Ploche ONE: Exkluzívne Association of p53 mutácie sa Super-High metylácie nádorových supresorových génov v p53 v jedinečnom Žalúdočné Cancer Phenotype

abstraktné

Pozadie

Komplexné hľadanie DNA methyluje génov identifikovaných kandidát tumor supresorové gény, ktoré sa osvedčili, aby sa zapojili do apoptotického procesu p53
dráhy. V tejto štúdii sme skúmali p53
mutácie v súvislosti s takým epigenetické zmeny v primárnej rakoviny žalúdka

Metódy

metylácie profily 3: génov. PGP9
. 5
NMDAR2B stroje a CCNA1
, ktoré sú zapojené do p53 nádorového supresor dráhy v kombinácii s p53
mutácie boli skúmaná u 163 primárnych karcinómov žalúdka. Účinok epigenetické reverzia v kombinácii s chemoterapeutikami na apoptózu sa hodnotila aj pomocou nádoru status p53
mutácie.

Výsledky

p53 génu
mutácie boli nájdené v 44 primárnych nádorov žalúdka (27%), a super-vysoká metylácie podľa ktoréhokoľvek z 3 génov bola nájdená iba v prípadoch, s divokým typom p53
. Vyššia p53
dráha aberácie bola nájdená v prípadoch s mužské pohlavie (p = 0,003), črevné typu (p = 0,005), a typu non-infiltrujúcej (p = 0,001). p53
dráha aberácie skupina vykazovala menej opakovaní v lymfatických uzlinách, vzdialených orgánov a pobrušnicu než P53
non-aberácie skupiny. V žalúdočné rakovina bunkové línie NUGC4 ( p53
divoký typ), epigenetické liečba rozšírený apoptóza podľa chemoterapeutík, čiastočne prostredníctvom p53
transkripčný aktivity. Na druhej strane, v bunkovej línii karcinómu KATO III ( p53
mutantný), epigenetické liečby sám indukovanú apoptózu robustný, bez trans-aktivácie p53
.

záver

V prípade rakoviny žalúdka, p53
existujú relevantné a nerelevantné cesty a nádory s jedným druhom dráhy vystavené jedinečné klinické prejavy. Epigenetické liečba môže vyvolať apoptózu čiastočne cez aktivácia p53
, však ich apoptotické účinky môžu byť vysvetlené prevažne mechanizmom iným spôsobom ako prostredníctvom p53
cesty

Citácia :. Waraya M, Yamashita k Ema A, N Katada, Kikuchi s, M Watanabe (2015) Exkluzívne Združenie p53
Mutácie sa Super-High metylácie nádorových supresorových génov v p53
Pathway v jedinečnom žalúdočnej rakovina fenotyp. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

Editor: Qian Tao, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong

prijatá: 31. marca 2015; Prijaté: 18.září 2015; Uverejnené: 08.10.2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená z časti grantom pomôcka pre výskum rakoviny z ministerstva zdravotníctva, práce a sociálnych vecí Japonska a japonskej nadácie pre multidisciplinárny liečbe rakoviny. Tieto agentúry pre financovanie mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zhromažďovanie dát alebo analýzy; pri interpretácii výsledkov; pri príprave rukopisu; alebo v rozhodnutí predložiť rukopis k publikácii

Konkurenčné záujmy :. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

metylácie DNA hrá kľúčovú úlohu pri. umlčanie génov nádorových supresorových génov v ľudskej rakoviny. Metylačnej gén pre karcinóm špecifických je vzácna jednotka, a časté aberácie metylácie v primárnych nádorových tkanivách je ešte vzácnejší [1, 2]. Identifikovali sme s rakovinou špecifické denaturovaný gény v každom orgáne za použitia farmakologickú odmaskovaniu microarray (PUM) [1, 2] a upravený PUM [3-5]. Identifikovali sme veľa kandidát tumor supresorové gény (ZTS), napríklad PGP9
. 5
v oblasti hlavy a krku z dlaždicových buniek karcinómu (HNSCC) [2], pažeráka SCC (ESCC) [6] , karcinómu žalúdka [4], a ostatné rakoviny [7], NMDAR2B
v ESCC [3] a rakovina žalúdka [8], a CCNA1
v HNSCC [2]. Metylácia profily týchto génov, ktoré boli potvrdené inými skupinami a /alebo aj iných druhov rakoviny [9-14]. Gény, ktoré vykazovali viac ako 60% metylácie v nádorových tkanivách, boli označené ako vysoko relevantné metylovaných génov (HRMGs) [15]. Navyše sme ďalej porovnávali frekvencia takejto aberantne metylácie kandidátskych HRMGs s ďalšími správami o rakoviny žalúdka [16] a génovej kandidáti boli zúžil na špecifických génov.

A čo je najdôležitejšie, boli títo supresorové gény kandidát nádorové uvádza ako v p53
nádorový supresor dráhy (obrázok 1). Napríklad PGP9
. 5
priamo interaguje s p53 stroje a stabilizuje p53
inhibíciou jeho degradácie cez ubiquitinace dráhy v hepatocelulárnym [17] , prsníka [18], a rakoviny nosohltana [19]. NMDAR2B
vyvoláva apoptózu prostredníctvom priamej interakcie s DAPK
[20], ktorý, podľa poradia, bol demonštrovaný proti transformáciu onkogénu vyvolanú aktiváciou a p19ARF
/ p53
-dependentních proapoptotický kontrolnom bode [21]. CCNA1
je p53
indukovanú génu, ktorý sprostredkováva apoptózu, G2 /M zástave a mitotickú katastrofu v ľudskej obličiek, vaječníkov a rakoviny pľúc buniek [22]. Preto, p53
dráha je ablácia v nádorových tkanivách primárnych nádorov v epigenetické spôsobom spolu s divokým typom p53
však nedošlo správa týkajúca sa pridruženia p53
mutácie a epigenetické zmeny v primárnych nádorových tkanivách.

v tejto štúdii sme skúmali DNA metylačného statusu génov v p53
dráhy, ktoré sú abnormálne regulované v epigenetické spôsobom v primárnom žalúdočných rakoviny a porovnanie ich metylácie vzor s p53
status mutácia za účelom zistenia, klinický význam p53
aberácie fenotypov.

metódy

Cell linky a vzorky tkaniva

žalúdočné rakovina bunkové línie, KatoIII, NUGC4, AZ521 a SH10 boli zakúpené od Riken BioResource Center (Ibaraki, Japonsko). A hepatocelulárneho karcinómu bunková línia HepG2 bola získaná od American Type Culture Collection (Manassas, VA). Tieto bunkové línie s výnimkou AZ521 a HepG2 boli pestované v médiu RPMI 1640 (GIBCO, Carlsbad, CA), doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra. AZ521 a HepG2 boli pestované v DMEM médiu (Gibco), doplnenom 10% FBS.

Páry (n = 163) formalínom fixované, zaliatych v parafínu (FFPE) nádorového tkaniva a zodpovedajúce normálne slizničnej vzorky získané pri najmenej 5 cm od okraja nádoru boli získané od pacientov podstupujúcich chirurgický zákrok obdobie od 1. januára 2000 do 31. decembra 2010. Všetci pacienti s fáze II /III GC prešla potenciálne kuratívnu resekciu pre primárne GC, a podstúpil pomocné látky s -1 chemoterapia po chirurgickom zákroku (S-1 štandardná liečba). Neo-adjuvantná liečba nebola vykonaná v tomto súbore pacientov. Nádory boli rozdelené podľa klasifikácie TNM podľa 7. ^{ročník Únie pre medzinárodný boj proti rakovine (UICC) a 14 th vydanie japonského klasifikácie karcinómu žalúdka (JCGC). charakteristika pacientov sú uvedené v tabuľke 1. Všetky vzorky tkaniva boli odobraté v Kitasato fakultnej nemocnice a písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov a zdravých darcov pred odberom vzorky. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou z Kitasato univerzity.}

Analýza mutovaných p53
génov s použitím jednovláknových konformačního polymorfizmu (SSCP)

mutácie v exóne 5, 6, 7 a 8 p53
génom boli testované non-rádioaktívny analýzy Jednopramenné konformačního polymorfizmu (SSCP), ktorá bola vykonaná pomocou našich skôr zavedených metód [23]. PCR vzorky výrobku o objeme 10 ul sa zriedi trojnásobne s gél-nanášacieho pufra (95% deionizovanej formamid, 20 mmol /l EDTA, 0,01% brómfenolovej modrej a 0,01% xylenkyanolu) a zahrieva na teplotu 95 ° C počas 10 min, nasledované prudkým ochladením na ľade. Alikvótne 3 ul boli nanesené na modifikovanej polyakrylamidových géloch (PAFG: 18% polyakrylamidové-bis (49: 1), 0,5 x TBE, 10% glycerol, 10% formamidu, 0,05% APS amónneho a 30 ml TEMED) s rozmermi 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforéza bola vykonaná s 1,5 x TBE pufer pri 500 V a 30 mA po dobu 1 hodiny pri izbovej teplote. Pásy boli detekované farbením gélov pomocou farbenie striebrom a navyše kit (Bio-Rad, Hercules, CA), nasledovaný fixáciou, oplachovanie, vývoj a zastavenie reakcie. Mutované pásy detekované PCR-SSCP boli evidentné pri 1:64 riedenie mutovaných alel.

bisulfitového extrahované DNA

genómovej DNA FFPE tkanív a bunkových línií bola extrahovaná s použitím QIAamp DNA FFPE tissue Kit (Qiagen Sciences, Maryland, MD) a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) podľa protokolu výrobcu. Pre DNA denaturáciu, 2 ug genómovej DNA bola inkubovaná s 5 ug DNA z lososieho spermií v 0,3 mol /l roztoku hydroxidu sodného po dobu 20 minút pri teplote 50 ° C. Vzorka DNA sa potom zriedi 500 ul roztoku, ktorý obsahuje 2,5 mol /l metabisulfit sodný (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrochinón (Sigma) /0,4 mol /l roztoku hydroxidu sodného, a bola inkubovaná pri teplote 70 ° C počas 1,5 hodiny. Vzorka bola potom nanesený na stĺpec (Wizard DNA Clean-up systém, Promega Inc., Madison, WI), inkubované s 0,3 mol /l roztoku hydroxidu sodného po dobu 10 minút, a následne sa spracuje s 3 mol /l octanu amónneho po dobu 5 minút. Vzorka sa vyzráža v 100% etanolu a DNA bola resuspendovaného v 50 ul Lote obsahujúcim 10 uM Tris-HCl, pH 8 a 2,5 uM etyléndiaminotetraoctová kyselina octová (EDTA), pH 8, a následne bol amplifikovaný polymerázovou reťazovej reakcie (PCR). Bisulfitová liečenie vedie k chemickej modifikácie nemethylovaných, ale nie metylovaných cytozinov, až uracil, čo umožňuje rozlíšenie medzi methylata a nemethylované genómovej DNA.

Kvantitatívny-metylácie-špecifické PCR (Q-MSP)

Pre kvantitatívnu analýzu metylácie, TaqMan metylácie špecifická PCR (Q-MSP) bola vykonaná za použitia iQ ™ multiplexové Powermix (Bio-Rad) v troch vyhotoveniach na iCycler iQ ™ Real-Time PCR systém detekcie (Bio-Rad). Podmienky PCR a sekvencie sú uvedené v tabuľke S1. Sériová riedenie hydrogensiričitanovú upravené CpGenome univerzálny methylata DNA (Chemicon International, Temecula, CA) boli použité pre konštrukciu kalibračnej krivky na každej doske, ako metylácie pozitívne kontroly a CpGenome univerzálne nemethylované DNA (Chemicon International) bola použitá ako negatívna kontrola. Hodnota metylácie (TaqMeth hodnota) bola definovaná ako pomer methyluje PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1
, alebo DAPK
normalizované na metylovaného beta-aktínu
, ktorý bol potom vynásobí 100.

imunohistochemickým farbením PGP9.5, NMDAR2B a CCNA1

immunostaining, antigén Odhalenie bola vykonaná v autokláve namáčanie, endogénne peroxidázou aktivita bola blokovaná inkubáciou v 3% H _{2O 2 /metanol po dobu 5 minút, a väzba nešpecifické protilátky bola blokovaná inkubáciou s 1% zriedenou normálnym konským sérom na 30 minút. Rezy potom boli inkubované pri teplote 4 ° C cez noc s nasledujúcimi protilátkami: králičie polyklonálne protilátka PGP9.5 (riedenie 1 :. 200, Nonus biogeneze), králičie polyklonálne protilátka NMDAR2B (riedenie 1: 100, Millipore), alebo myšou cyklin A monoklonálna protilátka (6E6, riedenie 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Imunitný komplexy boli detekované v súprave Vectastain elitnej ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) podľa inštrukcií výrobcu. Tieto imunitné komplexy boli detekované za použitia 3,3'-Diaminobenzidine substrát (Vector) ako chromogénu (PGP9.5 1,5 minúty, NMDAR2B 6 minút, CCNA1 10 minút). Rezy boli kontrastne hematoxylínom.}

Čistenie epigenetické s 5-Aza-DC a TSA, a chemoterapeutickej liečby CDDP

Bunky boli rozdelené a schovať v nízkej hustote (1x10 ^{6 /T-75 banka) 24 hodín pred ošetrením. Bunky potom boli ošetrené každých 24 hodín počas 4 dní s 1 alebo 5 uM 5-aza-2'-deoxycytidínu (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sa rozpustí v 50% kyseline octovej, alebo boli ošetrené mock s PBS, vrátane rovnaké množstvo kyseliny octovej. Ako už bolo uvedené, 100 nM trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). A /alebo 12,5 uM cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japonsko) bol pridaný pre konečné 24 hodín}

Western blot analýza

Celkový proteín bol extrahovaný z bunkových línií, ktoré boli epigenetické liečení /bez chemoterapeutickej liečby, a bol podrobený analýze Western blot za použitia nasledujúcich protilátok: myšou anti-p53 monoklonálne protilátky (1C12, riedenie 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) alebo myšou anti-β-aktínu IgG _{2 a monoklonálne protilátky (riedenie 1: 10000, Sigma-Aldrich)}

p53 reportéri test

Cells (2x 10 ^{4 buniek /platňu s 96 jamkami), ktoré boli liečené epigenetické s /bez chemoterapeutickej liečby boli transfekovány s p53
reportér vektor (QIAGEN) pomocou signálu ™ dráhy reporter Kits ( QIAGEN) a činidlá Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Po 24 hodinách inkubácie sa reportér aktivita bola meraná s použitím Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). Transfekcia boli vykonané trojmo a analyzované pomocou softmax Pre softvér (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

apoptóza test

Ošetrené bunky (1 x 10 ^{5 buniek /vzorka) boli zafarbené annexin v a 7-AAD (Guava nexin činidlo, Guava Technologies, Hayward, CA) pre diskrimináciu skorých a neskorých apoptotických buniek, v danom poradí. Experiment sa uskutočňuje za použitia Guava PCA systému, vykonáva trikrát a analyzujú s použitím softvéru CytoSoft 2.1.5 (Guava Technologies).}

Štatistická analýza

Fisherov presný test, alebo Mann-Whitney U test bol použitý pre kategorické premenné, a Student je t
-test bol použitý pre kontinuálne premenné. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Spôsob podľa Kaplan-Meiera bola použitá na odhad kumulatívne mieru prežitia, a rozdiely v miere prežitia boli hodnotené pomocou log-rank testu. Relapsu free survival (RFS) a celkové prežívanie (OS) boli merané odo dňa prevádzky do dátumu návratu ochorenia a úmrtia, alebo posledný sledovanie. S ohľadom na RFS alebo OS, u pacientov, ktorí prežili dlhšie ako 60 mesiacov (5 rokov), boli analyzované, ako prežili. P menšia ako 0,05 bola považovaná za označujú štatistickú významnosť. Všetky štatistické analýzy boli vykonané s softvérových balíkov SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Výsledky

p53
génu stav a metylácie profily PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1 stroje a DAPK
v pStage II-III rakovinou žalúdka

p53
mutácie boli zistené v 44 zo 163 primárnych pacientov s rakovinou žalúdka (27%) analýzou SSPC. p53
génová mutácia nemala prognostický význam (obr 2A). Potom sme analyzovali metylačnej profily PGP9
. 5
NMDAR2B
CCNA1 stroje a DAPK
v týchto tkanivách použitím Q-MSP. Hodnota TaqMeth všetkých génov bola vyššia u primárnych nádorov rakoviny žalúdka s divokým typom p53
ako u tých, ktorí mutantný p53
(Gene metylácie poradí :. PGP9
5 Hotel > NMDAR2B Hotel > CCNA1 Hotel > DAPK
) (obr 3A a S1 a S2 obr). Metylácia DNA promótor bol výrazne vyšší u CCNA1
(p 0,0001) a PGP9
5
(p = 0,03) a okrajovo výrazne vyššia u NMDAR2B
(p = 0,10) a DAPK
(p = 0,05) u primárnej rakoviny žalúdka v porovnaní so zodpovedajúcou normálnou sliznicu. Dôležité je, že super-vysoký stupeň metylácie PGP9
. 5
NMDAR2B stroje a CCNA1
bola výhradne nájdený v primárnych nádorov so žiadnym p53
mutáciu, cut-off hodnoty TaqMeth boli 50, 163 a 133, v uvedenom poradí (obr 3A). Ako super-vysoká metylácie PGP9
. 5
, NMDAR2B stroje a CCNA1
bola nájdená v 14, 19 a 8 vzoriek, respektíve, a niektoré z týchto vzoriek boli prekrývajúce sa (obr 3b). DAPK
nevykazovali tento trend, pretože DAPK
úroveň metylácie bola pomerne vysoko v zodpovedajúcich normálnych sliznice tkanivách značnej časti prípadov (S2 obr).

Imunohistochemické analýza PGP9.5, NMDAR2N a expresiu proteínu v CCNA1 primárnej rakoviny žalúdka

Imunohistochemické farbenie pre PGP9.5, NAMDR2B a expresie CCNA1 proteín sa potom robí tak v prípadoch, s mimoriadne vysokou metylácie a tie s nízkou metylácie týchto génov. Silný pokles expresie PGP9.5, NMDAR2B a CCNA1 bola pozorovaná v primárnych karcinómu žalúdka tkanív, keď je promótor DNA metylácie je super-vysoká (obr 3). Na druhej strane bolo zistené, že žiadny pokles expresie proteínu z PGP9.5, NMDAR2B alebo CCNA1 keď promótor DNA metylácie bola nízka (obrázok 4).

klinicko-analýza v primárnej rakoviny žalúdka s patologickou fáze II /rakovina žalúdka III so štandardnou liečbou

klinicko-funkcie a prognóza (5-ročné RFS a OS) potom boli analyzované v univariable spôsobom u karcinómu žalúdka s patologickou fáze II /III rakovinu žalúdka so štandardnou liečbou (chirurgia a navyše pooperačných S-1 riadenie) (tabuľka 1). klasifikovaný sme pacientov s rakovinou žalúdka do 3 kategórií založených na p53
stav mutácie rovnako ako stav metylácie DNA zo PGP9
. 5
NMDAR2B
a CCNA1
, ktorú označujú ako genomických a epigenetických kategórií, respektíve (GEC). Tieto tri kategórie boli p53
mutant, p53
divokého typu s mimoriadne vysokou metylácie (SHM) výšky 3 p53
dráhy génov ( p53
WT /SHM) a p53
divokého typu bez (w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Je zaujímavé, že skupiny pacientov klasifikované na základe na GECs významne koreluje s pohlavia (p = 0,0003), vek (p = 0,08), Laurenův histológie (p = 0,005) a infiltrácie vzoru (p = 0,001), ale nie s prognostické faktory, ako je napríklad zastávok faktormi. skupiny pacientov klasifikované na základe GECs tiež ukázal, že p53
mutant a p53
WT /SHM skupiny boli podobné, pokiaľ ide o počet pacienta pre každé klinickej charakteristiku, ale líšili sa v tomto smere v porovnaní s p53
WT w /o skupine SHM. Preto sme novo označuje bývalej skupiny ( p53
mutantný plus p53
WT /SHM skupiny) ako p53
aberácie skupiny a druhej skupiny ( p53 WT
w /o SHM) bol určený ako p53
non-aberácie skupiny.

Aj keď prognóza nebol významný rozdiel medzi skupinami roztriedených podľa GEC (Obr 2B ), viac opakovaní boli nájdené v p53
aberácie skupiny v porovnaní s p53
non-aberácie skupiny (tabuľka 1, žiadny štatisticky významný rozdiel). Tento trend bol zachovaný, pokiaľ ide o opakovaním každého z lymfatických uzlín, peritoneum a vzdialených orgánoch (tabuľka 2), čo naznačuje, že p53
aberácie skupina je pravdepodobné, že vykazujú klinicky jedinečný fenotyp iz prognostický uhol pohľadu. Keď boli analyzované iba prípady s recidívami, p53
aberácie skupina bola opäť výrazne spojená s Lauren histológiu (tabuľka 2, P = 0,01), však neboli opakovanie vzorov, ktoré boli jedinečné p53
aberácie.

na druhej strane, difúzny typ rakoviny žalúdka ukázali výrazne lepšiu prognózu ako črevnú typu rakoviny žalúdka v p53
aberácie skupiny (Obr 5A). Pretože títo pacienti inklinoval byť distribuované do vyššieho stupňa, tieto údaje naznačujú, že prežitie S1 pooperačnej adjuvantnej chemoterapie je účinnejšie pre rakovinu žalúdka rozptyľovať typ ako pre črevné typ rakoviny žalúdka v prípadoch s p53
dráha aberácie (obr 5B).

a nakoniec, ako referenčných dát (tabuľka 1), univariable prognostická analýza RFS a OS všetkých pacientov identifikované klinicky významné potenciálne prognostické faktory predstavujúce zlú prežitie, ako je pohlavie (p = 0,03, P = 0,1) , vek ≥67 rokov (p = 0,009, p = 0,001), horné lokalizácia nádoru (p = 0,06, P = 0,1), pričom 14 ^{th JGCA /7 th UICC pT (p = 0,08, P = 0,4), pričom 14 th JGCA PN (p = 0,001, p = 0,06), a 14 th JGCA /7 th UICC fáze (P <. 0,0001, P = 0,03)}

epigenetické ošetrenie vyvolanej p53 expresie proteínov, v zhode s p53 transkripčný aktivity

epigenetické liečba NUGC4 karcinómu žalúdka bunkových línií (divoký typ p53
) s 5 uM 5-aza-2 ' deoxycytidínu alebo 5 uM 5-aza-2'-deoxycytidínu a trichostatin a robustne indukovanú apoptózu v neprítomnosti chemoterapeutickej látky CDDP. Dodatočná úprava CDDP ďalej výrazne rozšíril tieto apoptotické účinky (obr 6c). Je zaujímavé, že v kombinácii s CDDP epigenetických ošetrenie robustne zvýšila úroveň p53 proteín, ktorý čiastočne, ale nie úplne, odrazené p53
transkripčný aktivita reportérového génu luciferázy (obr 6A a 6B). Tieto nálezy naznačujú, že p53
transkripčný aktivita môže byť aktivovaný epigenetické liečby, ale tiež naznačuje, že apoptóza je len čiastočne indukovaný cez p53
dráha.

Navyše, epigenetické liečba rakoviny žalúdka KATOIII bunkových línií ( p53
null), s 1 uM 5-aza-2'-deoxycytidínu alebo 1 uM 5-aza-2'-deoxycytidínu a navyše trichostatin a robustne indukovanú apoptózu v neprítomnosti CDDP, ale ďalšia liečba CDDP sa ďalej významne rozšíriť apoptotické účinky (obr 6c). CDDP v kombinácii s epigenetických ošetrenie nezvyšuje hladinu proteínu p53, čo sa prejavilo nedostatkom p53
transkripčný aktivita luciferázového reportérového génu (obr 6A a 6B). Tieto nálezy naznačujú, že p53
transkripčný aktivita sa nepožaduje pre apoptózy epigenetické ošetrenie v KATOIII buniek ( p53
buniek null).

Diskusia

súčasná štúdia je prvá správa, ktorá SHM nádoru supresorové gény v p53
dráhy sa nachádzajú výlučne v patologickom fáze II /III rakovinou žalúdka s divokým typom p53
(obr.3). Vybrali sme pStage II /III pacientov s rakovinou žalúdka sa štandardnými spôsobmi liečby analýze p53
dráhy, pretože multidisciplinárny liečby u týchto pacientov majú najlepšie potenciál pre dosiahnutie prognostickú zlepšenie s kompletným liečiteľnosti [24, 25]. Táto úvaha by mala byť hlavnou prioritou pri zvažovaní ďalšieho vývoja nových terapeutických stratégií.

je potrebný takmer úplnej metylácie promótorom DNA CPG ostrovov pre kompletné umlčanie génu, a dokonca aj malé podiely nemethylovaných alel môže robustne indukovať génovú expresiu [ ,,,0],1-5]. V primárnych nádorových tkanivách, SHM musí predstavovať takmer úplnej metylácie v rakovinových bunkách, a SHM v primárnych nádorových tkanivách bol skutočne spojené so znížením expresie proteínu z týchto génov (obrázok 4). Tento výsledok ukazuje, že SHM génov v p53
dráha môže byť funkčne ekvivalentný P53
funkčná aberácie, ku ktorému dochádza v dôsledku p53
mutácie, pretože tieto 3 molekulami funkcie v rovnakom p53
dráhy.

u rakoviny žalúdka, p53
aberácie skupina bola významne spojená s unikátnymi klinicko-fenotypy, ako je Lauren črevnej histológia, mužské pohlavie, old vek, a menej infiltratívny rast (tabuľka 1). Naše súčasné pozorovanie môže byť v súvislosti s predchádzajúcimi správami, ktoré preukázali, že p53
mutácie súvisí s počiatočnom štádiu črevného typu karcinómu žalúdka, alebo s neskorým štádiu rakoviny žalúdka rozptyľovať typ [26, 27], alebo vyšší vek [ ,,,0],28], však naše klinicko-analýza obsahovala hlavne strednej fáze rakoviny žalúdka. Je zaujímavé, že cesta aberácie je jedinečný a udržať aj v recidivujúcich pacientov (tabuľka 2).

Pozitívna prognostický význam p53
mutácie u rakoviny žalúdka je sporný s oboma podporovateľmi [29] a disidentov [30 ] tejto možnosti. Na prvý pohľad by sa zdalo naše dáta pre podporu druhej skupine, avšak je potrebné vziať do úvahy, že naše údaje prežitie je pravdepodobné, že boli modifikované pooperačné adjuvantnej chemoterapie (štandardná terapia v Japonsku). Vzhľadom k tomu, na rozdiel od tejto štúdie, difúzny typ rakoviny žalúdka ukázala horšiu prognózu než črevnej typu rakoviny žalúdka v našich nemocniciach pred desiatkami rokov [15, 31], posledný aktualizované dáta o prežitie podporujú opačné výsledky (tj črevnej typ karcinómu žalúdka vykazuje horšiu prognózu než difúzny typ karcinómu žalúdka), ktorý je údajne vzhľadom k s-1 po operácii adjuvantnej účinky [32]. Pooperačné adjuvans S-1 chemoterapie bolo navrhnuté, že je výrazne účinnejšie pre peritoneálnej ochorení ako diaľkové orgánových metastáz [24], a je pravdepodobné, že bude účinnejšie pre rakovinu žalúdka rozptyľovať typ ako pre črevné typu rakoviny žalúdka [32] , Z týchto dôvodov, najnovšie analýza prežitia ukazuje, že prognóza difúzneho typu rakoviny žalúdka je lepšia ako, že črevná typu rakoviny žalúdka.

Nebol žiadny štatistický rozdiel v miere opakovania alebo v jedinečnej opakovanie miesta medzi p53
aberácie skupina a p53
non-aberácie skupina, však ďalšie recidíva boli nájdené v každom z opakovania stránkach p53
non-aberácie skupina v porovnaní s p53
aberácie skupiny. Tieto zistenia by mohlo naznačovať, že p53
non-aberácie skupina má oveľa agresívnejší fenotyp ako p53
aberácie skupinu ako celok. V našej štúdii difúzny typ rakoviny žalúdka ukázali výrazne lepšiu prognózu ako črevnú typ rakoviny žalúdka v p53
aberácie skupiny. Pretože títo pacienti inklinoval byť distribuované do vyššieho stupňa, tieto údaje naznačujú, že prežitie S1 pooperačnej adjuvantnej chemoterapie je účinnejšie pre rakovinu žalúdka rozptyľovať typ ako pre črevné typ rakoviny žalúdka v prípadoch s p53
dráhy aberácie. Tieto nálezy boli v súlade s predchádzajúcimi správami, že mutant p53 stroje a /alebo imunologické proteínu p53 by mohol byť prediktívne biomarkery na pozitívne účinky neoadjuvantnej chemoterapii s vysokými dávkami v karcinómu žalúdka [30].

nakoniec hodnotená epigenetické účinky liečby v kombinácii s chemoterapiou činidlom za účelom porovnania význam p53
dráhy k epigenetické dráhy v nádorových bunkách žalúdka liečených CDDP. Neočakávane sa ukázalo, že p53
dráha bolo nepravdepodobné, že hrajú veľmi dôležitú úlohu v indukcii apoptózy pomocou CDDP (obrázok 6). Nedávno bolo preukázané, že epigenetické karcinogenézy je skutočne možné. V tomto systéme, systémovej iPS vyvolané preprogramovanie faktory vedie k systémovej výskytu rakoviny s dynamickými epigenetických zmien, zatiaľ čo systémová vrátenie týchto faktorov preprogramovanie sa vráti rakovinových buniek do normálnych buniek [33]. Rakovina žalúdka je pravdepodobné, že prístav menej mutácií génov vodiča [34], ako kolorektálnym karcinómom [35], a podobne, iné ako p53
gén sú zriedkavé u karcinómu prsníka [35], čo naznačuje, že epigenetické karcinogenéze mutácie je možné hlavný etiológie cez chronickej infekcie Helicobacter pylori [36-38]. Nedávno sme preukázali, že sú hyper-metylácii Reprimo
[39], čo je opäť gén v p53
dráha, ktorá ale nemohla byť zahrnutá do tejto štúdie, a HOPX
[16] a CDO1
[40], ktoré sú oba zapojené do apoptózy, ale putatively nie skrze p53
dráhy. Na našich súčasných funkčných experimentov, p53
cesta príspevok k epigenetické účinky liečby bude pravdepodobne oveľa nižšie ako u ostatných dráh (obr.5). Použili sme ďalšie bunkové línie (2 bunkových línií karcinómu žalúdka a 1 hepatocelulárny bunkové línie rakoviny), pre presné určenie príspevku p53
ceste k apoptóze indukovanej CDDP v kombinácii s epigenetické ošetrenie. Dodatočné experimenty vykonávané sú znázornené na obr S3. AZ521 a HepG2 bunkové línie sú p53
divokého typu, a SH10 bunková línia je p53
mutant. p53
aktivita bola detekovaná v p53
buniek divokého typu, ale jeho aktivita bola závislá na každú bunkovú líniu. Tak, p53
aktivita bola detekovaná v bunkách s NUGC4 liečenia CDDP a v AZ521 a HepG2 bunky bez ošetrenia CDDP. Silný apoptóza ako posudzuje apoptózy testom (kaspázy 3 či Puncového nexin) nemusela nutne odrážať stupeň p53
transkripčný aktivácie. V p53
mutant (SH10), alebo p53
bunky null, p53
transkripčný aktivita nebola indukovaná vôbec, bolo však zistené, apoptóza, že je podobná ako v p53
bunkách divokého typu. Preto u karcinómu žalúdka, apoptotických dráh iné ako p53
dráha môže byť relevantné pre indukciu apoptózy ako p53
dráhy.

Na záver p53
aberácie a skupiny pacientov bez aberácií existujú v karcinómu žalúdka, p53
cesty môže byť aberantne v dôsledku epigenetické modifikácie génov v dráh, ako aj v dôsledku genómovej mutácie. p53
aberácie skupina môže vykazujú jedinečné klinické rysy v porovnaní s p53
non-aberácie skupiny. Epigenetické regulácia p53
dráha gény hrajú druhoradú úlohu v indukcii apoptózy pomocou chemoterapeutiká a apoptózu u rakoviny žalúdka, ktorá je vyvolaná epigenetické návratom možno vysvetliť prevažne mechanizmom iným, než je p53
cesta. To znamená, že p53
cesta je nepravdepodobné, že hrať kľúčovú úlohu v apoptóze indukovanej CDDP v kombinácii s epigenetické liečby. Avšak, p53
dráha bolo hlásené, že hrajú dôležitú úlohu v prírodnom žalúdočnej karcinogenéze [41-44]. Tak, náš objav, že p53
dráha gén metylácie bola nájdená iba v karcinómu žalúdka s p53
stavu divokého typu, môže byť dôležité pozorovanie, a také zmeny v nádorovom tkanive môže spôsobiť progresiu nádoru , Práve z týchto dôvodov, že p53
dráha aberácie môžu mať prediktívnu hodnotu chemoterapeutických účinkov u karcinómu žalúdka.

Podporné informácie
S1 Obr. Špecifickosť metylácie PGP9
. 5
NMDAR2B stroje a CCNA1
u karcinómu žalúdka.
(A) hodnoty TaqMeth každého génu v rakovine žalúdka a v zodpovedajúcej normálnej sliznice sú zobrazené. (B) Hodnoty TaqMeth každého génu klasifikovaný podľa p53
stavu génu nádoru sú zobrazené. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD
doi :. 10,1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 Obr.

• Ploche ONE: deregulované Vyjadrenie SRC Lyn a CKB kináz podľa metylácie DNA a jej potenciálnej úlohy rakovina žalúdka invazívnosti a Metastasis
• Ploche ONE: Genetická variabilita v 3-netranslatované oblasti NBN génu je spájaný s rakovinou žalúdka Risk v čínskej populácie