorov Ad-EMX2 výrazne potlačená proliferácie a čo je dôležitejšie, zlepšenie celkového prežitia. Je pozoruhodné, že dopravný systém sme použili na liečbu bol rekombinantný adenovírus sérotypu 5 (AD5), najčastejšie používaný vektor v niekoľkých typoch génovej terapii rakoviny [11], [12], [34], [35]. V porovnaní s prasitrynes-asociovaný vírusový (AAV) a retrovirusove nosičov, adenovirových vektorov, ako je AD5, jasne majú mnoho výhod. Napríklad adenovirové vektory majú široký tropizmus umožňujúce efektívnejšie zacielenie na mnohých tkanivách záujmu, veľkú nosnosťou a vysokej účinnosti transdukcie vzhľadom k AAV systému [10] a tiež non-integrujúce vlastnosti, ktoré inak vyvolať riziko náhodnej mutagenézy genómu [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Okrem toho, adenovirové vektory môžu byť navrhnuté tak, aby s rakovinou-selektívne onkolytických vírusov [39], [40], [41], ktoré sú rozhodujúce pre klinické aplikácie génovej terapii rakoviny. Avšak stále existuje veľa problémov využití adenovirových vektorov dodať génovej terapie u pacientov. Napríklad, môžu byť rýchlo stratil z buniek, ktoré sa delia rýchlo po infekcii. Medzi ďalšie faktory, ktoré ovplyvňujú klinickú aplikáciu adenovirových dodanie zahŕňa baliace kapacitu a hostiteľskej rad adenovirových vektorov, ich profil génovej expresie a tendenciu vyvolať imunitnú odpoveď, obzvlášť dôležité, ak je potrebná opakované podanie [42], [43]. Avšak, naše in vivo štúdie
Ad-EMX2 infekciou naznačujú, že EMX2 génová terapia môže mať potenciál stať sa klinické protinádorové terapeutické stratégie pre liečenie rakoviny žalúdka v budúcnosti.

• Ploche ONE: Differential Expression of fosfolipázy C Epsilon 1 je spojená s chronickou atrofickú gastritídou a žalúdočné Cancer
• Ploche ONE: Umlčanie XB130 je spojené s oboma prognóze a chemosenzitivity žalúdočné Cancer