Ploche ONE: multirezis odolnosti s dlhým nekódujúca RNA Analysis Expression Profil rakoviny žalúdka

abstraktné

Vplyv chemoterapiu rakoviny žalúdka (GC) aj naďalej veľmi nízka kvôli mnohopočetné liekovej rezistencie (MDR). Avšak, mechanizmy MDR GC nie je zďaleka plne pochopený. Cieľom tejto štúdie je ilustrovať možné mechanizmy MDR GC na hlavne na úrovni dlhé nekódujúca RNA (lncRNA). V tejto štúdii, GC bunkové línie, SGC7901, a dva MDR sublinie, SGC7901 /VCR a SGC7901 /ADR boli podrobené analýze lncRNA microarray. Bioinformatiky a kontrolné pokusy boli vykonané za účelom zistenia potenciálnych lncRNAs zapojené do vývoja MDR. Analýza ukázala, že cesta 15 cesty zodpovedal down-regulované transkriptov a 20 dráhy zodpovedá up-regulované transkriptov (p-hodnota cut-off je 0,05). GO analýza ukázala, že najvyššie obohatené VO cielené až regulovaných transkriptov boli "vývoj systému" a najvyššie esenriched VO ktoré sa zameriavajú na down-regulované prepisy boli "biosyntetický postup sterolov". Naša štúdia je prvou, ktorá dopytovania rozdielne exprimovaných lncRNAs v ľudskej bunkovej línii GC a MDR sublinie, a ukazuje, že lncRNAs sú užitočné pre ďalšie štúdie, že sú nové kandidátnej biomarkery pre klinickú diagnózou MDR a potenciálnych cieľov pre ďalšiu liečbu.

Citácia: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) multirezis odolnosti s dlhým nekódujúca RNA analýza Expression profil rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461

Strih: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Spojené štáty

prijatá: 24. decembra 2014; Prijaté: 22.júla 2015; Uverejnené: 20.srpna 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Všetky surové dátové a štandardizované údaje boli uvedené v http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Financovanie :. Táto práca bola podporená národnými program na kľúč projekt základného výskumu ( "973" program, č 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); Národná prírodná Science Foundation of China (č 81301763); Henan zemskej kľúčových vedeckých a technických projektov (č 142102310473); Program Key, Národná prírodná Science Foundation of China (No. 81030044)

Konflikt záujmov: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

multidrug odporu ( MDR) zostáva hlavnou prekážkou pre zlyhanie chemoterapie pri liečbe rakoviny žalúdka, čo je hlavnou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete. Viac multidrug proteíny spojené s rezistenciou (MRPs) [1] alebo miRNA [2], ktoré sprostredkovávajú MDR prostredníctvom rôznych mechanizmov, ktoré boli predtým uvedené. Avšak, mechanizmy MDR GC nie je zďaleka celkom jasné.

genómu sekvenovania ukázali, že eukaryotické genómy kódujú prekvapivo veľký počet nekódovacích transkriptov v porovnaní s prokaryotních genómov. Medzi týmito nekódovacích transkriptov, mnohé z nich sú dlhé nekódujúca RNA (lncRNAs), ktoré hrajú dôležitú úlohu v regulácii transkripcie alebo translácie mRNA na transkripčný a post-transkripčný úrovni. lncRNAs sú RNA, ktoré nemajú kódovacie potenciál, ktoré sú > 200 bp a účet aspoň 80% prepisov celého genómu [3]. Akumulujúce údaje ukazujú, že lncRNA hrá dôležitú úlohu v regulácii mRNA [4], organela biogeneze [5], je subcelulárnu obchodovanie molekúl [6], a vývoj buniek [7] [8].

LncRNA dysregulácia bol zapojený do niekoľkých typov ochorení, vrátane rakoviny ^{[ 4 , 9 , 10 ]. A to, lncRNAs môže hrať dôležitú úlohu v karcinogenézy, metastázy a invazívnosti viac malígnych nádorov prostredníctvom ovplyvnenia Expresia onkogénu. Napríklad, COX-2-lncRNA, STIMULÁTOR, môže pôsobiť ako nový potenciálny cieľ pre COX-2-moduláciu zápalu a rakoviny [11]; RNAi sprostredkovanú knock-down z LINC01081 v normálnych plodov pľúcnych fibroblastov ukázala, že tento lncRNA pozitívne reguluje hladinu FOXF1 transkriptov, čo ďalej naznačuje, že pokles LINC01081 výrazu môže prispieť k rozvoju alveolárna kapiláry dysplázia s odchýlkou ​​pľúcnych žíl [12]; lncRNA hotair môže byť tiež cenným prediktor pre liečbu rakoviny hrubého čreva [13] a MALAT1 by mohla byť považovaná za potenciálny prognostický indikátor a môžu byť cieľom pre diagnostiku a génovej terapie pre pankreatického vývodu adenokarcinómu [14]; zvýšená expresia lncRNA H19 zvyšuje karcinogenéze a metastáz rakoviny žalúdka a účinok H19 v GC je sprostredkovaný priamou upregulací ISM1 a nepriame potlačenie CALN1 expresie pomocou MIR-675 [15]. Preto, aby sa predbežne vhľad molekulárnych mechanizmov MDR GC sme študovali lncRNA expresného profilu GC MDR sublinií.}

Tu sme študovali rozdielne profilov expresie lncRNAs a mRNA medzi GC cellline SGC7901 a MDR sublinie SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR pomocou analýzy lncRNA mikročip. Porovnanie odlišne exprimovaných transkriptov medzi sublinií a rodičovskej cellline ukázala, 15 dráhy, ktoré zodpovedali transkriptov down-regulované a 20 dráh, ktoré zodpovedali up-regulovaných transkriptov (p hodnota cut-off bol 0,05). Gene ontológia (GO), analýza ukázala, že väčšina vysoko obohatené GO pojmov pre up-regulované prepisy boli "vývoj systému", "nucleosome" a "väzba" a najviac vysoko obohatené GO pojmov pre down-regulované prepisy boli "sterolov biosyntetický postup "," bunka periférie ", a" steroid dehydrogenázy ". Naše výsledky ukázali, že lncRNA a mRNA profily expresie sa významne líšia medzi MDR sublinií a rodičovskej Celline. Toto zistenie naznačuje, že aberantne expresné hladiny lncRNAs by mohli prispieť k rozvoju MDR GC. Ďalšie štúdie o rozdieloch vo lncRNA profily expresie môže poskytnúť nové potenciálne spôsoby pre cúvanie MDR fenotyp GC.

Výsledky

rozdielne exprimovaných lncRNAs

mikročipu údaje highthroghput lncRNA vykazovali celkom 27,883 lncRNAs vyjadrených v žalúdku rakoviny cellline, SGC7901 a dva multidrug rezistencie sublinie, SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR (S1 tabuľka). Odvodiť vzťahy medzi vzorkami, hierarchickej zhlukovaniu analýza bola použitá usporiadať celllines do skupín podľa ich expresných úrovniach, čo predstavuje vzťahy výrazu režimov lncRNA medzi celllines (obr 1A a 1B). Ďalšie štúdium týchto údajov vykazovali v priemere 1637 rozdielne exprimované lncRNA. Medzi nimi, 638 boli konzistentne up-regulované a 999 boli dôsledne down-regulované (rozkladací change≥2.0) (S2 tabuľka). ASHG19A3A028863 (rozkladací zmenu: 146.0139) bol najviac up-regulovaná lncRNA a ASHG19A3A007184 (rozkladacie zmeny: 58,7105) bol najviac down-regulované lncRNA. Okrem toho, down-regulované lncRNAs boli častejšie ako up-regulované lncRNAs v našich microarray dát (S2 tabuľka).

odlišne exprimované mRNA

Tam bolo 19,644 mRNA identifikovanej v sublinií GC MDR analyzovaných mRNA expresia profilovanie dát pomocou microarray analýzy a hierarchická analýzu zhlukovaniu prezentované vzťahy medzi expresie mRNA druhov, ktoré boli prítomné v sublinií GC MDR a rodičovskej Celline (obr 2A a 2B) (S3 tabuľka). Medzi rozdielne vyjadrené mRNA medzi SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR a SGC7901, 730 bolo dôsledne up-regulovaná a 650 bolo dôsledne down-regulované v SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR celllines v porovnaní s SGC7901 (obr 2B). (S4 tabuľka). NM_000735 (gen symbol: CGA, sklopné zmena: 106,19) bol najviac up-regulovaná mRNA a NM_001136574 (gen symbol: LANCL1, rozkladacie zmenu: 25,43) bol najviac down-regulované mRNA (obr 2b)

GO analýza

Ak chcete zistiť gén a atribúty génového produktu v biologických procesoch, bunkových komponentov a molekulárnych funkcií, Gene Ontology (GO) bola vykonaná analýza takto. Fisherov presný test sa vykonáva test, ak existuje viac prekrývajú v zozname DE a zoznamu anotácie GO, než by sa dalo očakávať náhodou. P-hodnota označuje význam GO termínov obohacovanie v génoch DE. Čím nižšia je hodnota p, tým významnejšie GO Term (p-hodnota < = 0,05 je odporúčané). Ukázalo sa, že najvyššie obohatené VO ktoré sa zameriavajú up-regulované prepisy boli tkanivovej homeostázy (GO: 0048731; ontológiu: biologickou cestou; p = 6.84-08) (obr 3A), nucleosome (GO: 0000786; ontológiu: bunková zložka; p = 2.10-07) (obr 3B) a väzba (GO: 0005488; ontológie: molekulárnej funkcie; p = 0,001) (obr 3C), a že najvyššie obohatené VO ktoré sa zameriavajú na down-regulované prepisy boli proces biosyntetický sterolov (GO: 0016126; ontológie: biologický proces; p = 0,000) (3D obrázok), mobilné periférie (GO: 0071944; ontológiu: bunková zložka; p = 3.80-06) (obr 3E) steroid aktivita dehydrogenázy (GO: 0016229; ontológiu: molekulárnej funkcie; p = 0,001) (obr 3F) (S5 tabuľka)

Pathway analýza

V tejto štúdii, vykazovali analýza cesta, že 20 cesty dôsledne zodpovedal up-regulované a transkriptov, ktoré najviac. obohatený sieť bola "alkoholizmus-Homo sapiens (človek)" (Fisher-hodnota P = 3.66-08), zložený z 24 cielených génov (obr 4A); Okrem toho, analýza cesta tiež ukázala, že 15 cesty dôsledne zodpovedal down-regulované transkriptov, a že väčšina obohatený sieť bola "Steroidné biosyntézy-Homo sapiens (ľudskej)" (Fisher-hodnota P = 0,00044), zložený z 5 cieľových génov (Obr 4B ) (S6 tabuľke odporúčame p-hodnota cut-off je 0,05). Medzi týmito cestami, gén kategórie narušenie "cirkadiánní rytmus" bolo hlásené, že sú spojené s rôznymi typmi nádorov, vrátane rakoviny žalúdka [16], chronickej myeloidnej leukémie [17], hlavy a krku, karcinóm dlaždicových buniek [18], hepatocelulárneho karcinómu [19 ], karcinóm endometria [20], a rakovina prsníka [21]. Kategória gén "NOD-ako signálne receptor dráhy", ktorý sa skladá z NOD1, bolo ukázal, že NOD1 /CARD4 a NOD2 /CARD15 polymorfizmy génu môže byť spojený so zmenenou rizikom žalúdočné [22], hrubého čreva [23], pľúc [24 ], hrtana [25], žlčník [26], pankreasu [27], tenké črevo, obličky [28], rakoviny močového mechúra [29], rakovina kože, lymfóm [30] a leukémia [31]. Tu sme ďalej skúmali expresiu a funkciu Arnt (aryl uhľovodíkového receptora jadrového translokátoru) sprostredkovanej MDR1 (multidrug odporu 1) up-regulácia dráhy. Bolo zistené, že Arnt a MDR1 boli významne up-regulované v SGC7901 /ADR a bunkových línií /VCR SGC7901 v porovnaní s SGC7901 účinok značné up-regulácia MDR1 sprostredkovaných Arnt expresného vektora transfekciu bola ohrozená cez Sp1 siRNA transfekcia. Test tvorby kolónií doska ukázali, že ceny tvorby kolónií buniek SGC7901 /ADR boli remarably vyššie pARNT + /siSp1- skupiny v porovnaní s pARNT + /siSp1 + skupiny s Adriamycínom (ADR) doplnok do kultivačného Meida (p 0,0001) (obrázok 5).

v reálnom čase kvantitatívnu validáciu PCR

Ak chcete skontrolovať dáta microarray, šesť up-regulované lncRNAs a desať nedostatočne regulovaných lncRNAs boli náhodne vybrané zo dôsledne odlišne exprimovaných lncRNAs s využitím SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR a SGC7901 cellines a QRT-PCR výsledky a údaje sú v súlade microarray (obr 6A); ďalšie štúdium úrovne expresie v týchto lncRNAs v žalúdočnej tkanive odolných voči liečive, dvadsať Vzorky žalúdočných rezistentné a spárovaný non multirezistentných tkaniva boli testované na úroveň expresie týchto lncRNAs pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase (QRT-PCR) (obrázok 6B) .v výsledky preukázali, že vzorky žalúdočné rakovina ošetrené ADR počas 5 dní vystavovaných významný rozdiel hladín expresie týchto šestnástich lncRNAs afformentioned v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr 6c). Okrem toho, korelačný analýza ukázala, že hladiny expresie lncRNA NR_015379 boli v negatívnej korelácii s inhibičných rýchlosťou týchto dvadsiatich vzoriek žalúdočnej rezistentných (obr 6D a 6E, p 0,01).

Diskusia

náš predchádzajúci výskum už zistili, že mier-21 môže podporovať rezistenciu voči liekom rôznych druhov rakoviny [32]; LncRNA-MRUL podporuje ABCB1 expresiu v multirezistentných žalúdočnom rakovinových bunkových sublinií [33]; CUTL1 aktivita je nepriamo spojená s rezistenciou k lieku, a preto je atraktívnym terapeutickým cieľom pre moduláciu multiléčivové rezistencie u karcinómu žalúdka [34]; žalúdočné CSCS boli identifikované z VCR-stabilizovať SGC7901 bunkové línie, vyznačujúci sa vysokou nádorového bujnenia a schopnosti samoobnovy a diferenciácie [35]; MAD2 môže hrať dôležitú úlohu vo vývoji ľudského karcinómu žalúdka, a že umlčanie génu MAD2 môže pomôcť vysporiadať sa s mnohopočetnou liekovou rezistenciou nádorových buniek žalúdka [36] a hypoxiou vyvolal MGr1-Ag /37LRP expresie aktivovanej HIF-1 je závislá na aktiváciu EQF. Tieto udalosti sú závislé na reaktívnych kyslíkových medziproduktov [37] .Avšak, mechanizmy mnohopočetné liekové rezistencie GC sú oveľa objasnená a lncRNAs dysregulácia GC MDR sublinií neboli dosiaľ študované.

V tejto štúdii, GC bunkové línie , SGC7901 a dva MDR sublinie, SGC7901 /VCR a SGC7901 /ADR boli podrobené analýze lncRNA mikročipov. Bioinformatiky a kontrolné pokusy boli vykonané za účelom zistenia potenciálnych lncRNAs zapojené do vývoja MDR. Analýza ukázala, že cesta 15 cesty zodpovedal down-regulované transkriptov a 20 dráhy zodpovedá up-regulované transkriptov (p-hodnota cut-off je 0,05). GO analýza ukázala, že najvyššie obohatené VO ktoré sa zameriavajú up-regulované prepisy boli "vývoj systému" a najvyššie esenriched VO ktoré sa zameriavajú na down-regulované prepisy boli "sterolov proces biosyntetické".

Zvýšenie dôkaz ukázal, že lncRNA ( dlhá nekódujúcej RNA) by mohol zohrávať dôležitú úlohu v karcinogenéze a invázie tumoru a metastáz [38]. Napríklad, John [39] atď preukázané, že lncRNA PCGEM1
je spojená s rakovinou prostaty; Bolo zistené, transformujúci rastový faktor-β-indukovanej lncRNA-Smad7 inhibovať apoptózu buniek zhubného myš prsníka JygMC (A) bunky, a tak navrhujú ed zložitý mechanizmus pre reguláciu anti-apoptotické a tumor-progresívne aspekty TGF-beta signalizácie [40]; lncRNA, rakoviny prostaty, spojené transkript 29 (PCAT29), bol charakterizovaný spolu s jeho vzťahom na androgénny receptor, fungovala ako nádorový supresor androgén-regulovaný u karcinómu prostaty [41]; Yuan atď objavil nový TGF-β-indukovanej lncRNA, lncRNA-ATB, ktorá stimulované EMT cez maskovanie Mir-200S a uľahčovať kolonizáciu stabilizáciou IL-11
mRNA, čím sa podporí ako skoré a neskoré kroky nádorových metastáz [42].

bolo zistené, že lncRNAs hrajú kľúčovú úlohu v meniť expresiu génov kódujúcich proteíny cez cis alebo trans-mechanizmy. Tu sme zistili, že lncRNAs up-regulované v SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR oproti SGC7901lncRNA, ako je AF119893, ktorý bol intronové antisencie k NRP2 (Neuropilin-2). Bolo navrhnuté, že os NRP2 /VEGF-C hrá úlohu v karcinómu močového mechúra odporu terapie a dráhy VEGF-paxillinu-NRP2 môže predstavovať nový terapeutický cieľ pre liečbu rakoviny a iných ochorení súvisiacich s angiogenézou. lncRNA AF461897 bol intronom zmyslové súbeh ABCB9. Dong atď preukázala, že mier-31 pôsobí anti proapoptotický efekt s najväčšou pravdepodobnosťou prostredníctvom inhibície ABCB9, a tým aj novú stratégiu za využitie MIR-31 ako potenciálny cieľ u NSCLC chemoterapiu. lncRNA BC065904 bol intronom zmysel-prekrývanie CTBP2, jeden z transkripčný korepresory z C-koncovej väzobný proteín (CtBP) rodiny, ktorá fungovala ako corepressor z E2F7 a ako regulátor odpovede na poškodenie DNA. lncRNA NR_026900 bol exon zmysel-prekrývanie QSOX1, ktoré bolo preukázané, že zníženie proliferácie, migrácie a invázie buniek rakoviny prsníka in vitro a znižuje rast nádoru in vivo.

Na druhej strane, lncRNAs down-regulované v SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR v porovnaní s SGC7901lncRNA ako je napríklad AF113689 bolo prirodzené antisencie do RRM1. Khatri atď hlásili, že pre-expozície RRM1 siRNA znížil hodnotu IC 50 gemcitabín hydrochloridu 5 záhyby v A-549 buniek v porovnaní so samotným gemcitabín hydrochloridu, čo naznačuje, že RRM1 bol potenciálny onkogén rakoviny pľúc. lncRNA uc010iyh bol intronové antisencie NAIP (neurónové apoptóza inhibičný proteín), ktorý je jedným z IAP-rodiny. Bolo preukázané, že IAP by mohli byť zapojené do poruchy prostaty (BHP, PIN a PC) rozvoj, pretože by mohli byť vyvolať inhibíciu apoptózy a následne bunkovú proliferáciu. LncRNA uc003jsd bol exon zmysel-prekrývanie PDE4D, tj, cAMP-špecifické pre 3 ', 5'-cyklický fosfodiesterázy 4D. Lin apod ukázali, že PDE4D funguje ako faktor nádorové podporujúce a predstavuje jedinečný cieliť enzým rakovinových buniek. LncRNA NR_002332 bol exon zmysel-prekrývanie ST7, potláčajúce karcinogenity 7, ktoré bolo navrhnuté, že je nádorový supresorový gén v regióne chromozóme 7q31.1-q31.2.

analýza ukázala, Pathway potenciálny dráhy zapojené do vývoj mnohopočetné liekovej rezistencie (MDR), karcinómu žalúdka. Arnt bol jeden z 20 dráh dôsledne zodpovedalo up-regulované transkriptov a bolo publikované, že sa podieľa na vývoji mnohopočetné liekovej rezistencie viac malígnych nádorov [43], vrátane mnohopočetného myelómu [44], a AML (akútna myeloidná leukémia) [45] , MDR1 kóduje P-glykoproteín, ktorý je energeticky závislou efluxnej pumpy, ktoré by mohli vyvážať rovinné hydrofóbne molekuly, vrátane niektorých chemoterapeutík, ako je adriamycín, cisplatinu, Taxol a tak ďalej z bunky [46, 47]. Tu sme zistili, že Arnt a MDR1 boli významne up-regulované v SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR bunkových línií compacared do SGC7901, účinku významného up-regulácia MDR1 sprostredkované Arnt expresným vektorom transfekcia bola ohrozená cez Sp1 siRNA transfekcia, ktorá odkazuje na úlohu Arnt-MDR1pathway v MDR fenotyp karcinómu žalúdka.

Ďalšie prešetrovanie ukázalo, že niektoré gény kódujúce proteín podieľajúce sa na fenotypu a vývoji zhubných nádorov drog odporu možno boli cis-regulované korelovaných lncRNAs , Napríklad ABCB1 (ATP-viažuci kazeta, sub-rodina B (MDR /TAP), člen 1, P-glykoproteín (P-gp) kódujúci gén), ktorý sa nachádza 400kb upstream lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-príbuzný a up- regulované lncRNA), bol významne up-regulovaný prostredníctvom potenciálneho vylepšenia podobné úlohe MRUL a podporoval droga-odpor fenotyp SGC7901 /ADR a SGC7901 VCR buniek /[33]; ADAM22, kandidát gén pre malígny transformáciu vaječníkov endometriózy [48], bola korelované s lncRNA AL133090 v exóne sense-prekrývajúce spôsobom; PLCG1 korelovala s lncRNA AK021471 v intronom sense-prekrývajúce spôsobom a opakujúce sa mutácie v PLCG1 bol identifikovaný v angiosarcomas [49]; Fyn korelovala s lncRNA AK AK090692 v intronom sense-prekrývajúce spôsobom a antagomir-1290 potláča CD133 (+) bunky nemalobunkového karcinómu pľúc zacielením Fyn súvisiace Src tyrozínkinázy rodiny [50], atď

Táto štúdia preukázala, že deregulácia lncRNAs sa zaoberajú vývojom mnohopočetné odolnosti phynotype rakoviny žalúdka. Ďalšie analýza týchto lncRNAs a súvisiacich dráh by mohla poskytnúť vhľad do mechanizmov chemoterapie liekovej rezistencie rakoviny žalúdka a poskytnúť nové smery pre reverzné mnohopočetné liekové rezistencie phynotype.

materiáloch a metódach

tvrdenie etika

Všetky experimentálne postupy boli schválené Institutional Review Board štvrtého Vojenskej lekárskej univerzity. Písomný informovaný súhlas bol získaný pre všetky vzorky pacientov.

Bunkové línie a bunková kultúra

Ľudské GC bunkové línie SGC7901 bola získaná z Akadémie Vojenskej lekárskej vedy (Peking, Čína). Dva multirezistentných sublinie, SGC7901 /VCR a SGC7901 /ADR, boli vyvinuté v našom laboratóriu [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR a SGC7901 boli pestované v RPMI1640 médiu (Thermo Scientific Co., USA), ktoré bolo doplnené 10% fetálneho teľacieho séra (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) vlhké s inkubátora s 5% CO2 pri teplote 37 ° C. VCR (1,0 ug /ml) alebo ADR (0,5 ug /ml) bol pridaný do kultivačného média z príslušných buniek pre udržanie fenotypu rezistentné.

Izolácia RNA, značenie a hybridizácia pole

Celková RNA bola zozbieraná z SGC7901, SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR použitie TRIzolu činidla (Invitrogen, CA, USA) a RNeasy Kit (Qiagen Co., Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu, vrátane kroku digescie DNázy. Celková RNA z každej cellline bola kvantifikovaná za použitia Nanodrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), integrita RNA bola hodnotená za použitia štandardných denaturačný elektroforézy na agarózovom gélu, a čistota bola hodnotená pomocou pomeru absorbancie pri 260 nm na 280 nm (A260 /A280). Double-strand cDNA (ds-cDNA) sa pripraví za použitia 5 ug celkovej RNA pomocou súpravy pre syntézu Invitrogen horný index ds-cDNA v prítomnosti 100 pmol oligo dT primérov. Potom sa ds-cDNA bol označený a vykonaná hybridizácia, ako bolo opísané skôr [52]. Označovanie RNA a microarray hybridizácia bola vykonaná KangChen Bio-tech, Shanghai, PR China.

vysoko výkonného lncRNA profil expresie analýza

Kvalifikovaný RNA bola použitá k syntéze dvouřetězcová cDNA za použitia Superscript dvojito plietol cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Dvouřetězcová cDNA bol označený a hybridizován s ľudským LncRNA Microarray V2.0 (Arraystar Co., USA). microarray V2.0 obsahuje asi 33.000 lncRNAs zozbieraných z autoritatívnych zdrojov dát, vrátane NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs z literatúry a UCRs. Sekvencie boli vybrané s proprietárne stratégiou. Opakovanie sekvencie a ncRNAs kratšia ako 200 bp boli odstránené. Pre zvýšenie štatistického dôveru, každý človek poľa lncRNA bola zložená z 60,302 odlišných sond (60 Meru) a každý prepis bola zastúpená 1-5 sond. Každý prepis bola zastúpená konkrétnym exon alebo spojovacie spojovacie sondy na identifikáciu jednotlivých prepisy presne. Mikromaticový hibridization a bioinformatiky analýza bola vykonaná KangChen Bio-tech, Shanghai, PR China. Údaje surové intenzita a štandardizované údaje boli uvedené v génovej expresie Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Quantitative real-time PCR (QRT-PCR)

celková RNA SGC7901, SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR bola izolovaná za použitia TRIzolu činidlo (Invitrogen, CA, USA) a potom bol reverznej transkripcii s použitím PrimeScript RT reakčnej zostave s gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Dalian Čína) podľa mácie výrobcu. Expresie ôsmich up-regulovaných lncRNAs a šiestich down-regulované lncRNAs bola meraná pomocou QRT-PCR za použitia SybrGreen testov (Takara, Dalian, Čína), a GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. Primery sú uvedené v tabuľke 1. úroveň expresie každého lncRNA bol reprezentovaný ako násobné zmeny za použitia 2- △△ Ct metódy. Hladina expresie lncRNAs odlišne exprimované medzi SGC7901 a MDR sublinie SGC7901 /ADR a SGC7901 /VCR bola analyzovaná s použitím Studentovho t-testu s SPSS (verzia 17,0 SPSS LNC). Hodnota p < 0,05 bola považovaná za významnú.

Obsah Histoculture Drug Response (HDRA) čerstvý GC nádorové tkanivo bolo zozbieraná z každej chirurgicky resekované vzorky a umiestni sa do 24-jamkové doštičky. Kocky kolagénu gélové huby (1 cm ^{3) boli ponorené do 1 ml RPMI 1640 sa dopĺňa s 20% fetálnym bovinným sérom. Nádorového tkaniva boli umiestnené do kolagénové huby nasledujúcom ADR boli v konečnej koncentrácii 6 ug /ml pridaný a boli inkubované pri 37 ° C s 5% CO2. Nádorové tkanivo ošetrené fyziologickým roztokom (N.S) bez ADR boli použité ako kontrola. Vyhodnocovacia a výpočtové metódy sú ako bolo opísané skôr [53]. Miera inhibícia (IR) rastu nádoru = (1-priemer absorbancia ošetrených jamiek na gram nádoru /priemerná absorbancia kontrolných jamiek na gram nádoru) x 100. V tejto štúdii, IR cut-off hodnota rovná alebo väčšia ako 30% (IR30) bola definovaná ako chemosenzitivity podľa predbežných výsledkov štúdie [54]. Rovnako ako pokyn, poradňa patologické informácie o zdroje nádorového tkaniva sa používa pre HDRA by mala byť daná príslušne boli prezentované v tabuľke 2.}

bunkové línie a kultivačné podmienky

Ľudský GC bunkové línie SGC7901 bol získané z Akadémie vojenských lekárskych vied (Peking, Čína). Multirezistentných sublinie SGC7901 /VCR a SGC7901 /ADR boli vyvinuté v našom laboratóriu. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, a SGC7901 boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Thermo Scientific, USA), doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra (FCS) (ThermoScientific) v 5% CO 2 zvlhčenom inkubátore pri teplote 37 ° C. Vinkristín (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO, 1,0 ug /ml) a ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO, 0,5 ug /ml) boli pridané do kultivačného média buniek vhodných na sublinií zachovať fenotyp rezistentný

Výstavba pcDNA3.1 (+) -. Arnt plazmid

Ak over-express Arnt pcDNA3.1 (+) - Arnt plazmid bol skonštruovaný. Ľudská Arnt cDNA expresný vektor (pcDNA3.1 (+) - Arnt) bol konštruovaný CW Biotech Co. Ltd, Peking, Čína. Stručne povedané, plazmid pcDNA3.1 (+) - bol vytvorený v súlade s Arnt cDNA sekvencií z GenBank. Gen Arnt bola generovaná pomocou PCR amplifikácie. Plazmid pcDNA3.1 (+), bola extrahovaná pomocou súpravy Maxi Príprava (Omega, Georgia, USA). PCR produkt bol subklonován do BamHI (Takara, Mountain View, USA) a HindIII (Takara) lokalít pcDNA3.1 plazmidmi T4 ligázu (Takara, Mountain View, USA). PCDNA3.1 (+) -. Arnt Konstrukt bol overený sekvenovaním DNA (Invitrogen, Grand Island, USA) (dáta nie sú uvedené)

Generovanie stabilné bunkové línie Arnt

SGC7901 /ADR bunky boli kultivované v 12-jamkových doštičkách s 1,0 x 10 ^{5 buniek v každej jamke, v inkubátore s konštantnou dodávke 5% CO 2 pri 37 ° C. Médium bolo vymenené po 24 hodinách s rôznymi koncentráciami G418 antibiotiká G418 (600 ug /ml) a nahrádza každé 3 dni po dobu 14 dní po bunkovej kultúre. Rodičovské bunky boli transfekovány s pcDNA3.1 (+) - Arnt plazmidy za použitia Lipofectamine 2000 v súlade s pokynmi výrobcu. Hustota buniek bola 2 x 10 5 buniek na jamku v šiestich jamkami. Monoklonálna kolónie buniek s odporom G418 bola generovaná za použitia limitujúci zrieďovacej metódou kultiváciou jedinú bunku v 100 ul média na 96-jamkových doštičkách po dobu 24 hodín. Monoklonálna bunkové kolónie boli štiepené 15 dní neskôr k ďalšiemu zosilneniu ku kultúre buniek so stabilnou Arnt expresiu v 24-jamkových doštičkách. Bunky boli prenesené do bunkovej kultúry banky, kým bol približne 90% zhlukovania. V Arnt nadmerne exprimovaný bunkové línie transfekované pcDNA3.1 (+) - Arnt boli pomenované ako SGC7901 /ADR Arnt}

Malé interferencie RNA (siRNA) transfekcia

Ak chcete porazený výraz Arnt mRNA. , bola vykonaná transfekcia siRNA. Pre transfekciu, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 50 nM siRNA (Gene Pharma Co., Shanghai, Čína) boli použité podľa odporúčania výrobcu, ako bolo opísané skôr [55]. Sírne sekvencie použité sú: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'

Western blotting

celkového bunkového proteínu boli lyžovanie s použitím lyzačného pufra doplneného fenylmetylsulfonyl fluorid (1 mM. ) na ľade. Potom sa proteín sa podrobí elektroforéze cez 12% SDS polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membránu (Millipore, Massachusetts, USA). 5% odtučneného sušeného mlieka bol použitý na blokovanie membrány pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny a primárne protilátky boli inkubované cez noc. Ďalej boli membrány inkubovali s protilátkami značenými sekundárnymi HRP po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti po troch 10 min premytí v trietanolamín vyrovnanom fyziologickom roztoku Tween (TBS-T). Napokon, signály boli detekované s použitím kitu ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) a membrány boli skenované a analyzované za použitia ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, Kalifornia, USA), zobrazovací systém sa zobrazovacie softvér (verzia 1.0) , Tubulínu bola použitá ako vnútorná kontrola. Spectra viacfarebný široká škála proteín rebrík (Beyotime, Jiangsu, Čína) bol použitý ako molekulárne marker. Protilátky použité vo Western blot testu je možné vidieť v tabuľke 3.

kolónií Plate test formovanie

log-fázy boli bunky zozbierané, umiestnené do šiestich jamkami (1 x 10 ^{4 buniek /jamku) a chemoterapeutickej lieky boli pridané do kultivačného média na druhý deň. Výsledné kolónie boli zafarbené Coomassie Brilliant Blue (Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA), a viditeľné kolónie boli počítané po 2 týždňoch.}

Analýza dát

V tomto štúdie, informatiky analýza dát bola vykonávaná KangChen Biotech (Shanghai, PR Čína) .Všetky klzákov boli skenované pri 5 lm /pixelov pomocou Axon GenePix 4000B skener (Molecular Devices Corporation) runed softvérom GenePix Pre 6.0 (Axon). Naskenovaných obrázkov (formát JPEG) potom boli vykonané zarovnanie mriežky a expresné analýza dát pomocou NimbleScan softvéru (verzia 2.5). Expresné Údaje boli normalizované pomocou robustné mnohočipové Priemerná (RMA) algoritmu v softvéri zahrnuté NimbleScan. Navyše súbory sa úroveň sondy a súbory hladiny mRNA boli vytvorené po normalizácii. Všetky súbory génovej úrovni boli importované do softvéru Agilent GeneSpring GX (verzie 11.5.1) a normalizovali do kvantilu metódou; Potom, Combat softvér bol použitý k úprave normalizovanej intenzity pre odstránenie dávkové účinky. Výrazne boli identifikované rozdielne vyjadrené lncRNAs a mRNA prostredníctvom filtrovania Volcano Plot. Hierarchické zhlukovanie bolo vykonávané s použitím softvéru Agilent GeneSpring GX (verzie 11.5.1) [56]. Údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Lineárne korelačný analýza bola vykonaná metódou Pearson v SPSS, verzia 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Rozdiely boli považované za významné pri hodnote P < 0.05.

Podporné informácie
S1 tabuľku. V lncRNA expresné profilovanie dát
DOI: 10,1371. /Journal.pone.0135461.s001
(XLS)
S2 stôl. Dôsledne up-regulované a down-regulované lncRNAs medzi SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR a SGC7901
doi :. 10,1371 /journal.pone.0135461.s002
(XLS)
S3 Tab. MRNA expresia profilovanie dát
doi :. 10,1371 /journal.pone.0135461.s003
(XLS)
S4 Tab. Dôsledne up-regulované a down-regulované mRNA medzi SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR a SGC7901
doi :. 10,1371 /journal.pone.0135461.s004
(XLS)
S5 Tab. Gene Ontology (GO) analýza
doi :. 10,1371 /journal.pone.0135461.s005
(XLSX)
S6 Tab.

• Ploche ONE: Sérum HER2 je potenciálna náhrada za tkanivové HER2 postavenie v rakoviny žalúdka: systematická kontrola a Meta-Analysis
• Ploche ONE: HIF-1α Indukuje mnohopočetné liekovej rezistencie v žalúdku nádorových buniek tým, že prinúti Mir-27a