PLoS Genetics: onkogénne dráhy Kombinácia Predpovedať klinickej prognózy v žalúdku Cancer

abstraktné

Mnoho pevné nádory je známe, že vykazujú vysoký stupeň heterogenity v ich deregulácii rôznych onkogénnych dráh. snažili sme sa identifikovať hlavné onkogénnych dráh v rakovine žalúdka (GC) s významnými vzťahy k prežitiu pacienta. Použitie génovej expresie podpisov, vymysleli sme od in silico
stratégiu zmapovanie vzory aktivácia onkogénne dráhy u 301 primárnych karcinómov žalúdka, druhý najvyšší príčinou globálneho úmrtnosti na rakovinu. Identifikovali sme tri cesty onkogénnych (proliferácia /kmeňových buniek, NF-kB, a Wnt /β-katenin) deregulované vo väčšine (viac ako 70%) karcinómov žalúdka. funkčne sme overený týchto dráh predpovede v paneli žalúdočných nádorových bunkových línií. rozvrstvenie pacient by onkogénnymi kombináciami dráhy ukázali, reprodukovateľné a významné rozdiely prežitie v rôznych kohorty, čo naznačuje, že dráha interakcie, môže hrať dôležitú úlohu pri ovplyvňovaní správania ochorení. Jednotlivé GC možno úspešne taxonomized podľa onkogénne aktivity do dráhy biologicky a klinicky relevantných podskupín. Predpovedanie dráhy aktivita expresných podpisy a tým umožňuje štúdium viac dráh súvisiacich s rakovinou interagujúcich súčasne v primárnych nádorov, v mierke nie je v súčasnosti možné dosiahnuť pomocou iných platforiem.

Autor Prehľad vypísaných

Karcinóm žalúdka je druhou najčastejšou príčinou globálneho úmrtnosti na rakovinu. So súčasnými liečby, menej než štvrtina pacientov prežije dlhšie ako päť rokov po operácii. Jednotlivé žalúdočné rakoviny sú veľmi rôznorodá vo svojich bunkových vlastností a reakcií na štandardných chemoterapeutických liekov, takže rakovina žalúdka komplexné ochorenie. Dráha založené prístupy, skôr než jednogenových štúdií, môže pomôcť rozpliesť túto zložitosť. Tu sme sa využívajú výpočtového prístupu k identifikácii spojenie medzi molekulárnych dráh a profily s rakovinou. V štúdii vo veľkom meradle viac ako 300 pacientov, boli identifikované podskupiny karcinómov žalúdka rozlíšiteľné podľa ich vzory jazdy molekulárnych dráh. Ukázali sme, že tieto zistené podskupiny sú klinicky relevantné pri predikciu doby prežitia a môžu byť užitočné pri vedení na výber cielených terapií, ktoré majú zasahovať do týchto molekulárnych dráh. Tiež sme identifikovali špecifické bunkových línií karcinómu žalúdka zrkadlenie týchto dráh podskupiny, ktoré by mali uľahčiť pre-klinické hodnotenie odpovedí na cielených terapií v každej podskupine

Citácia :. Ooi CH, Ivanova T, Wu J, Lee M, tan IB, Tao J, et al. (2009) onkogénne dráhy Kombinácia Predpovedať klinickej prognózy v rakoviny žalúdka. PLoS Genet 5 (10): e1000676. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000676

Editor: Jason G. Mezey, Cornell University, Spojené štáty |

prijatá: 22.apríla 2009; Prijaté: 03.09.2009; Uverejnené: 02.10.2009

Copyright: © 2009 Ooi et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený granty PT z BMRC 05/1/31/19/423, Singapore Cancer Syndicate SCS-BS0001, NMRC udeliť TCR /001/2007 a jadrovou grant Duke-í. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je druhou najčastejšou príčinou globálneho úmrtnosti na rakovinu [1]. Zvlášť prevládajúce v Ázii, väčšina pacientov GC je diagnostikovaná choroba pokročilej fázy [2]. Deregulácia kanonických onkogénnych dráh, ako je E2F, K-ras, p53 a Wnt /β-katenin sa môžu vyskytnúť s rôznou frekvenciou v GC [3] - [6], čo ukazuje, že GC je molekulárne heterogénne ochorenie. Predchádzajúce štúdie, ktoré popisujú GC rozmanitosť v primárnych nádorov sa obvykle zameraná na jednotlivých dráhach, iba jedno meranie alebo niekoľko biomarkerov za experimentu [4], [6], [7]. Naproti tomu experimentálne dôkazy naznačujú, že väčšina fenotypy s rakovinou (nekontrolovaný rast, odolnosť k apoptóze, etc), sa do značnej miery riadi nielen jednotlivých dráh, ale zložité interakcie medzi viacerými pro- a anti-onkogénnych signálnych obvodov [8]. Zúženie tejto medzery medzi klinickej a experimentálnej arény bude vyžadovať stratégie, ktoré sú schopné merať a ktoré sa týkajú vzormi aktivity z viac onkogénnych dráh súčasne v primárnych nádorov.

Predchádzajúce štúdie navrhujú pomocou génovej expresie podpisov predpovedať aktivitu onkogénnych dráh v rakoviny [9] - tu sme predpokladali, že vzory aktivácia onkogénne dráhy by mohli byť použité na vytvorenie genómovej taxonómiu GC. Dôležité je, že táto cesta-centric stratégie sa podstatne líši od predchádzajúcich štúdií microarray popisujúcich expresívne zmeny spojené s morfologických a tkanivových rozdielov typu v GC [10], [11], ako dráha podpisy (skôr než na jednotlivé gény) sa používajú ako základ pre klasifikáciu rakoviny , Vyvinuli sme od in silico
metóde mapovania úrovne aktivácii rôznymi cestami v kohorty zložitých primárneho nádoru profilov a overiť touto cestou riadené klasifikácia prístup pomocou proof-of-concept ukážky z rakoviny prsníka. potom sa použije táto metóda GC pre vyhodnotenie jedenásť onkogénne dráhy predtým zapletené v žalúdočnej karcinogenéze [3] - [7], [12] - [17]. Celkovo sme analyzovali viac ako 300 primárnych GC odvodené z troch nezávislých kohorty pacientov, predvádzanie na nášho najlepšieho vedomia najväčší genómovej analýzy GC k dnešnému dňu. Identifikovali sme tri onkogénnych dráh (nukleárny faktor-kB (NF-kB), Wnt /β-katenin a proliferácie /kmeňových buniek), ktoré boli deregulované v drvivej väčšine (> 70%) z GC a funkčne overené ceste predpoveď in vitro
použitie panela GC bunkových línií. Hoci stratifikácia pacient na úrovni jednotlivých dráh sa nepodarilo konzistentne ukazujú značné rozdiely v klinickom výsledku, stratifikácia pacienta onkogénnymi kombináciami biopalivá (napr vysoká proliferácia /high NF-kB vs nízka proliferácie /low NF-kB) ukázala, reprodukovateľné a významné rozdiely prežitie v niekoľkých nezávislých kohorty pacientov, čo ukazuje na dôležitú úlohu pre dráhy kombinácií pri ovplyvňovaní GC klinickej správania. Naše výsledky teda ukazujú, že GC môže byť úspešne taxonomized pomocou onkogénne aktivitu dráhy do biologicky funkčne a klinicky relevantných subtypov.

Výsledky

Predpovedanie Pathway Activation v Cancer profilov génovej expresie

Naša stratégia pre predpovedanie úrovne aktivácie onkogénne dráhy v rakoviny zahŕňa štyri kroky (obrázok 1A). Po prvé, sme definovali 'dráh podpisy "- sady génov, ktoré vykazujú zmenenú expresiu po funkčnej rozrušení konkrétneho ciest v dobre definované vitro
alebo in vivo
experimentálnom systéme. Po druhé, mapované podpisy dráh na profilov génovej expresie z heterogénneho radu nádorových ochorení. Po tretie, pomocou neparametrické, hodnosť-založený postup zodpovedajúci vzor, ​​aktivačný body boli priradené k jednotlivým rakoviny založené na sile pridruženie na podpis dráhy. Nakoniec boli jednotlivé druhy rakoviny usporiadaných založený na ich aktivačných dráha skóre.

Pred použitím tohto prístupu k GC, sme považovali za dôležité potvrdiť to in silico
stratégiu v sérii proof-of -principle experimenty. Vybrali sme si príklad rakoviny prsníka, malígny, u ktorých existuje veľa dôkazov o dráhy heterogenity a diskrétne "molekulárnych podtypov" [18]. Na vykonanie tohto overenia, sa najprv otázka, či už opisovaných dráha podpisy spojené s poruchou signalizáciou estrogénu by mohli byť použité na identifikáciu bunkové línie karcinómu prsníka, ktoré vykazujú vysoké hladiny receptora estrogénu (ER) aktivitu. Analyzovali sme génovej expresie panel 51 prsných rakovinových bunkových línií pôvodne opísaných v Neve a kol. [18] s 11-gen "tamoxifén citlivosti" dráhy podpis odvodené zo zoznamu génov rozdielne exprimovaných medzi maca 3366, ľudský karcinóm prsníka xenoimplantátu tamoxifén citlivé, a Maca 3366 /TAM, s tamoxifénom rezistentné sublinii toho istého xenoimplantátu [19]. Zistili sme, že bunkové línie karcinómu prsníka pozitívne spojená s tamoxifénom podpisom citlivosti vykazoval významne vyššie hladiny expresie ESR1
, estrogén receptor a molekulárnym cieľom tamoxifénu, v porovnaní s líniou vykazujúcich negatívne aktivačné dráhy skóre (p = 2,12 × 10 ^{-7, presnosť 84,3%, senzitivita 100%, špecificita 75%) (obrázok 1B a tabuľka S1).}

Po druhé, ak by bol skúšaný jednou z ciest podpis spojený s estrogénom signalizáciu však pochádza z non prsného tkaniva môžu byť taktiež použité na stratifikáciu rovnakého panelu bunkových línií rakoviny prsníka. dopytované sme rakovina prsníka panel bunkovej línie s 41-génu "estrogénové odozvy" podpis odvodené zo zoznamu génov stimulovaná estradiolu v U2OS ľudského osteosarkómu, bunky [20]. Aj napriek podpis pochádzajúci z iného typu tkaniva (napríklad osteosarkóm), sme opäť zistené, že pri zoradené na základe ich predpokladanej estrogén reagovať, karcinómu prsníka bunkových línií zoskupené podľa ich úrovňou ESR1
(estrogén receptor) výraz (p = 0,0035, presnosť 62,7%, citlivosť 94,7%, špecificita 43,8%) (Obrázok 1C a tabuľka S1). Tieto výsledky ukazujú, že je skutočne možné predvídať vzory aktivácia dráhy v určitom karcinómu záujmu (rakoviny žalúdka v našom prípade) za použitia expresných podpisov získaných z rôznych experimentálnych podmienok a dokonca aj rôzne typy tkanív.

Vzory onkogénnych Aktivácia cestou u GC

Po potvrdení tejto predpovede prístup dráhy, sme pristúpili k uplatniť stratégiu k primárnej GC. Skôr než testovanie každú možnú cestu, sme vybrali jedenásť onkogénne a supresorových dráh predtým zapletené v žalúdočnej karcinogenéze s použitím v našej analýze RAS [4], p53 [5], BRCA1 [12] p21 [13], Wnt /β-katenin [6], E2F [3], SRC [14], MYC [15] NF-kB [21], histónov deacetyláciou (HDAC) [16], a kmeňových buniek podpisy v spojení [17]. Kedykoľvek je to možné, sme sa pokúsili vybrať viac podpisov pre každú dráhu, najlepšie z nezávislých publikovaných štúdií. Napríklad z dvoch E2F aktivačných podpisov používaných v prístupe, jeden z nich musí sa získa tým, že prinúti E2F1 aktivitu u potkanov fibroblastov [22], zatiaľ čo druhý podpis bol získaný za použitia osteosarkómu odvodené bunkové línie, obsahujúce indukovatelný fúzny proteín ER-E2F1 [23]. Konečné dráha predpovede pre ďalšie analýzy boli typicky získané kombinovaním jednotlivých podpisov patriace do rovnakej dráhe (pozri Materiály a metódy).

počítaný sme aktivačný skóre pre jedenásť dráh reprezentovaných 20 dráhy podpisy cez tri nezávislé kohorty primárne GC odvodené z Austrálie (kohorty 1-70 nádory), Singapure (kohorty 2-200 nádory) a Spojenom kráľovstve (kohorta 3-31 nádory). Pre vizualizáciu vzory aktivácie dráhy, my líčil každú skupinu zvierat ako teplotná mapa, kde farba teplotné mapa predstavuje predpokladanú silu aktivácia pre každú dráhy v jednotlivých GC. Pozorovali sme značnú heterogénnosť dráhy aktivácie medzi jednotlivými GC pacientov (obrázok 2A-2C). Avšak, podpisy, ktorý pochádza z nezávislých štúdií, ktoré predstavujú podobné cesty často poskytli podobné vzory pre predikciu (napríklad NF-kB (koža) a NF-kB (cervix)), a test chí-kvadrát potvrdili významné mieru podobnosti v celkových vzorcov dráhy aktivácia medzi Austrálii a Singapure kohorty (p = 0,00038), a medzi Austrálii a Veľkej Británii kohorty (p = 0,00051, viď tabuľka S2), čo naznačuje, že GC dráha predpovede nie sú viazané na konkrétneho súboru pacientov. Identifikovali sme dve hlavné zhluky ko-aktivovanej dráh, ktoré boli úplne konzervované v kohorty 1 a 2 (pozri obrázok 2A a 2B) a väčšinou v konzervovaných kohorty 3 (obrázok 2C). Títo zahŕňali (i) "proliferácia /kmeňová bunka" dráhy klastra (hnedé zvislý pruh na obrázku 2) zahŕňa dráhy spojené s rôznymi regulátormi bunkového cyklu (napr. MYC, E2F, p21) a kmeňových buniek podpisy; a (ii) "onkogénne signálne" cesta klaster (sivá zvislá čiara na obrázku 2), ktoré obsahujú veľa rôznych onkogénnych dráh (BRCA1, NF-kB, p53, Wnt /β-katenin, SRC, RAS a HDAC cesty).

in vitro
Overenie dráhy predpovedí

podľa analýzy GC dráhy teplotné mapa na obrázku 2, sme si vybrali tri onkogénne dráhy (NF-kB, Wnt /β-katenin, a proliferácia /kmeňová bunka), ktoré boli jednotlivo aktivované vo významnej časti GC (≥35%), a v kombinácii za predpokladu, pokrytie väčšiny (viac ako 70%) o GC. Proliferačnej /kmeňové bunky cesty boli aktivované v 40% GC v každej kohorty (rozsah: 38 až 43%), Wnt /β-katenin cesty boli aktivované v 46% GC (rozsah: 43 až 48%), a NF kB cesta bol aktivovaný v 39% GC (rozmedzie: 35 až 41%) (farebné pruhy pri každej teplotnej mapa na obrázku 2). Tieto frekvencie a ďalšie často deregulované dráhy (napr p53) sú uvedené v tabuľke S3.

Ak chcete experimentálne overiť tieto primárne GC dráh predpovede, sme aplikovali algoritmus cesta predikcie do panelu 25 GC bunkových línií (GCCLs) ( obrázok 3). Podobne ako primárny GC, "proliferácia /kmeňová bunka" a "onkogénnu signalizácia 'dráha klastre boli pozorované tiež v GCCLs. Okrem toho, podpisy predstavuje rovnakou cestou, ale získané z rôznych štúdií, napríklad dvoch nezávislých myc-odvodené podpisy [9], [24] tiež zoskupené v GC bunkových línií po dozoru hierarchickej zhlukovej analýzy (fialové zátvorkách na obrázku 3). Vedení dráhy predpovede, sme identifikovali konkrétne GC bunkových línií, ktoré vykazujú vzory onkogénne dráhy činnosti zrkadlenie primárne GCS. Dôvera vo výbere konkrétnych bunkových línií, ako in vitro
modelov bolo tiež dosiahnuté opakovaním postupu Info sedemkrát za použitia rôznych referenčných profilov, ktoré siahajú od strednej GCCL profilu do samostatných profilov, ako sú non-malígne normálne žalúdka profily (pozri materiály a metódy a Tabuľka S4). Párové porovnanie potvrdilo, že nejaké dva referenčné profily boli s väčšou pravdepodobnosťou produkovať súhlasné dráh predpoveď než protichodných predikciou (Text S1 a Tabuľka S4). Niektoré príklady reprezentatívnych línií zahŕňajú AZ521 a MKN28 bunky, ktoré vykazujú aktiváciu proliferácie /kmeňových buniek dráhy, YCC3 a AGS buniek pre Wnt /β-katenin dráh a MKN1 a SNU5 bunky pre NF-kB dráhy.

Najprv sme priamo merať proliferačnej rýchlosti 22 GCCLs a korelované dáta proliferácie kurzov s priemerným skóre aktivácie z podpisov na proliferáciu /kmeňových zhluk bunkového dráhy. Bola významná súvislosť medzi experimentálne stanovené proliferatívne ceny a aktivácia dráhy skóre (R = 0,4688, p = 0,0278) (obrázok 4A). Podporuje myšlienku, že onkogénnych dráh podpisy sú lepšie predikátory dráhy aktivitu v porovnaní s expresiou jednotlivých kľúčových génov dráhy, neboli pozorované žiadne významné združenia buď MYC alebo E2F1 výrazu (p = 0,48 a 0,38 pre MYC a E2F1, v uvedenom poradí) (obrázok S1 ).

Po druhé, za účelom potvrdenia Wnt /β-katenin dráh predpovede, sme analyzovali expresiu rôznych Wnt dráhy komponentov (β-katenin, TCF4) a relatívnej úrovne TCF /LEF transkripčný aktivity v GC bunkové línie predpokladá, že Wnt /β-catenin- aktivovaný alebo Wnt /β-katenin-neaktivovaného. Zo siedmich bunkových línií vybraných pre ich experimentálne ovládateľnosť (napr jednoduchosť transfekcia a vhodných rastových podmienok), sme zistili, že obaja β-katenin a TCF /LEF transkripčný faktor TCF4 (tiež známy ako TCF7L2), hlavné súčasti Wnt signálne dráhy, boli vyjadrené v GC bunkových línií predikovaných aktiváciou dráhy analýzy, ktoré majú vysokú Wnt /β-katenin aktivitu (AGS, YCC3, Kato III, a NCI-N87), ale nie je exprimovaný v dvoch z troch línií (SNU1 a SNU5) súvisiacich s nepravidelne alebo s nízkou aktiváciou skóre Wnt /beta-katenin (Obrázok 4B). Okrem toho, aby sa priamo testu Wnt dráhy aktivitu sme zistili, TCF /LEF transkripčný aktivitu v bunkových líniách za použitia GC Topflash, Luciferase exprimujúce plazmid obsahujúcich multimerizované väzbové miesta TCF. Test Topflash potvrdila vysokú TCF /LEF transkripčný aktivitu v troch zo štyroch GC bunkových línií predpokladá, že majú vysokú Wnt /β-katenin aktivitu (AGS, YCC3 a Kato III), ale žiadne alebo len minimálne Topflash aktivitu v bunkových líniách GC spojené s nekonzistentné či nízke Wnt /β-katenin aktivácia skóre (SNU1, SNU5 a SNU16). Navyše aktivácia skóre β-katenin dráha boli významne vyššie u GCCLs s viac ako dvojnásobným TCF /LEF transkripčný aktivity (AGS, YCC3, Kato III a NCI-N87) ako v GCCLs s nižším TCF /LEF transkripčný aktivity (p = 0,007, Obrázok 4B). Pri porovnaní proti jednotlivých génov, superior združením TCF /LEF transkripčný aktivity boli opäť pozorované na základe priemernej aktivačný skóre z Wnt /β-katenin podpisy v porovnaní s buď beta-kateninu alebo TCF4 (aka TCF7L2) výrazom samotným (p = 0,038 pre podpisy vs. p = 0,31 a 0,58 pre beta-kateninu a TCF4, v uvedenom poradí) (obrázok S1).

za tretie, pre overenie ceste predpovede NF-kB, sme vybrali 11 GCCLs dôsledne predvídať, či už ako NF-κB- aktivovaný ( "NF-kB /o" šesť GCCLs) alebo NF-kB-rozopnutom ( "NF-kB /off", päť GCCLs) (obr S2). Zvýšená génová expresia p50 a P65, heterodiméry podjednotky NF-kB, boli pozorované u NF-kB /o GC bunkových línií v porovnaní s NF-kB /off GC bunkové línie (p = 0,0002 pre P50, p = 0,046 pre P65, obr 4C) a P65 expresiu na úrovni proteínu bola pozorovaná vo veľkej miere v NF-kB /na tratiach (obrázok 4C). Imunocytochemickému na formalínom pevnej parafínu vloženej GC bunkových línií, expresia P65 proteínu sa častejšie pozorované v NF-kB /o GC bunkových línií v porovnaní s NF-kB /off GC bunkových línií z hľadiska jadrovej sublocalization, percentuálny podiel buniek s farbením (buď nukleárne alebo cytoplazmatickej), a farbenie intenzita (tabuľka S5, obr S3). Ak chcete zistiť, či NF-kB /na GC bunkových línií tiež vykazoval diferenciálnej expresie génov P65 regulované v porovnaní s NF-kB /off bunkových línií GC, sme spojili zoznam génov priamo viazané P65 transkripčný faktor [25] pomocou zoznamov gény regulované na úrovni mRNA TNF-a [26], čo je známy induktor aktivácia NF-kB. Za použitia Gene Set Analysis Enrichment (GSEA, [27]), sme zistili, že P65 cieľových génov stimulovaná liečby TNF-a boli výrazne nadmerne exprimovaný v NF-kB /na GC bunkových línií v porovnaní s NF-kB /off bunkových línií GC (normalizovanej obohatenie skóre, NES = 1,86; false discovery rate, FDR < 0,001, Najspodnejšie panel, obrázok 4C). Naopak, P65 cieľové gény downregulated TNF-a boli významne underexpressed v NF-kB /o GC bunkových línií v porovnaní s NF-kB /off bunkových línií GC (NES = -1,56, FDR = 0,019, Najspodnejšie panel, obr 4C). A konečne, aby sa priamo sa potvrdila prítomnosť zvýšenej NF-kB aktivity, transfekované sme tri NF-kB /z bunkových línií GC a dvoch NF-kB /off GC bunkových línií s luciferázovým reportérom, ktorý obsahuje reportéri gén NF-kB. Ako je znázornené na obrázku 4D, tri NF-kB /z bunkových línií GC vykazovali zvýšenú NF-kB transkripčný aktivitu v porovnaní s dvoma NF-kB /off GC bunkové línie (p = 0,0084).

V úhrne, tieto výsledky podporujú koncept, že in silico
dráhy predikciou pomocou profilov génovej expresie sú spojené s aktiváciou príslušnej dráhy in vitro
.

dráhy Kombinácia predpovedať, karcinóm žalúdka prežitie pacientov

záujme posúdiť klinický význam zistených dráhy podskupín, sme skúmali, či vzory dráhy spolupráce aktivácia ako je znázornené na teplotných mapách rôznych kohorty môže súvisieť prežitie pacienta. Použili sme celkové údaje o prežitie z kohorty 1 a kohorty 2 a rozvrstvené pacientov tým, že sa predpokladaných vzormi aktivácia dráhy. Primárna profil GC bola definovaná ako ukazuje vysoký stupeň aktivácie dráhy, keď aktivácia polčas nad nulou - tj. Je pozitívne spojená s podpisom dráhy. skupiny pacientov rozdelení buď zastaviť aktiváciu proliferácie /bunkovej dráhy skóre samostatne alebo NF-kB aktivácia dráhy skóre sám sa významne nelíšili vzhľadom na ich celkovom prežitie (p > 0,05 pre proliferáciu /kmeňových buniek a NF-kB v oboch kohorty, 5A a 5B). Avšak, keď sa aktivačný skóre dráh v kombinácii, pacienti s vysokými hladinami Aktivácia oboch NF-kB a proliferácie /kmeňových buniek dráhy majú výrazne kratšie prežívanie v porovnaní s pacientmi s nízkymi hladinami aktivácia oboch NF-kB a proliferácie /kmeňových buniek ciest (p = 0.0399 a p = 0,0109 pre kohorty 1 a 2 v tomto poradí, obrázok 5D).

Aktivácia Wnt /β-katenin dráhy bola významne spojená s prežitím pacientov v kohorty 1, (p = 0,0056, 5C) ale nie v kohorty 2 (p = 0,0693, 5C). Avšak, pacienti v kohorty 1 a 2 s vysokou úrovňou aktivácie oboch Wnt /beta-kateninu a proliferácie /kmeňových buniek ciest mali významne horšie prežívanie v porovnaní s pacientmi s nízkymi hladinami aktiváciu oboch dráh (p = 0,0073 a p = 0,0086, Obrázok 5E ). Ak chcete mierka príspevky kombináciou dráhy proti známych kritérií histopatologických sme vykonali multivariačný analýzy vrátane kombinovanej dráhy prognózami a stupni patologických nádorov (TNM klasifikácia: výlety 1-4), najdôležitejšie prognostický faktor GC [28]. V oboch kohorty, kombinované aktivácia proliferácie /kmeňových buniek a NF-kB cesty sa ukázalo byť nezávislý prognostický faktor zo stupňa nádoru (p = 0,003 a 0,048 pre kohorty 1 a 2, v danom poradí) (tabuľka S6). Rovnako tak v kombinácii aktivácia proliferácie /kmeňových buniek a Wnt /β-katenin dráhy bol nezávislý prognostický faktor v kohorty 1 a dosiahol hraničné význam v kohorta 2 (p nižšie ako 0,001 a p = 0,058, stolný S7). Tieto výsledky ukazujú, že posúdenie kombinovaného stavu aktivácie cesta je klinicky relevantné a navyše môže poskytnúť ďalšie prognostickú informáciu a to nad rámec súčasného zlatého štandardu predikcie prognóza pacienta je TNM založený nádor staging.

Diskusia

V tejto štúdii sme sa snažili rozdeliť GCS do molekulárno homogénnych podskupín ako prvý krok k individualizácii starostlivosti o pacientoch a zlepšenie výsledkov. Dôležité je, že na rozdiel od predchádzajúcej GC microarray štúdie týkajúce génovej expresie vzory histologického typu alebo anatomické typu [10], [11], rozhodli sme sa založiť naše GC triedením na vzoroch onkogénne dráhy činnosti. Po vývoji a validácii tento nový klasifikačný prístup, sme boli schopní popísať, prvýkrát, genómovej taxonómiu GC založenú na vzoroch onkogénne dráhy činnosti. Náš prístup je zvlášť vhodný pre expresiu génu microarrays, pretože tieto platformy dopytovania tisíce mRNA transkriptov v každej vzorke, čo umožňuje posúdenie viac spôsobmi súčasne v jednom experimente. Na rozdiel od toho tento prístup nie je v súčasnosti možné na úrovni proteínu v dôsledku nedostatku vhodných platforiem. Použitím tejto stratégie, sme identifikovali tri dominantné ciest ukazujúce aktiváciu vo väčšine (> 70%) GC: proliferácie /kmeňových buniek, Wnt /p-katenin a NF-kB signalizácia

Možnosť vykonávať. ako "vysokou priepustnosťou cesta profilovanie" otvára mnoho zaujímavých ciest. Napríklad, niekoľko štúdií už predtým hlásené nekonzistentné výsledky týkajúce sa prognostického vplyvu rôznych onkogénnych dráh v GC - prognostické dôsledky antigénov súvislosti so šírením zbraní, ako Ki-67 v GC nie sú pevne stanovené [29] a vysokú aktivácia NF-kB v GC bol spájaný s dobré aj zlé výsledky GC pacientov v rôznych štúdiách [7], [30]. Je celkom možné, že niektoré z týchto nedôslednosti môže boli kvôli historickým zameraním na použití bežných postupov a analýzu buď jednotlivé cesty či jednotlivé komponenty dráh (gény /proteíny). Naše pozorovania, že dráha kombinácie sú prediktívne výsledku pacienta naznačuje, že dráha kombinácia, skôr než samotné jednotlivé dráhy, môže hrať kľúčovú úlohu pri ovplyvňovaní správania nádoru.

Ďalšou výhodou vysokou priepustnosťou dráhy profilovanie je schopnosť definovať vyšších rádov vzťahy medzi odlišnými onkogénnych dráh. V aktuálnej štúdii sme dôsledne dodržiavať súčasne aktivácii E2F, MYC, p21 (-repression) a kmeňových buniek dráh v nádoroch (ďalej len "proliferácie /kmeňových buniek" cesta klastra). To je s najväčšou pravdepodobnosťou v dôsledku zvýšenej proliferáciu buniek v nádorových bunkách, ako je E2F je dôležitá v konaní proliferácie buniek a MYC je ako p21-represor a induktor cyklin D2 a cyklin-dependentné kinázy viažuci proteín CksHs2 [31]. Okrem toho, kmeňové bunky, najmä embryonálne kmeňové bunky (regulátory otáčok), sú tiež známe, že vykazujú vysoké rýchlosti proliferácie buniek [32]. Viac Je zaujímavé, že tiež pozorovali úzkej súvislosti medzi zdanlivo funkčne rôznymi cestami, ako je napríklad beta-kateninu a SRC, ako aj inhibíciu HDAC a BRCA1. Takáto cesta ko-aktivačný vzory môžu navrhnúť funkčné interakcie medzi týmito cestami, ktoré si zaslúžia byť ďalej skúmaná. Napríklad, je možné, že aktivovaný c-SRC môže zvýšiť expresiu Wnt signálnej dráhy [33]. Skúmanie vzťahov medzi cestami vykazujúcich ko-aktivácia tak môže poskytnúť cenné informácie, pokiaľ ide o schopnosť nádorových buniek, koordinovať činnosť viacerých spôsobmi.

Tretí výhoda tohto prístupu cesta profilovanie, je to, že uľahčuje identifikáciu major ochorenie súvisiace s cesty. Z ciest analyzovaných v tejto štúdii, zistenie, že NF-kB signalizácia môžu byť zvýšené v významnej časti GC si zaslúži pozornosť ako táto cesta je relatívne menej preskúmaná GC. Je zaujímavé, že zatiaľ čo sme pozorovali výrazný rozdiel v oboch p50 a P65 (NF-kB podjednotky) génovej expresie medzi NF-kB /o a NF-kB /off GCCLs sme nespozorovali zjavnou expresiu rozdiel p50 proteínu v týchto riadkov, v kontraste k P65 (Obrázok 4C). To môže byť spôsobené kombináciou troch dôvodov. Po prvé, je absolútny rozsah P65 génovej expresie v celej bunkovej línie, je výrazne väčší, než absolútna rozsahu p50 génovej expresie (viac ako 3 x, obr S4). Po druhé, Western blot test slúži na vykonávanie týchto meraní proteínov je známe, že je veľmi non-kvantitatívne, ktoré môžu maskovať jemné rozdiely vo vyjadrení. Po tretie, okrem expresie génu p50 expresie je tiež predmetom rôznych post-transkripčný regulačné mechanizmy, ako je prekurzor štiepenie, ktoré by mohli mať vplyv na konečnú úroveň p50 proteínu, zatiaľ čo P65 nie je generovaný z prekurzorového proteínu [34]. NF-kB bolo preukázané, že sa aktivuje H. pylori
[35], čo je známy karcinogén GC, a aberantne signalizácia NF-kB sa tiež podieľa na viac zápaly spojené rakoviny, ako je GC [36]. NF-kB bolo navrhnuté, aby sa konštitutívne aktivované v primárnych karcinómov žalúdka v niekoľkých štúdiách [7]. Cielené NF-kB-inhibítory sú v súčasnej dobe aktívne rozvíjať v mnohých programoch rozvoja liek proti rakovine a podskupina pacientov GC (teda tie, ktoré sa zvýšenou NF-kB aktivity), môžu predstavovať vhodnú podtriedu pre vyhodnotenie účinnosti týchto zlúčenín.

in silico
metódy použité v našej štúdii je koncepčne podobný prácu Bild et al, ktorý používal binárne regresného modelu pre klasifikáciu nádorov na základe predpokladanej aktivity piatich onkogénnych dráh [9]. Na rozdiel od binárne regresia, náš prístup, ktorý využíva pripojenie metriky rank na báze [37], nevyžaduje žiadnu zložitú tréningového procesu na každej dráhy podpisu a tiež nevyžaduje dostupnosť surovín expresných dát, čo uľahčuje používanie mnohých verejne dostupné dráha podpisy v literatúre [27]. Avšak výraz prístup založený gén robí majú svoje obmedzenia. Po prvé, pretože naše dráha predpovede sú založené na génovú expresiu skôr než proteínov, také predpovede sú síce molekulárnej náhrady ozajstné dráha signálne aktivitu. Po druhé, sme v súčasnosti obmedzuje na analýzu známy onkogénnych dráh predtým zistené v literatúre. Po tretie, aj keď sme boli schopní používať dráh podpisov od veľmi rôznych kontextoch tkanív predpovedať stav aktivácie dráha, preskúmanie pôvodných proof-of-princíp príkladov s karcinómom prsníka bolo zistené, že združenie stavu ER estrogén reagovať, ako sa očakávalo s použitím podpis osteosarkómu , aj keď významná, bol výrazne slabší v porovnaní s združenia stavu ER tamoxifén citlivosti predpokladá použitie podpise odvodené z rovnakého typu tkaniva (tj prsníka). Tento výsledok znamená, že môžu existovať aj tkanivovo špecifické rozdiely v dráhy podpisov, ktoré môžu mať vplyv na presnosť predikcie. Po štvrté, v porovnaní s našou štúdie ktorý sa zameral na dráhach o známej biologického hľadiska v GC, nie je jasné, či táto metóda môže byť použitá pre ochorenie, pri ktorých predchádzajúce znalosti zúčastnených dráh nemusí byť k dispozícii. Malo by však byť poznamenané, že bohatstvo dráhy podpisov (viac ako 1000), spojené s rôznymi biochemickými a signálnych dráh už v literatúre, ktoré je prístupné z verejných databáz, ako je MSigDB (http://www.broad.mit existuje .edu /gsea /msigdb /genesets.jsp? zbierka = CGP). Vzhľadom k tomu, náš prístup môže byť aplikovaný na prakticky akékoľvek dátové sade ochorenie, pre ktoré sú k dispozícii informácie o génovej expresie, testovanie každý podpis v high-throughput spôsobom za účelom zistenia dráhy deregulácie je ako mysliteľné a možné. V takýchto prípadoch je dráha vykazujúci vysokej frekvencie deregulácia by potom predstavuje kandidáta dráhy zapojené do danej nákaze, ktoré potom môžu byť cielené pre cielené vyšetrovanie a experimentovanie. Riešenie týchto problémov bude tvoriť základ pre veľa budúci výskum.

Na záver sme ukázali v tejto práci, ktorá dráh podpisy môžu byť úspešne použité na predikciu stav aktivácie bunkových signálnych dráh, a to aj v biologických subjektov ako komplexu ako ľudská GC. Jedným zo zrejmých okamžité uplatňovanie týchto taxonómie dráhy na báze sa môže týkať použitia cielených terapií. Počiatočné štúdie hodnotiace úlohu cielených terapií v GC preukázali len skromné ​​výsledky [38]; Avšak, väčšina z týchto štúdií boli vykonané bez predchádzajúceho rozvrstvenie pacientov pomocou molekulárnej alebo histopatologické kritériá.

• Ploche ONE: Umlčanie Claudin-11 je spojená so zvýšenou invazivitě Žalúdočné nádorových buniek
• Ploche ONE: Aberrant Vyjadrenie Cx43 je spojený s peritoneálnej metastázy rakoviny žalúdka a Cx43 sprostredkovaná Gap Junction Zvyšuje Žalúdočné Cancer Cell diapedézy z peritoneálnej mezo…