Ploche ONE: HIF-1α Indukuje mnohopočetné liekovej rezistencie v žalúdku nádorových buniek tým, že prinúti Mir-27a

abstraktné

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť vzťah medzi HIF-1α a mier-27a prejavu a vyhodnotiť vplyv inhibícia HIF-1α výrazom na Mir-27a prejavu a rezistencie u rakoviny žalúdka (GC). V tejto štúdii, v reálnom čase, PCR a Western Blot boli vykonávané pre detekciu expresie HIF-1α v GC tkanív a bunkových línií. Potom, OCUM-2MD3 /L-OHP bunky boli transfekovány HIF-1α-siRNA, s Mir-27a mimetikum či pcDNA-HIF-1 a, a prežívanie buniek bola stanovená pomocou testu MTT. Expresie HIF-1 a, mier-27a, a MDR-príbuzných génov bola meraná pomocou real time-PCR a Western blot. Chip a duálny testy aktivity luciferázy boli vykonané posúdiť transkripčný regulácia HIF-1α a mier-27a. Výsledky odhalili, že transfekcia s HIF-1α-siRNA sa výrazne znížil hladiny MIR-27a, čo má za následok výrazne zvýšenú inhibíciu rýchlosti proliferácie OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek. V porovnaní s non-transfekciou buniek, miera prežitia bola významne znížená v bunkách transfekciou HIF-1α-siRNA po ošetrení L-OHP. Miera prežitia buniek bola významne zvýšená v OCUM-2MD3 /L-OHP buniek transfektovaných s Mir-27a Mimic, vzhľadom k tomu, HIF-1α nadmerná expresia neviedlo jasného zmene prežitie buniek. Výsledky testu duálneho aktivity luciferázy preukázané, že HIF-1α zvyšuje transkripčný aktivitu promótorom v bunkách miR27a transfekovány reportérovým plazmidom, ktorý obsahuje proti smeru promótorom miR27a spolu s pcDNA-HIF-1α. Analýza chipy navrhol, že HIF-1α priamo viaže na promotorové oblasti miR27a. Inhibícia HIF-1α alebo výrazu miR27a znížil MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 expresie v OCUM-2MD3 /L-OHP buniek. Tak sme zistili, že HIF-1α je úzko spojená s MDR v GC a že HIF-1α môže potlačiť MDR1 /P-GP, LRP a Bcl-2 expresie tým, že inhibuje MIR-27a výraz

Citácia :. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Ventilátor LQ, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α Indukuje mnohopočetná lieková rezistencia u nádorových buniek žalúdka vyvolaním MIR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10,1371 /journal.pone.0132746

Strih: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Spojené štáty

Prijaté: 5. januára 2015; Prijaté: 17.června 2015; Uverejnené: 20.srpna 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená grantom nasledovné :. Krajinský Natural Science Foundation v provincii Che-pej (č H2013206311 až Qun Zhao)

súťažiť záujmy :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je jedným z najčastejších zhubných nádorov a spôsobuje vážne škody na celom svete [1, 2] Po rokoch technologický pokrok v diagnostike a liečbe GC, jej výskyt a úmrtnosť klesali po celom svete, ale zostávajú vysoké v ázijských krajinách [3, 4]. V súčasnej dobe resekcii žalúdka je k dispozícii len spôsob, ako vyliečiť GC. Je však ťažké dosiahnuť úplné vyliečenie cez chirurgické odstránenie nádoru, pretože väčšina pacientov trpí pokročilým GC pri diagnóze [5, 6]. Z tohto dôvodu, chemoterapia hrá veľmi dôležitú úlohu v komplexnej liečbe GC. Aj keď chemoterapia veľmi postupoval vo vzťahu k liečbe pokročilého GC, [7, 8] prognóza GC stále nedostatočná, s mierou prežitia 5 rokov menej ako 30%, [9]. Táto prognóza je primárne kvôli mnohopočetné liekovej rezistencie (MDR) GC buniek. MDR v GC často vedie k zlyhaniu chemoterapiou [10-12]. Preto existuje naliehavá potreba vyvinúť nové sľubné terapeutické stratégie na účinné zníženie MDR v GC.

Nedostatok kyslíka je prevládajúce v solídnych nádorov a je spojená s rôznymi biologickými funkciami. V súčasnej dobe, hypoxiou indukovatelný faktor (HIF) -1α sa považuje za úzko spojené s hypoxiou. HIF-1α je silne exprimovaný v rôznych zhubných nádorov [13, 14] a slúži ako základný faktor pre reguláciu adaptáciu nádorových buniek na hypoxii [15]. HIF-1α bolo navrhnuté byť úzko spojená s GC MDR [16, 17]. Je však jasné, ktoré dráha sprostredkováva úlohu HIF-1α v GC MDR.

V posledných rokoch úloha mikroRNA (miRNA), pri rakovine sa stala široko skúmaná mechanizmus iniciácie a liečbe nádorov. MIR-27a, člen rodiny miRNA, bolo preukázané, že vplyv na MDR GC [18]. Okrem toho, expresia MIR-27a je v hypoxické prostredí [19] zvýšil. Tieto zistenia naznačujú, že HIF-1α môže regulovať expresiu Mir-27a a ovplyvňujú GC MDR. Avšak, zvláštne regulačné mechanizmy musia byť ešte objasnený. Táto štúdia ukázala, že expresia HIF-1α a mier-27a boli významne up-regulované v GC tkanivách a bunkových líniách, najmä v rezistentných bunkových línií.

transfekcia s konkrétnou malé interferujúce RNA pre blokovanie endogénnej HIF -1α za následok zníženie MIR-27a prejavu a zmiernenie MDR bunkových línií v GC. Tieto nové nálezy naznačujú, že inhibícia expresie HIF-1α potláča transkripciu MDR súvisiacich génov MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 oslabovať MDR z GC buniek potlačením MIR-27a výraz.

materiály a metódy

1.1 materiály

Žalúdočné bunkové línie OCUM-2MD3 bol od profesora Masakazu Yashiro v Japonsku Oita lekárskej ordinácii [20]. Stabilné rezistentné bunková línia OCUM-2MD3 /L-OHP2 bol získaný kultiváciu a selekciu našej výskumnú skupinou. Bunková línia GSE-1 bola zakúpená od Cell Resource Center v Shanghai inštitútov pre Biological Sciences z Čínskej akadémie vied. RPMI 1640 kultivačné médium a trypsín boli získané od Gibco Company; TRIzolu činidlá a transfekční činidlá Lipofectamine 2000 boli zakúpené od Invitrogen. Reverznej transkripcie súpravy a fluorescencie kvantitatívnej PCR činidlá bola získaná od Promega Corporation. PCR primery a malé interferujúce RNA boli syntetizované Shanghai Biological Engineering Company. Sada Extrakcia proteín sa získa z Beyotime Company, Čína. Primárne protilátky proti HIF-1 a, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS alebo GAPDH boli zakúpené od Santa Cruz. MTT bol získaný od firmy Sigma. Naša štúdia bola schválená etickou komisiou štvrtého Affiliated nemocnice Hebei lekárskej univerzity.

1,2 Klinická príprava vzoriek

Všetkých 65 pacientov s GC boli vybrané po resekcii žalúdka a patologické potvrdenie vo štvrtom nemocnice Hebei lekárskej univerzity, vrátane 42 mužov a 23 žien vo veku 60,5 ± 8,1 rokov, ktorí sa nedostali predoperačnej rádioterapii alebo chemoterapii. S rakovinou a para-karcinómu tkaniva (približne 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) boli odobraté z každého pacienta, a vzorky boli rýchlo zmrazený v kvapalnom dusíku a následne prenesené na -80 ℃ zachovanie. Všetci účastníci podpísali informovaný súhlas.

1,3 Bunková kultúra a transfekcia

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP a GSE-1 bunkové línie boli kultivované v médiu RPMI 1640 doplnenom 10% fetálne hovädzie sérum (FBS), 100 U /ml penicilínu a 100 mg /ml streptomycínu. Pozoruhodne, médium z buniek OCUM-2MD3 /L-OHP sa nechá reagovať s L-OHP v koncentrácii 75μg /ml, aby si zachovali drog odporu fenotyp, jeden týždeň pred chirurgickým zákrokom pre zastavenie liečby. Bunky boli inkubované vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére pri teplote 37 ° C}

Tri HIF-1α-siRNA sekvencie boli navrhnuté s použitím BLOCK-it RNAi Designer (sekvencia 1 :. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sekvencia 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt sekvenčné 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), z ktorých každý bol žíha s ich komplementárne sekvencií a transfekovány, respektíve do OCUM-2 MD3 /L-OHP GC buniek. Non-špecifická siRNA sekvencie (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) bola použitá ako negatívna kontrola. Mimetikum sekvencie miR27a bola 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 '. Ľudské plnej dĺžky HIF-1α CODEN sekvencie bola subklonována do vektora pcDNA3.1. pGL3-miR27a-luc, pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic a PRL-TK plazmidy boli skonštruované a konzervované v našom laboratóriu.

GC Bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičkách počas 24 hodín pred transfekcia v hustotu 4 x 10 ^{5 buniek /ml. Tieto plazmidovej vektory, siRNA alebo miR27a napodobniť bol transfekován do GC buniek alebo buniek rezistentných s použitím transfekčního činidla Lipofectamine nasledujúce pokyny výrobcu. Potom boli bunky premyté antibiotikami bez séra RPMI 1640 chýba. Účinnosť transfekcia bola meraná po 24 hodinách, po ktorom nasledujú nasledujúcich pokusoch.}

1,4 Test MTT

GC tkanív a normálny para-karcinóm tkanivo bolo homogenizované na prípravu jednotlivej bunkovej suspenzie filtráciou cez 300 -Síťovitá tvorba meď mriežka. GC bunky štiepené za použitia 0,02% EDTA, 0,25% trypsínu boli schovať v hustote 5 x 10 ^{4 buniek /ml na dosky s 96 jamkami. Potom, čo bunky dosiahli asi 60% zhlukovania, HIF-1α-siRNA bol transfekován alebo bola použitá chemoterapeutickej liečivo (150μg /ml L-OHP). Každá skupina pozostávala zo šiestich jamiek. Potom sa 20 ul 5 mg /ml MTT bolo pridané počas 4 hodín pred koncom experimentu. Bunky boli kultivované po dobu 4 hodín, a potom sa kultivačné médium sa odstráni. Ďalšie, 150μl DMSO bolo pridané do každej jamky, a hodnoty OD bola meraná pri 490 nm s použitím čítačky mikrotitračných doštičiek po pretrepaní doštičku počas 15 min pri izbovej teplote. Experimenty boli opakované trikrát.
Izolácia}

1,5 RNA a kvantitatívnej RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu v jednom kroku spôsobu, a 2 ug RNA bola použitá pre reverzné transkripcii pre generovanie šablóny cDNA. Relatívna hladiny mRNA boli stanovené cez kvantitatívne PCR, GAPDH slúžila ako vnútorná referenčná gén. Parametre PCR boli nasledujúce: 95 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 45 cyklov denaturácie pri teplote 94 ° C počas 30 s a žíhanie pri teplote 60 ° C počas 30 s. Sekvencia Prímom boli navrhnuté s použitím Primeru 5.0 a boli hľadané špecifickosti. Sekvencie primérov sú nasledujúce: HIF-1α (93 bp): (F) 5'-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 'a (R) 5'-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3'; MDR1 (126 bp): (F) 5'-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 'a (R) 5'-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3'; GST-π (151 bp): (F) 5'-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 'a (R) 5'-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3'; Bcl-2 (98 bp): (F) 5'-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 'a (R) 5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'; LRP (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'a (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; TS (129 bp): (F) 5'-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 'a (R) 5'-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3'; a GAPDH (138bp): (F) 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 'a (R) 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'. Kvantitatívne výsledky PCR boli vypočítané za použitia 2 ^{-ΔΔCt metóda}

1,6 Western blot

Vzorky tkaniva a buniek boli lyžovanie s použitím lyzačného pufru RIPA :. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, a 0,5% NP-40. Rovnaká množstvo vzoriek proteínov boli separované na 10% polyakrylamidových géloch SDS (SDS-PAGE) a boli electrotransferred na polyvinylidénfluorid (PVDF) membránu (Amersham Pharmacia Biotech). Membrány boli blokované 5% BSA po dobu 2 h a inkubované s primárnou protilátkou cez noc pri 4 ° C. Membrány boli inkubované po dobu 2 hodín v chrenovej peroxidáze konjugovanou sekundárnou protilátkou. Cieľové skupiny boli detekované s použitím detekčnej súpravy (Santa Cruz, USA) zvýšená chemiluminiscencia (ECL). β-aktínu bol použitý ako endogénne kontrolného génu. Pokus bol replikuje trikrát.

1,7 chromatín Imunoprecipitácia (Chip) test

čip testy boli vykonávané podľa metódy z Wang et al. [21]. Bunky s inou liečbou boli fixované 1% formaldehydu počas 15 minút pri teplote miestnosti, a ukončené na konečnú koncentráciu 0,125 M glycínu. Potom boli bunky lyžovanie za použitia 300 ul lyzačného pufra (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet inhibítory P-40, 0,5% deoxycholátu, a proteázy). Fragmenty buniek sa podrobí pôsobeniu ultrazvuku v ľadovej vodnom kúpeli, čím sa získa chromatín fragmenty o 600 bp, ako bolo stanovené elektroforézou na agarosovém gélu. Po odstredení pri 13000 otáčkach za minútu počas 10 minút, supernatanty boli odobraté a pre-zrušené počas 15 min pri 4 ° C pomocou inkubácie s 30 ul perličiek proteín A-Sepharose a nastrihané DNA z lososieho spermií. Po odstredení pri 13000 otáčkach za minútu po dobu 5 minút, supernatanty boli rozdelené na tri rovnaké časti: jedna pre vstup, ďalšie dva pre imunoprecipitáciou s alebo bez HIF-1α protilátky. Ďalší deň, imunitný komplexy boli precipitované proteín A-Sepharose korálky a nastrihané DNA z lososieho spermií, potom perličky boli odobraté po dvakrát premyté premývacím pufra I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, a 2 mM EDTA), nasledovaný premývacieho pufra II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, a 2 mM EDTA) a premývací pufer III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoxycholátu, a 1 mM EDTA) a konečná premývací pufer IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, a 1 mM EDTA). Imunoprecipitáty boli eluované pomocou 200 ul elučného pufru (1% SDS a 0,1 M NaHCO _{3), s následnou inkubáciou pri teplote 65 ° C cez noc. Ďalší deň, DNA z každej vzorky bola izolovaná a bola vykonaná PCR pre amplifikáciu promotorové segmenty, ktoré obsahujú väzobné miesto HIF-1α.}

1,8 luciferázové testy

bunky vyrásť do 70% zhlukovania a potom boli transfekovány trojmo s pGL3-MIR-27a-Luc, pcDNA-HIF-1α alebo pGL3-Basic, spoločne s prl-TK. Po 48 hodinách od transfekcia boli bunky pozbierané a aktivita luciferázy bola meraná s použitím Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) podľa protokolu výrobcu. Luciferázy aktivity prl-TK boli slúžila ako vnútorná kontrola.

1.9 Štatistická analýza

Výsledky sú uvedené ako priemer ± S.D. ANOVA a Dunnettov test bol vykonaný pomocou softwaru SPSS 11.5.

Výsledky

1 HIF-1α a miR27a sú odlišne exprimované medzi žalúdočné para-karcinómu tkanivá a GC tkaniva

expresie HIF-1α v GC tkanive v porovnaní s žalúdočné para-karcinómu tkaniva bola stanovená pomocou QRT-PCR, a Western blot, a citlivosť buniek L-OHP bola stanovená pomocou testu MTT. HIF-1α (obr 1A, 1B a 1C, qPCR a Western blot) a miR27a (obr 1D, qPCR výsledky) sú up-regulované v GC tkanive v porovnaní s žalúdočné para-karcinómu tkaniva. MTT test preukázal, že miera prežitia buniek bol v GC tkanive väčšia ako v žalúdku para-karcinómu tkanivá, kedy bol L-OHP pridaný do jednobunkové suspenzie tkanivových (Obr 1E, histogram).

2 HIF -1α a miR27a sú odlišne exprimované medzi epiteliálne bunkové línie žalúdočnej sliznice a línie
GC buniek

expresie HIF-1α bola najvyššia v OCUM-2MD3 /L-OHP a OCUM-2MD3 buniek, postupne, a bol najnižší v GES-1 bunkami (obr 2A, 2B a 2C, qPCR a Western blot). Okrem toho, expresia miR27a zobrazený rovnaký trend, v ktorom OCUM-2MD3 /L-OHP bunky zobrazené najvyššiu expresiu, nasledovaný OCUM-2MD3 bunky a bunky GSE-1 zobrazená najnižšiu expresie MIR-27a (obr 2D, výsledky qPCR). MTT test ukázal, že keď L-OHP bol pridaný do troch bunkových línií, OCUM-2MD3 /L-OHP bunky vykazovali najvyššiu mieru prežitia buniek, nasledovanou OCUM-2MD3 buniek, a že bunky GSE-1 vykazovali najnižšie prežívanie bunky miera (obr 2E, histogram).

3 HIF-1α-siRNA potláča expresiu miR27a a liekovú rezistenciu na OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek

Western blot analýza ukázala, že hladiny mRNA a proteínové HIF-1α znížila v rôznej miere v OCUM-2MD3 /L-OHP buniek transfektovaných s tromi pármi HIF-1α-siRNA, zatiaľ čo HIF-1α výraz sa nezmenil v bunkách transfekciou kontrolnej siRNA. HIF-1α výraz sa objavil pokles najviac strmo, približne o 90%, za použitia HIF-1α-siRNA-2 (obr 3A). Ako je znázornené na obr 3B, HIF-1α expresie klesla v týchto bunkách spôsobom závislým od dávky, v ktorej HIF-1α vyjadrenie sa znížil o viac ako 95% v bunkách transfekciou 80 nM HIF-1α-siRNA-2, keď HIF- 1α-siRNA-2 bol ďalej transfekovány v dávke 20 nM, 40 nM alebo 80 nM. Okrem toho, maximálny inhibičný efekt bol zistený 48 hodín po transfekciu (obr 3C).

expresie miR27a sa významne znížila po transfekciu OCUM-2 MD3 /L-OHP buniek s HIF-1α-siRNA-2 (3D obr). MTT test je uvedené, že miera prežitia buniek bola významne znížená po ošetrení HIF-1α-siRNA-2-transfekované OCUM-2 MD3 /L-OHP bunky s L-OHP v porovnaní s non-transfekciou buniek (obrázok 3e).

4 Účinky miR27a na MDR zo OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek

expresie miR27a bola up-regulované v OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek, kedy miR27a napodobňovať bola spolupráca transfekovány do týchto GC buniek odolných voči liečive, ktoré boli prenesené s HIF-1α-siRNA (obr 4A). Avšak, žiadny významný rozdiel v expresiu HIF-1α bola detekovaná v OCUM-2MD3 /L-OHP buniek po transfekciu (obr 4B a 4C, qPCR a Western blot).

MTT test preukázal, že prežitie miera OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek bolo jednoznačne zvýšila po transfekciu s miR27a Mimic (obr 4D, histogram).

5 HIF-1α indukuje transkripciu miR27a v OCUM-2MD3 buniek

expresie HIF-1α bola v OCUM-2MD3 buniek transfektovaných eukaryotického expresného plazmidu pcDNA-HIF-1α po dobu 48 h (obr 5A) výrazne zvýšil. Okrem toho, miR27a expresia bola jasne up-regulovaná (obrázok 5B). Tak, tieto výsledky naznačujú, že HIF-1α je kritickým faktorom, ktorý ovplyvňuje transkripciu miR27a. Preto sme založili Luciferase reportér génu plazmid nesúci 2 kb sekvencie v protismere od promotorové oblasti miR27a, ktorý bol kotransfekovány pcDNA-HIF-1α do buniek. Dáta ukázali, že DLA HIF-1α zvyšuje promotorovou aktivitu miR27a po ko-transfekciu (obr 5C). Analýza chipy ďalej potvrdili, že HIF-1α priamo viazaná na promotorové oblasti miR27a (obr 5D). Výsledky ukázali, že HIF-1α môžu podporovať transkripciu miR27a v OCUM-2MD3 buniek priamo väzbou na promotorové oblasti miR27a.

6 Inhibícia HIF-1α pomocou siRNA potláča expresiu drogovej odolnosti súvisiace gény

Ako je znázornené na obr 6, je inhibícia HIF-1α výrazne potlačená expresia MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 v OCUM-2MD3 /L-OHP buniek, ale nemení významne expresie GST-π alebo TS. (Obrázok 6).

7 Inhibícia miR27a znižuje drogovej odolnosti súvisiacich génovej expresie u OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek

miR27a bola potlačená v rezistentné GC OCUM-2MD3 /L-OHP buniek transfekciou s anti-miR27a sekvencie (obr 7A). Okrem toho, po tejto transfekcia, expresia MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 sa významne znížili, zatiaľ čo žiadny významný rozdiel bol zistený v expresiu GST-π alebo TS (obr 7B, 7C a 7D, qPCR a Western blot). (Obr 7)

Diskusia

Aj keď sa zdá celosvetová miera výskytu GC, aby sa znížil v posledných rokoch vysoký výskyt GC pretrváva, vážne ohrozuje zdravie jednotlivcov v Ázii [22] , MDR z GC buniek prispieva k zlej prognóze GC, kde nedostatok kyslíka hrá kritickú úlohu. V tejto štúdii sme založili stabilné bunkové línie OCUM-2MD3 /L-OHP, ktorý je odolný voči L-OHP. Naše dáta ukázali, že GC tkanivá a bunkové línie vykazujú väčšiu rezistenciu voči liekom, ako normálne žalúdočné epitelových tkanív a bunkových línií. Tiež sme zistili, že bunky rezistentné vyvinúť oveľa silnejší MDR. Naše výsledky ukázali zvýšené expresie HIF-1α v GC tkanív a bunkových línií, a bola zistená najvyššia expresie HIF-1α v bunkovej línii rezistentné. Preto navrhujeme, aby HIF-1α prispieva k rozvoju MDR v GC buniek.

Gen HIF-1α kóduje proteín, ktorý sa skladá z 826 aminokyselín s molekulovou hmotnosťou 120 kDa [23]. Mnohé štúdie potvrdili, že zvýšená expresia HIF-1α je pevne spojená s výskytom a vzniku nádorov [24-28]. Iné štúdie naznačujú, že zvýšená expresia HIF-1α zlepšuje vlastnosti rezistentné na rôznych nádorových buniek [29-32]. Okrem toho, naša štúdia preukázala, že GC tkanivá a bunkové línie vykazujú väčší odpor na chemoterapeutiká ako žalúdočné para-karcinómu tkanív a žalúdočnej sliznice bunkových línií. Tiež sme zistená najsilnejší drog rezistencie in GC buniek. Avšak mechanizmy, ktorými HIF-1α reguluje MDR doteraz musí byť jasne identifikované v GC buniek. Preto sme ďalej vyšetrovať účinky HIF-1α na vlastnosti MDR GC buniek cez interferenciu génov a klonovanie. RNA interferencie (RNAi) je zobrazená výhody vo špecifickosťou, účinnosti a trvanlivosti pre reguláciu expresie cieľového génu [33]. Naše údaje ukazujú, že inhibícia HIF-1α výrazne znížiť rezistenciu voči liekom v OCUM-2MD3 /L-projekčné buniek. Navyše sme preukázali, že rezistencia bola výrazne zvýšená, keď pcDNA-HIF-1α, ktorý bol použitý pre zvýšenú expresiu HIF-1 a, bol transfekován do non-rezistentné GC bunkových línií. Naše výsledky ukazujú, že HIF-1α hrá zásadnú úlohu v rozvoji MDR v GC.

Nedávne štúdie ukázali, že MDR úzko súvisí s miRNA v nádoroch [34-36]. Hu oznámila, že zneškodňovanie Mir-27a môže zmeniť vlastnosti MDR GC buniek [18]. Okrem toho bolo publikované, že mier-21, MIR-27a, mier-210 a mier-181b sú up-regulované cez HIF dráhy v hypoxické prostredie založené na génovej čipe testu [19]. V súlade s našimi výsledkami, HIF-1α pozitívne spojená s expresiou Mir-27a v GC tkanív a bunkových línií, a inhibícia HIF-1α znížil MIR-27a. Na rozdiel od toho zvýšená expresia HIF-1α indukovanú expresiu MIR-27a. Tieto výsledky ukazujú, že HIF-1α reguluje expresiu MIR-27a. Navyše, naše štúdia ukázala, že mier-27a napodobňuje zachránil vlastnosti drog odporu článkov HIF-1α-porazený. A čo je najdôležitejšie, HIF-1α priamo viaže na a podporuje miR27a transkripcii, čo naznačuje, že HIF-1α reguluje MDR GC pomocou MIR-27a.

vyznačujúci sa tým sme expresiu génov, ktoré sú úzko spojené s MDR, vrátane MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 a TS, pred a po modulácii HIF-1α expresiu v GC buniek na objasnenie mechanizmu, ktorým HIF-1α-MIR-27a dráha reguluje MDR GC , Preukázali sme, že inhibícia expresie HIF-1α znižuje expresiu MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2. Hladiny expresie týchto génov bola významne zvýšená, keď boli bunky transfekovány s Mir-27a napodobniť, pričom sa významne nemení hladiny expresie GST-π a TS. V súlade s týmto zistením, zvýšená expresia HIF-1α silne up-regulovaná expresia MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 v bunkovej línii GC OCUM-2MD3. Preto naše dáta ukazujú, že HIF-1α-MIR-27a dráha sprostredkováva vlastnosti MDR v GC tým, že prinúti MDR1 /P-GP, LRP a Bcl-2 expresie.

Naše štúdie ukazujú, že HIF-1α a mier -27a sú up-regulované v GC tkanív a bunkových línií. HIF-1α pôsobí ako upstream regulátor MIR-27a. HIF-1α-MIR-27a signalizácia zlepšuje vlastnosti MDR indukciou expresie MDR1 /P-gp, LRP a Bcl-2 v GC. Tieto výsledky naznačujú, že HIF-1α-MIR-27a systém hrá kľúčovú úlohu v iniciácii MDR v ľudskom GC, ktorý môže slúžiť ako nový terapeutický cieľ pre MDR v GC.

Podporné informácie
S1 súborov. Údaje o MTT a západnej
doi :. 10,1371 /journal.pone.0132746.s001
(ZIP)

• Ploche ONE: multirezis odolnosti s dlhým nekódujúca RNA Analysis Expression Profil rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Regulačné B Cell funkcia je potlačená fajčenie a obezita v H. pylori-infikovaných pacientov a koreluje so zvýšeným rizikom rakoviny žalúdka