Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: proapoptotický Vplyv HIF-1α inhibícia kombinovaná s glukózou a navyše liečbu inzulínom o rakoviny žalúdka za hypoxických podmienok

abstraktné

Žalúdočné rakovina rastie pod hypoxické prostredia. HIF-1α je známe, že hrajú dôležitú úlohu pri kontrole produkcie reaktívnych foriem kyslíka (ROS) v mitochondriách za hypoxických podmienok. Sme skôr stanovenej HIF-1α Knockdown (kd) bunky a kontrolné (SC) bunky v žalúdočnej rakovina bunkovej línie 58As9. V tejto štúdii sme zistili, že KD bunky, ale nie bunky SC, indukované apoptózy v podmienkach hypoxie (1% O 2) v dôsledku nadmernej produkcie ROS. Kvantitatívna analýza RT-PCR ukázali, že výrazy desať génov, ktoré sú zapojené v kontrolných mechanizmoch ROS (vrátane Warburg efekt, mitophagy, elektrónový dopravnej reťaz [ETC] modifikácie a ROS upratovania), boli upravené HIF-1α. Okrem toho podpora glukózy vychytávanie glukózy a navyše inzulínu (GI) liečby zvyšuje proapoptotický efekt, ktorý bol sprevádzaný ďalšiu produkciu ROS v hypoxických KD bunkách. Western blot analýza ukázala, že membránová expresie GLUT1 v KD buniek bola zvýšená glukóza a /alebo inzulínových liečby, čo naznačuje, že vychytávanie glukózy GI vyvolané je sprostredkovaná zvýšenú translokáciu GLUT1 na bunkovej membráne. A konečne, protinádorový účinok HIF-1α Knockdown (KD) plus GI bola hodnotená za použitia modelu xenoimplantátu nádoru, kde hypoxické prostredia prirodzene existuje. V dôsledku toho, liečba GI silne inhibuje rast nádorov KD čím bola bunková apoptóza veľmi indukovaných v porovnaní s kontrolným ošetrením. Naproti tomu, že rast nádorov exprimujúcich SC HIF-1α nebola ovplyvnená liečbe GI. Celkovo vzaté, výsledky naznačujú, že inhibícia HIF-1α a GI môže byť ideálne terapie, pretože apoptóza v dôsledku zničenia ROS homeostázy je špecificky indukovaná u karcinómu žalúdka, ktorý rastie v hypoxické prostredí, ale nie v normálnej tkanive v rámci cieľa aeróbne podmienky

Citácia :. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) proapoptotický efekt HIF-1α inhibícia kombinácii s glukózou a navyše liečbu inzulínom o rakoviny žalúdka za hypoxických podmienok. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

Editor: Ester Hammond, University of Oxford, VEĽKÁ BRITÁNIA

Prijaté: 30. apríla 2015, Prijaté: 13 augusta 2015; Uverejnené: 04.09.2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

financovania: .. autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

hypoxické prostredie je značný u solídnych nádorov, kde sa urýchľuje ich zhubné správania [1-4]. Rovnako ako iné pevné nádory, karcinóm žalúdka je známe, že zahŕňajú rozsiahle oblasti hypoxie v nádore [5-7]. Hypoxických podmienok, že niekoľko biologických udalostí, ako je angiogenézy, invázie, lokálne šírenie metastáz, rádioterapiou alebo chemorezistence a zmeneným metabolizmom energie v mnohých karcinómoch, čo vedie k zlej prognóze pacientov [2-4].

transkripčný faktor hypoxiou indukovatelný faktor 1 (HIF-1) je hlavným mediátorom bunkovej adaptácia na hypoxii [8-10]. HIF-1 je heterodimerní proteín skladajúci sa z konštitutívne exprimovaný β-podjednotky (HIF-1β) a hypoxiou indukovatelný α (HIF-1α), podjednotka [8-10]. HIF-1α podjednotka je degradovaný prostredníctvom ubiquitin-proteasomu dráhy pod normoxie. Naproti tomu podľa hypoxia, HIF-1α je stabilizovaná a dimeruje s HIF-1β interakciu s CBP /p300, ktorý potom viaže na hypoxii odozvy prvku (HRE) v promotorové oblasti stoviek cieľových génov [11-16]. Tieto predchádzajúce správy viedli k uznaniu HIF-1α ako centrálny regulátor v patogenéze rakoviny pevnej

Reaktívne formy kyslíka (ROS), ako je peroxidový anión (O 2 . - ), peroxid vodíka (H 2O 2), a hydroxylového radikálu (HO •), sa skladá z radikálnej a non-radikálnej foriem kyslíka vytvoreným čiastočnou redukciou kyslíka. Intracelulárne ROS sú generované prevažne v mitochondriách oxidatívny fosforylácie (OXPHOS), čo je proces vykonávaný elektrónovým dopravným reťazou (ETC) [17]. Pri ROS premôcť bunkový antioxidačný obranný systém, dochádza k oxidatívny stres. Nadmerné oxidačný stres spôsobuje, že ROS sprostredkované poškodenie nukleových kyselín, proteínov a lipidov, a vedie k bunkovej smrti [17, 18].

HIF-1α bola označená na riadenie produkcie ROS za hypoxických podmienok pomocou niekoľkých mechanizmov vrátane premeny energetického metabolizmu z OXPHOS do glykolýzy, ktorý je označovaný ako efekt Warburg [19-23], indukciu mitochondriálnej selektívne autofagie (označované ako mitophagy) [24, 25], ETC zmene prepínače podjednotky v cytochrómu c oxidázy (COX), [26] a ROS lapače [27]. V metabolickej dráhe účinku Warburg, HIF-1α najprv aktivuje transkripciu GLUT1
sa zvýšila vychytávanie glukózy v bunkách. Glukóza sa potom metabolizuje na pyruvát akciami glykolytických enzýmov členov, ktoré sú známe ciele pre HIF-1α [28, 29]. Za aeróbnych podmienok, pyruvát je premenená na acetyl-CoA (ACCO) podľa pyruvátdehydrogenázy (PDH) pre vstup do (TCA) cyklus trikarboxylových kyselín. Naopak, v rakovinových bunkách vystavených hypoxii, pyruvát je odsunutý od mitochondrií, čím HIF-1α upreguluje expresiu PDK1 k inhibíciu aktivity PDH. Potom, LDHA prípadne konvertuje pyruvátu na laktát a MCT4 transportuje laktátu von z bunky. Tieto gény sú tiež upravené HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoxia indukuje mitophagy, aby sa zabránilo nadmernej produkcii ROS, ktoré sú poškodené mitochondrie odstránené štiepením lysozomálnej [24, 25]. Nedávne štúdie preukázali, že HIF-1α aktivuje transkripcia génov kódujúcich BNIP3 a BNIP3L, základné faktory v procese mitophagy [32]. Ďalšie štúdie uvádza, že HIF-1α reguluje prepínanie COX4 podjednotku aktiváciou transkripcie génov súvisiacich s ETC COX4-2 a LON, mitochondriálnej proteázy, ktorá je požadovaná pre degradáciu COX4-1 pod hypoxia [26]. Podjednotka prepínač COX4 bola označená ako dôležitý krok v ROS homeostázy, kvôli jeho úlohe v optimalizáciu účinnosti dýchaní pod hypoxia [26]. Kolektor MnSOD ROS je známy spôsob pre prevedenie superoxidové radikálov na peroxid vodíka. Predchádzajúce štúdie uvádzajú, že MnSOD je up-regulovaná v hypoxia, hoci či je táto up-regulácia sprostredkovaná HIF-1α doteraz nebolo preukázané, [27]. V poslednej dobe sa ďalšia správa ukázala zaujímavé zistenie, že embryonálne fibroblasty (MEF) hypoxické HIF-1α-null myší zomrela v dôsledku nadmernej produkcie ROS, zatiaľ čo MEF boli zachránení pôsobením antioxidantu N acetyl-L-cysteín (NAC) [ ,,,0],33]. Dohromady tieto správy naznačujú, že HIF-1α zohráva ústrednú úlohu pri organizovaní mitochondriálnej produkciu ROS v živých bunkách v hypoxiou.

V tejto štúdii sme za cieľ vytvoriť terapeutický model, ktorý dokladá, že hypoxiou indukovanú apoptózu prostredníctvom nadprodukcia ROS môžu byť zavedené do deficitom rakovinových buniek HIF-1α žalúdka. Pôvodne sme určiť, či hypoxia indukuje bunkovú smrť nadmernou produkciou ROS v HIF-1α Knockdown (KD) buniek. Potom, sme sa obrátili na hypotézu, že zavedenie vysokých hladín glukózy pri liečbe KD buniek inzulínu sa môže zvýšiť proapoptotický účinok. A napokon, za použitia modelu nádoru xenotransplantátov, navrhli sme, že inhibícia HIF-1α v kombinácii s glukózy a inzulínu (GI) liečby môže byť potenciálny terapiou pre rakovinu žalúdka.

materiáloch a metódach

Bunková kultúra podmienky a činidlá

bunková línia rakoviny žalúdka 58As9 láskavo poskytol Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital východe, Chiba, Japonsko) o decembra 2009. bunkovej linke 58As9 bol pôvodne založený od scirrhous karcinómu žalúdka, bunková línia odvodená od HSC-58 [34]. Táto bunková línia bola potom ďalej overená 24. február TH 2015 podľa JCRB Cell Bank (Osaka, Japonsko). Ďalšie karcinómu žalúdka bunkové línie, MKN74 bol zakúpený od Cell Bank, Riken Bio Resource Center (Tsukuba, Japonsko). V tejto štúdii sme použili stabilných HIF-1α porazený bunky KD a 74 kD, ktoré boli stanovené podľa transfekciu siRNA plazmidu nesúceho sekvencie RNAi do buniek 58As9 a MKN74, ako bolo opísané skôr [7, 35]. Sekvencia siRNA cielia HIF-1α a kontrolu miešaná siRNA boli navrhnuté nasledujúce: HIF-1α siRNA pre KD alebo 74 kD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 '), a zhon siRNA pre SC alebo 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Bunky boli kultivované v médiu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA), doplnenom 10% tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 100 ug /ml kanamycínu (Meiji, Tokyo, Japonsko ) a inkubované pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére. Bunky boli kultivované buď za normoxických podmienok (20% O 2 a 5% CO 2 vo vzduchu) alebo hypoxických podmienok (1% O 2, 5% CO 2 a 94% N 2) v hypoxické komory (ASTEC, Fukuoka, Japonsko), a potom sa spracuje s NAC (Sigma-Aldrich) a inzulínu (Wako, Osaka, Japonsko) v konečnej koncentrácii 5 mM a 500 ng /ml, v danom poradí. Koncentrácia v médiu s vysokým obsahom glukózy bola pripravená pridaním 45% D - (+) - roztok glukózy (Sigma-Aldrich) a konečná koncentrácia bola stanovená na 10 g /l, čo je 5 krát vyššia ako v normálnej RPMI-1640 médiu.

životaschopnosť buniek test

životaschopnosť buniek v normoxie alebo hypoxia bola hodnotená farbením trypánovej modrej testy vylúčenia. Pre vyhodnotenie vplyvov liečbu drogovej závislosti, vrátane NAC, vysokým obsahom glukózy a /alebo inzulínu na bunkovej životaschopnosti, 1 × 10 5 Bunky boli vrúbľovať do 6 cm kultivačnej misky. Bunky boli ošetrené rôznymi liekmi v uvedených koncentráciách a kultivované za normoxie alebo hypoxia, po dobu 24 hodín až 96 hodín. Na konci inkubácie, plávajúce a adherentní bunky boli zhromaždené a peletovanie centrifugáciou (3000 otáčok za minútu, 5 min). Bunky boli resuspendované v 90 ul kompletného média, zmieša s 10 ul 0,4% roztoku trypánovej modrej a počítané použitím hemocytometru pod mikroskopom. Miera bunková smrť bola stanovená ako pomer počtu mŕtvych buniek /celkový počet buniek. Všetky experimenty boli vykonávané v triplikátech a nezávisle opakované najmenej trikrát.

Western blot analýza

lyzáty celých buniek z kultivovaných buniek a xenografe nádorov u myší boli pripravené s použitím lyzačného pufra zloženého z 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, a inhibítor proteázy koktail mix (Roche, Mannheim, Nemecko). Fragmenty buniek z cytozolové frakcie a frakcie bunkovej membrány boli pripravené za použitia cytochróm c Uvoľnenie Apoptóza Assay Kit a plazmatické membrány Protein Extraction Kit (Biovision Inc., Milpitas, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Blot analýza bola vykonaná Western ako bolo opísané skôr [7]. Alikvótne obsahujúce 30 ug proteínu, boli elektroforeticky rozdelené do 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) a prenesené na Amersham Hybond o-ECL membrány (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) v prenosovom pufri. Po blokovaní 5% kože mlieko po dobu 30 minút bola membrána inkubovaná s primárnymi protilátkami cez noc pri teplote 4 ° C. Boli použité nasledujúce primárne protilátky: anti-HIF-1α (riedenie 1: 1000, abca, Cambridge, UK), anti-štiepi kaspázy 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-cytochróm c (1 : 500 riedenie, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100,000 riedenie, abca), a anti-β-aktínu (1: 10,000 zriedenie, Sigma-Aldrich, Inc.). Po inkubácii s príslušnými sekundárnymi protilátkami, signály boli vyvinuté s použitím Plus westernovým prenosom Detection System Amersham ECL (GE Healthcare).

Detekcia intracelulárneho ROS pomocou prietokovej cytometrie

hodnotách Intracelulárne ROS boli hodnotené za použitia celkom ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) podľa inštrukcií výrobcu. V krátkosti, KD, SC, boli bunky kultivované za podmienok buď normoxie alebo hypoxia, s alebo bez liekov (to znamená, NAC, vysokým obsahom glukózy a /alebo inzulín) po dobu 24 h, 48 h a 72 h. 74-KD a 74-SC boli kultivované za podmienok buď normoxie alebo hypoxia, 24, 48, a 72 hodín bez liečby drogovej závislosti. Bunky boli premyté a resuspendované v roztoku detekcie ROS. ROS fluorescencie bola detekovaná toku FACS Calibur cytometri (Becton-Dickinson, San Jose, CA) a analyzované programom Cell Quest softvéru. Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Priemerná fluorescencie produkcia ROS sa stanoví automaticky a je prezentovaný ako GEO znamenajú.

Celková extrakcie RNA a kvantitatívnej RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná z bunkových línií za použitia súpravy na extrakciu RNA Isogen ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Jeden ug RNA sa prevedie na cDNA s použitím ReverTra eso (Toyobo) reakcia reverznej transkripcie kit. CDNA bola použitá ako templát pre PCR. Real-time kvantitatívne RT-PCR (RT-qPCR) bola vykonaná pomocou systému Light Cycler prístroje (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko) za použitia Light-Cycler-FastStart DNA Hlavné SYBR Green I kit (Roche). Desať gény, ktoré boli analyzované pomocou RT-qPCR boli nasledovné: glukóza transportéra 1 ( GLUT1
), aldolázy C ( ALDOC
), pyruvát dehydrogenázy kinázy 1 ( PDK1
), laktátdehydrogenázy a ( LDHA
) a monokarboxylátovou transportéra 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adenovírus EIB 19-kDa interagujúce proteín 3 ( BNIP3
), BINP3 ako ( BNIP3L
), mitochondriálnej mangán superoxiddismutáza ( MnSOD
), mitochondriálnej proteáza LON stroje a cytochromoxidáza podjednotku 4-2 ( Cox4 - 2
). Primery boli navrhnuté podľa nahlásených cDNA sekvencií (GenBank, Bethesda, MD) (tabuľka 1). Po kroku denaturácie pri teplote 95 ° C počas 3 min, PCR amplifikácia bola vykonaná s 50 cyklov 15 s denaturácie pri 95 ° C, 5 s žíhanie pri teplote 60 ° C a 10 s predĺžením pri 72 ° C. Kvantitatívne hodnoty boli normalizované na beta-aktínu ( ACTB
) expresie (tabuľka 1). Všetky experimenty boli vykonávané v triplikátech a nezávisle opakované najmenej trikrát.

vychytávania glukózy test

Príjem glukózy v kultivovaných bunkách bola stanovená za použitia 2-deoxyglukosy (2DG) vychytávanie Meranie Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japonsko). V stručnosti, bunky boli kultivované za podmienok, po dobu 6 hodín v sére vyhladované, po ktorom nasleduje ďalšia kultivácii počas 18 hodín v pravidelnom médiu doplnenom 10% FBS. Bunky boli inkubované po dobu 24 hodín pod normoxie alebo hypoxie. Potom boli bunky ošetrené s alebo bez 500 ng /ml inzulínu po dobu 18 min. Nakoniec boli bunky ošetrené 2DG po dobu 20 minút a podrobené meranie príjmu 2DG v súlade s pokynmi výrobcu. Všetky experimenty boli vykonávané trojmo a priemerné hodnoty boli vypočítané.

Štúdie na zvieratách

Protokoly na zvieratách boli schválené starostlivosť a používanie komisiou Institutional Animal Saga University (protokol 24-008-0 ) a zodpovedalo na príjazd pokyny pre použitie zvierat vo výskume. Samice 4 týždňov starých athymických myší Balb /ca JCL (nu /nu) boli získané od firmy Nihon Crea Co. (Osaka, Japonsko). Zvieratá boli držané v rámci špecifického bez patogénov podmienok. Boli uvedené sterilné jedlo a v autokláve vodu s cyklom svetlo-tma 12 h. Myši boli aklimatizované k životnému prostrediu počas 7 dní pred pokusom. KD alebo SC bunky (3 x 10 6) boli injikované subkutánne do chrbta myší (n = 9 pre každú bunkovú líniu). Desať dní po subkutánnej inokulácii xenoimplantáty oboch buniek stali hmatateľné. Deväť myší nesúcich KD alebo SC xenoimplantáty potom boli rozdelené do troch skupín pre liečbu glukózou (8 g /kg /deň, Sigma), glukózy a inzulínu (GI) (1 jednotka na 3 g glukózy /deň, Wako) alebo fosfátom pufrovanom fyziologický roztok (PBS) ako kontrolný liečbu. Každý z týchto liekov boli intraperitoneálne podané do troch myší (šesť nádory celkom) každých 24 h od dňa 1 do dňa 11. Počas tejto doby boli nádory merané v 2 kolmých rozmerov s posuvným meradlom každé štyri dni. Veľkosť nádoru ( T
) bola hodnotená ako maximálna strižné plochy a stanoví podľa nasledujúceho vzorca: T
= π /4 x a
x b
, kde a
je kratšia os (mm) a b
je dlhšia os (mm). Myši boli usmrtené 12 dní po ošetrení s drogami a nádormi boli zozbierané pre ďalšie experiment.

štiepenie kaspázy 3 imunohistochémia a posúdenie apoptózy in vivo

mrazené nádory boli osadené Tissue-Tek OCT Zlúčeniny. Tieto bloky boli narezané na 4-um silné oddiely. Pre získanie antigénu, bola sklíčka zahrieva v Tris-EDTA pufra (pH 9,0) v mikrovlnnej (500 watt) po dobu 5 minút. Rezy boli potom inkubované s anti-štiepený kaspázy 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti, a DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) bola použitá ako sekundárna protilátka. Signály boli vizualizované s Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (0,02%). Pre hodnotenie apoptózy, štiepi kaspázy 3-pozitívnej bunky s jadrami hnedého boli počítané v piatich polí na 400x zväčšenie a stredná hodnota bola vypočítaná. Imunohistochemické expresia rozštiepeného kaspázy 3 bola slepo preskúmaná a posúdená autorizovaným patológom (Dr. AN).

Štatistická analýza

Dáta boli analyzované pomocou rozptylu pomocou softvérového balíčka Prism 5 ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Pre porovnanie medzi dvoma skupinami, rozdiely v priemerných hodnôt boli vyhodnotené študentovým t-
testu a Mann-Whitney U
testu. Pre porovnanie medzi tromi alebo viacerými skupinami, Bonferroniho post hoc testy boli vykonané na jednosmernej ANOVA. Hodnota p menšie ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM.

Výsledky

HIF-1α knockdown indukovanú proapoptotický bunkovú smrť pod hypoxie v 58As9 buniek karcinómu žalúdka

Výraz HIF-1α bola hodnotená v stabilnej HIF-1α knockdown (KD) buniek a SC (ako kontrolná bunkové línie) buniek. Western blot analýza ukázala, že HIF-1α expresie bola úplne zrazený v bunkách KD po 8 hodín pod hypoxii v porovnaní s bunkami SC (obr 1A). Miera bunková smrť bola odhadnutá po 24 h do 96 h za normoxie a hypoxia. Úmrtnosť bola v bunkách KD vyššia ako v SC bunky v normoxie po dobu 24 až 96 hodín, ale rozdiely neboli štatisticky významné (obr 1B). Na rozdiel od toho je miera bunkovú smrť v bunkách KD bola výrazne zvýšená v hypoxie a výrazne vyššia, než bolo pozorované v supravodivých bunkách po 72 a 96 hodinách (obr 1C). Blot analýza Western preukázala, že štiepi kaspázy 3, ako aj cytozolové cytochróm c boli zvýšené v bunkách KD, ale nie v SC bunky v hypoxii počas 8 hodín (obr 1D a 1E). Smrť hypoxia indukovaná bunková bola potvrdená aj v ďalších porazený rakovinových bunkách HIF-1α žalúdočné 74-KD (S1 Obr). Tieto výsledky ukazujú, že hypoxia silne indukovanú apoptózu v HIF-1α smiešne nízke bunkové línie KD.

upratovania ROS obrátil proapoptotický fenotyp pozorovaný v HIF-1α Knockdown buniek

Intracelulárne hladiny ROS bol odhadovaný a nákupný medzi bunkami KD a SC. Hladina ROS zvyšuje v závislosti na čase v bunkách KD pod hypoxii, zatiaľ čo hladina bola slabo zvýšená u supravodivých bunkách (obr 2A). Hladina ROS v bunkách KD bola významne vyššia v hypoxii po dobu 24 až 72 hodín, než je tomu vo supravodivých bunkách (obr 2A). Hladiny ROS bola tiež hodnotená v 74-SC buniek a 74-KD buniek (S2) Obr EÚ. Hladiny ROS nelíšila medzi 74-SC a 74-KD bunkách pod normoxie (S2A Obr). Avšak podľa hypoxia hladiny ROS boli v 74-KD buniek významne vyššia ako v 74-SC buniek na 48 až 72 hodín (obr S2B). NAC, antioxidant, významne znížila hladinu ROS v bunkách KD pod hypoxia po dobu 48 až 72 hodín (obrázok 2B). Aby bolo možné posúdiť, či produkcia ROS vyvoláva hypoxiou indukovanú bunkovú smrť v KD bunkách, miera bunková smrť s alebo bez NAC bola hodnotená v KD bunkách za normoxie a hypoxiou. Liečba NAC neovplyvnila rýchlosť bunkovej smrti v bunkách KD podľa normoxie (obrázok 2C). Na rozdiel od toho liečba NAC významne znižuje bunkovú smrť v bunkách pod KD hypoxia po dobu 48 až 96 hodín (obrázok 2D).

HIF-1α knockdown znížila hypoxické indukciu rôznych génov zapojených do kontroly výroby ROS

Ak chcete skúmať hypoxiou indukovanú akumuláciu ROS v HIF-1α porazený bunky, mRNA expresie desiatich génov, ktoré sa podieľajú na ROS kontrolným mechanizmom ( GLUT1
ALDOC
PDK1
LDHA
MCT4
BNIP3
BNIP3L
LON
, COX4-2 stroje a MnSOD
) boli analyzované pomocou RT-qPCR experimentu. Hypoxické indukcia génovej expresie bola hodnotená indukcia násobné (FI). FIS v desiatich génoch boli v bunkách KD výrazne nižšie ako v supravodivých bunkách (obrázok 3). Okrem toho, keď obmedzené na hypoxických podmienok, že hladiny expresie všetkých desiatich génov boli v KD buniek než buniek SC výrazne nižšia. Tieto výsledky ukázali, že HIF-1α knockdown výrazne znížil expresiu hypoxiou indukovanú z desiatich génov. Na druhej strane, na základe normoxie, expresie PDK1 a BNIP3L bol v bunkách KD výrazne nižšie ako v bunkách SC. Naopak, hladiny expresie LON a COX4-2 boli významne vyššia v bunkách KD v porovnaní s SC buniek.

glukózy a inzulínu ošetrenie rozšírené proapoptotický bunkovú smrť v bunkách pod KD hypoxia

vedľa sme skúmali, či je podpora príjmu glukózy ovplyvňuje apoptózu hypoxiou indukovanej KD bunkách. Životaschopnosť buniek bola hodnotená v bunkách KD a SC nasledujúcich ošetrenie s kontrolou (PBS), vysokým obsahom glukózy, inzulínu alebo vysokým obsahom glukózy a inzulínu (GI). Hypoxiou indukovanú bunkovú smrť bola odhadnutá podľa FI. Miera bunkovej smrti na základe hypoxie bola porovnaná medzi kontrolným ošetrením a ďalšími spôsobmi liečby v oboch bunkových líniách (obrázok 4). V SC bunkách, žiadne významné rozdiely v FI a bunkovej úmrtnosti pod hypoxia boli pozorované u akýmkoľvek spôsobom (obr 4A). V KD bunkách, FI bola významne zvýšená hypoxiou vo všetkých skupinách. Najmä liečba GI získa najvyššiu FI medzi všetky procedúry (obr 4B). Miera bunkovej smrti na základe hypoxie bola v bunkách ošetrených GI výrazne vyššia ako v bunkách liečených kontrolou (obr 4B). Pre zistenie, či liečba vplyv na produkciu ROS, hladina ROS bol analyzovaný v bunkách KD. V porovnaní s normoxických podmienok je hladina ROS bola významne zvýšená v bunkách KD za hypoxických podmienok (obr 4C). Pod hypoxia, hladina ROS v bunkách KD bola významne zvýšená vysokým obsahom glukózy, inzulínu a liečbe GI v porovnaní s kontrolnou skupinou. Najvyššia hladina ROS sa pozitívne pozorované v GI ošetrených KD buniek (obr 4C).

Vyhodnotenie príjmu glukózy po liečení inzulínovej

Príjem glukózy schopnosť bola analyzovaná v štúdii zabudovanie 2DG , V bunkách SC a KD pod normoxie, začlenenie 2DG bola významne vyššia v liečbe 2DG v porovnaní s neošetrenými bunkami. 2DG Začlenenie bola ďalej zvýšená o dodatočnú liečbu inzulínom v oboch bunkách (obr 5A). V porovnaní s normoxie, hypoxia silnejšie stimulovali vychytávania 2DG v supravodivých bunkách, s alebo bez inzulínu (obr 5B). Podobné výsledky boli pozorované v bunkách KD v hypoxia (obrázok 5B). Avšak podľa hypoxia, menej 2DG bol začlenený do buniek KD, než v supravodivých bunkách, s alebo bez dodatočného spracovania inzulínu (obr 5B). Posúdiť mechanizmus vychytávania glukózy na inzulínu, membranózna expresie GLUT1 bola analyzovaná v bunkách KD pod normoxie a hypoxia. Pod normoxie, membranózna GLUT1 expresia bola zvýšená s vysokým obsahom glukózy a /alebo liečbu inzulínom v porovnaní sa, že bez liečby (obr 5C). V porovnaní s pozorovanou v normoxie pod hypoxia, membranózna GLUT1 expresia bola zvýšená vo všetkých skupinách. Okrem toho, expresia bola zvýšená o vysokým obsahom glukózy a /alebo liečbu inzulínom, v porovnaní s tým, že bez liečby (obr 5C). Najmä membranózna GLUT1 výraz bol najviac silne zvýšená o vysokým obsahom glukózy a inzulínu (GI) ošetrenie v hypoxické KD buniek (obr 5c). Na druhej strane, expresia iné rodiny GLUT, GLUT3, bol slabo pozorovaný v bunkách KD, a toto zistenie nebola zmenená medzi týmito rôznymi procedúrami (dáta nie sú uvedené). V tejto štúdii, GLUT2 a GLUT-4 neboli vyjadrené v KD bunkách.

HIF-1α knockdown a ošetrenie GI silne potlačený rast tumorov prenesených u nahých myší

Nakoniec sme stanovili in vivo
účinok liečby GI na KD a SC štepov tumorov z cudzej. Obr 6A ukazuje experimentálny dizajn xenoimplantátu myšiam modelu. Desať dní po subkutánnej inokulácii SC alebo KD buniek, xenoimplantáty boli pestované na chrbte nahých myší. V tomto okamihu, je analýza Western blot potvrdila HIF-1α expresiu v nádoroch SC, ale nie v nádoroch kD (obr 6B). Potom, tri lieky, pozostávajúce z PBS, glukózy alebo GI, boli intraperitoneálne injikované do nahých myší nesúcich SC alebo KD nádor (denne od dňa 1 do dňa 11). Reprezentatívne obrazy myší s tumorom, ktorí boli liečení s PBS (SC-PBS a KD-PBS), glukózu (SC-glukózy a KD-glukóza), alebo GI (SC-GI a KD-GI) sú uvedené na obr 6C , KD-glukózy a KD-GI nádory sa zdala byť menšie ako ostatné nádory. Obr 6D ukázali rastovú krivku 6 nádorov. Veľkosti KD-glukózy a KD-GI nádorov boli výrazne menšie ako nádoru KD-PBS v deň 12. KD-gastrointestinálneho nádoru bol najmenší. Na druhej strane, u myší, SC, nebol zistený žiadny významný rozdiel vo veľkosti SC-PBS, SC-glukózy a SC-GI nádorov (obr 6d). Imunohistochemické analýza štiepené kaspasy 3 sa vykoná na zhodnotenie apoptózu vyvolanú glukózou alebo liečbe GI. Pozitívne expresia rozštiepeného caspase3 bol často pozorovaný v KD-glukózy a KD-GI nádorov (obr 6e). Avšak, všetky KD nádory vykazovali určitý stupeň štiepené kaspasy 3 (obr 6F). Na rozdiel od toho nebol zistený žiadny významný rozdiel v expresii štiepené kaspasy 3 medzi SC-PBS, SC-glukózy a SC-GI nádorov. V nádoroch KD, pozitívna expresia rozštiepené caspase3 bola v nádore KD-PBS významne vyššia ako v nádore SC-PBS. Okrem toho, expresia rozštiepené caspase3 bola významne vyššia v nádoroch KD-glukóza alebo KD-GI ako v nádore KD-PBS. Najvyššia expresia bola pozorovaná v nádore KD-GI.

Diskusia

V tejto štúdii, HIF-1α porazený bunky boli použité na zistiť, či smrteľnú produkcia ROS môžu byť indukované za hypoxie. Výsledky ukázali, že smrť apoptotických buniek bola indukovaná u KD bunkách, ale nie v kontrolnej SC bunky v hypoxiou. Súčasne, ROS akumuluje v smiešne nízke bunkovej línii podľa doby trvania hypoxie. smrť indukovaná bunková Hypoxia- a akumulácia ROS boli tiež pozorované v rôznych HIF-1α porazený 74-KD buniek, ale nie v kontrolných bunkách 74-SC. Okrem toho, liečba NAC znížila rýchlosť bunkovej smrti hypoxiou indukovanú v bunkách KD. Tieto výsledky naznačujú výskyt hypoxiou indukovanej apoptózy v dôsledku nadmerné hromadenie ROS v KD bunkách a podporil predchádzajúcej štúdii, ktorá HIF-1α knockout MEF zomrel v dôsledku nadmernej produkcie ROS [33].

ROS sú generované hlavne v mitochondrie, ktoré ETC [17, 19]. Bolo oznámené, že mitochondriálnej ROS sa zvyšuje za hypoxických podmienok [17, 19]. V prípade, hypoxia pretrváva, indukcia HIF-1α vedie k adaptívnymi mechanizmy pre zníženie ROS a obnoviť redox homeostázu prostredníctvom up-reguláciu príslušných génov [19]. Preto sme skúmali, či HIF-1α knockdown vplyv na expresiu mRNA desiatich génov podieľajúcich sa na regulácii produkcie ROS v hypoxia ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA stroje a MCT4
týkajúce sa ovplyvnenia Warburg; BNIP3 stroje a BNIP3L
vzťahujúce sa k mitophagy; LON stroje a COX4-2
týkajúce sa ETC a MnSOD
, príjemná ROS vychytávacie). Integrované analýzy radu RT-qPCR preukázali, že hypoxia indukovaná expresie všetkých desiatich génov bola významne potlačená v KD bunky, zatiaľ čo pod normoxie, expresie mRNA LON a COX4-2 bol významne vyšší v bunkách než KD v SC bunkách. Tieto výsledky ukazujú, že letálna akumulácia ROS pod hypoxie v HIF-1α porazený buniek môže byť z dôvodu opakovaného narušenia kontrolného mechanizmu ROS. Z tohto dôvodu, rakovina terapie zacielenie HIF-1α môže byť účinné v hypoxické regióne v žalúdočnej tkanive rakoviny. Tento mechanizmus je základom stimulovaná expresie mRNA LON a COX4-2 v bunkách KD pod normoxie nemohol byť vyjasnená.

V súlade s uvedeným zisteniam, my sme predpokladali, že podpora príjmu glukózy môže urýchliť hypoxiou indukovanú apoptóza cez ďalšie produkciu ROS v HIF-1α knockdown KD buniek. Ako sa dalo očakávať, liečba GI zvyšuje smrť buniek v hypoxických KD buniek, ktoré bolo sprevádzané zvýšenú produkciu ROS. V rozšírení štúdii glukózy, inzulínu zvýšené vychytávanie 2DG ako v SC a KD buniek. V porovnaní s pozorovanou v normoxie, hypoxia zvýšila vychytávania 2DG v bunkách SC a KD ošetrených s alebo bez inzulínu. Príjem bola zvýšená silnejšie v SC než KD buniek, čo ukazuje rozdiel v dôsledku oslabeného GLUT1 indukcie v hypoxické KD buniek. Na druhej strane, Western blot analýza ukázala, že na membráne GLUT1 expresie bola zvýšená s vysokým obsahom glukózy a /alebo inzulínových ošetrenie, v porovnaní s kontrolným ošetrením v normoxických a hypoxických buniek KD. Najmä ošetrenie GI najsilnejšie zvýšil membranózna GLUT1 expresiu v hypoxických KD bunkách. Predchádzajúce štúdie uvádza, že inzulín podporuje transport glukózy stimuláciou translokáciu GLUT-4 z intracelulárnych vesicles uskladnenia do plazmatické membrány buniek kostrového svalstva alebo adipocytov [36, 37].

Other Languages