Ploche ONE: Zic1 Promoter hypermetylace v plazme DNA je potenciálny biomarkerov pre rakoviny žalúdka a intraepiteliálna Neoplasia

abstraktné

Karcinóm žalúdka (GC) zostáva jedným z najčastejších nádorových ochorení zažívacieho na celom svete; Avšak, väčšina pacientov prezentovať v pokročilom štádiu pri stanovení diagnózy. Zic1
je nová kandidátnej nádorový supresorové gén, ktorý je epigenetické umlčaný v GC. V tejto štúdii sme skúmali Zic1
metylácie promótorom v plazmovej DNA ako nové molekulárne marker na včasnú diagnostiku a sledovanie GC. Metylácia špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (MSP), test bol vykonaný pre detekciu Zic1
promótor metylácie DNA v plazme od 20 zdravých jedincov, 50 intraepiteliálna neoplázia pacientov žalúdočných a 104 pacientov GC. Zic1
promótor rýchlosť metylácie vo vzorkách plazmy od zdravej kontrolnej skupiny bola 0%, ale dosiahla 54,0% v intraepiteliálna neoplázia skupiny a 60,6% v skupine s GC. Posledné dve uvedené hodnoty boli výrazne vyššie, než je nájdený v zdravej kontrolnej skupiny (p menšie ako 0,05), sa 100% špecificitou pre intraepiteliálna neoplázia a GC diagnózu. Pozitívna prediktívna hodnota plazmy Zic1
metylácie promótorom pre diagnostiku intraepiteliálna neoplázia a GC bola 100%. Stav metylácie v skupine GC nebola významne spojená s veľkosťou nádoru, diferenciácie nádoru, lymfatických uzlín, TNM staging, alebo invázia tumoru (p 0,05). Posúdenie významu detekcie karcinogénnych-embryonálny antigén (CEA) úroveň a Zic1
promotér metylácie sadzba pre GC diagnózy bolo zistené, že citlivosť Zic1
promotér metylácie bola významne vyššia ako u hladiny CEA ako marker, a že kombinovaná meranie týchto dvoch indexov (paralelné vyšetrenie) sa zlepšila citlivosť. Celkovo vzaté, naše výsledky naznačujú, že Zic1
promotér miera metylácie v DNA z plazmy má veľký význam pre včasné skríning GC a monitorovanie vzniku nádorového ochorenia. Zic1
promotér metylácie môže slúžiť ako nová neinvazívna plazmového biomarkeru pre včasnú detekciu GC a na hodnotenie rizika v populáciách s vysokým rizikom. Kombinované meranie Zic1
promotér metylácie frekvencie a hladiny CEA (paralelné skúšky) môže zvýšiť súčasné usmernenia pre včasnú diagnostiku GC

Citácia :. Chen X, Lin Z, Xue M , Si J, Chen S (2015) Zic1
Promoter hypermetylace v plazme DNA je potenciálny biomarkerov pre rakoviny žalúdka a intraepiteliálna nádorové ochorenia. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10,1371 /journal.pone.0133906

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

prijatá: 10. apríla 2015; Prijaté: 02.07.2015; Uverejnené: 24.července 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola financovaná National Science Foundation Natural Číny (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang provinčné lekársky a zdravie všeobecne výskumný zámer (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang provinčné ministerstvo školstva výskumného zámeru (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn), a Zhejiang provincie kľúčové oblasti vedy a technológie inovácie tím (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Financovateľom Shujie Chen pochopil a navrhol experimenty tohto rukopisu

Konflikt záujmov: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Karcinóm žalúdka (GC) je jedným z najčastejších typov rakoviny zažívacieho a treťou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete [1]. Väčšina pacientov GC prítomných v pokročilom štádiu po stanovení diagnózy. Globálne, GC zodpovedá za takmer 952 tisíc nových prípadov ročne podľa GLOBOCAN 2012 [2]. V Japonsku sa miera prežitia počas 5 rokov pre včasné GC (EGC) je 86% v porovnaní s 32% pre pokročilých GC, podľa údajov amerického programu SEER [3].

Aberrant metylácie DNA je dôležitá epigenetické zmena a skorý udalosť v karcinogenéze [4]. V poslednej dobe niekoľko tumor supresorové gény (ZTS), vrátane FAM5C
omyl
P16 stroje a E-cadherin
boli hlásené byť methyluje v sére /plazme pacientov GC [5-7]. Okrem toho, hypermetylace o zaručené tradičné špeciality má tendenciu byť posilnená s progresiou prekanceróznych lézií [8-9]. Preto je detekcia methylata DNA v sére /plazme môže byť jeden sľubný prístup pre včasnú diagnostiku GC. Intraepiteliálna neoplázia (IN) je potenciálne prekancerózne lézie, ktoré udeľuje vysoké riziko GC; To znamená, že skríning pacientov, u má zásadný význam pre diagnostiku a predikciu GC. Niekoľko správ o hypermethylated DNA analýz vzoriek krvi od žalúdočných intraepiteliálna neoplázia (GIN) pacientov Doteraz nie sú k dispozícii.

Rastúce dôkazy nasvedčujú tomu, že Zic1
( Zic
rodina člen 1 , odd-spárovaný Drosophila homológov) sa podieľa na progresiu niektorých karcinómov [10-13]. Už skôr sme zistili, že Zic1
, nová TSG, sa vypne pomocou promotora hypermetylace ako GC buniek a tkanív [14]. Tiež sme preukázali, že Zic1
sa podieľa na inhibíciu GC bunkovej prežitia a zníženie hodnoty migrácie buniek [15].

V tejto štúdii sme zistili, včasnej diagnostiky a prediktívne potenciál Zic1
hypermetylace v plazme pacientov GC. Merali sme stav promotér metylácie Zic1
v plazme u pacientov s GC alebo gin s normálnou kontrola (NC) predmetov. Združenie Zic1
promotér metylácie s klinicko-parametrov bola tiež hodnotená. Okrem toho sme klasifikovaný vysoko kvalitné IN a T1 GC ako EGC a umiestnil pacientov GC a Gin v GC a v skupine (GPI). Potom Analyzovali sme Zic1
hypermetylace ceny v oboch EGC a GPI skupín. Ďalej kombinované vyhodnotenie antigénu karcinogénnych-embryonálny (CEA) úroveň a Zic1
promotér metylácie pre GC diagnózy bola hodnotená pomocou plazmy od pacientov GC a ginu.

Materiály a metódy

Klinické vzorky

vzorky plazmy boli získané pred operáciou na sira Run Run Shaw nemocnice v Hangzhou, Zhejiang, Čína, od novembra 2012 do apríla 2015. Všetci pacienti súčasťou našej štúdie podstúpilo gastroendoscopy a boli zoskupené podľa histopathology diagnózy. Vzorky plazmy boli odobraté z GC a Gin pacientov, ktorí boli naivní, aby liečebných procedúr, ako je napríklad chemoterapia, rádioterapia a chirurgické resekciu. Kritériá pre vylúčenie žalúdočných a črevných ochorení s inými príčinami a ochorení v iných orgánoch. boli tiež vylúčení pacienti s žalúdočnej metastáz z iných nádorov.

číslované sme vzorky podľa poradia, v akom boli zhromaždené a následne vykonanej metylácie špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (MSP) s cieľom posúdiť vzoriek v číselnom poradí. Vzorky boli ďalej rozdelené do skupín podľa výsledkov patológie. Vzorky plazmy boli odobraté zo 104 pacientov GC s priemerným vekom 59,8 rokov, ktorí boli diagnostikovaní podľa kritérií Svetovej zdravotníckej organizácie [16]. Päťdesiat pacientov GIN s priemerným vekom 58,0 rokov boli diagnostikované gastroskopia. Krvné vzorky boli takisto odobraté od 20 zdravých dobrovoľníkov v skupine NC s priemerným vekom 38,5 rokov.

Ethics vyhlásenie

Náš projekt získal súhlas od Clinical etickou komisiou Výskumného ústavu gastroenterológie Zhejiang University. Písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta pred odberom vzorky. Jednotlivci, ktorí sa podieľali na tejto štúdii dal písomný informovaný súhlas (ako je uvedené v PLoS
žiaka) zverejňovať tieto skriňové prvky.

Izolácia DNA a hydrogensiričitan modifikácie

DNA bola extrahovaná zo vzoriek plazmy s použitím QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). Koncentrácia DNA bola meraná spektroskopiou pri vlnovej dĺžke 260 nm. DNA sa bisulfitového ošetrí Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Modifikovaná DNA bola skladovaná pri teplote -20 ° C až do použitia.

MSP testy

Zic1
metylácie promótorom bol skúmaný prevedením MSP analýzu s použitím vyššie uvedenej bisulfitového modifikovaný bez plazmové DNA ako templátu. MSP bola vykonávaná po dobu 40 cyklov pri teplote nasadaní 56 ° C, ako bolo opísané skôr [14]. Primery metylácie špecifické boli ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) a ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG), a nemethylované špecifické primery boli ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) a ZIC1-UR (5'- CCCATTAACCACATTAAACA). Protokol PCR zahrnuté počiatočné denaturácia pri 95 ° C počas 10 minút, nasleduje 40 cyklov denaturácie pri 95 ° C počas 30 s, Annealing pri 56 ° C počas 40 s, extenzia priméru pri 72 ° C počas 40 s, a konečné predĺženie pri 72 ° C počas 7 minút. Produkty PCR boli podrobené elektroforéze na 1,5% agarosovém gélu, zafarbené Gél Red, a vizualizované pomocou UV osvetlenia.

Serum CEA testovanie

Vzorky séra boli zaslané do klinickej laboratóriu sira Run Run Shaw nemocnice pre testovanie, a koncentrácia CEA z > 5 ng /ml boli považované za normálne.

štatistickej analýzy

metylácie frekvencie a hladiny CEA vo vzorkách plazmy boli porovnané s použitím Fisherovho exaktného testu. Asociácie medzi klinicko-charakteristikami a DNA hypermetylace bola analyzovaná pomocou testu chí-kvadrát. Diagnostická hodnota kombinácie Zic1
metylácie promótorom a plazmatické hladiny CEA bola hodnotená podľa plochy pod prijímačom prevádzkové charakteristiky krivkou (AUC). Senzitivita, špecificita a pozitívne a negatívne prediktívne hodnoty pre patologické diagnózy boli vypočítané pri 95% intervaly spoľahlivosti pre Zic1
promótor metylácie alebo Zic1
metylácie promótorom v kombinácii s úrovňou CEA. Boli vypočítané tiež kladné aj záporné pomery pravdepodobnosti. Pre všetky testy, ktorých hodnota cut-off p < 0,05 bola použitá pre stanovenie štatistickej významnosti. Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS 19.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL).

Výsledky

Stav metylácie v plazmovom

Aby bolo možné hodnotenie zmien v Zic1
promotér metylácie v GC, sme sa prvýkrát zistený stav metylácie tohto promotora 104 pacientov s GC, 50 s gin, 31 s EGC a 20 NCS a vykonáva porovnanie medzi skupinami. Metylácia miery Zic1
promótor vo vzorkách plazmy boli v skupine NC (0%) 0%, čo zvyšuje na 54,0% v skupine gin a na 60,6% v skupine GC (p 0,001 pre gin a GC verzus NC), so 100% špecificitou pre diagnózu GPI (20/20) (obrázok 1). Pozitívne a negatívne prediktívne hodnoty a kladné a záporné pomery pravdepodobnosti pre diagnostiku IN a GC bola 100% (90/90), 23,8% (20/84), nekonečný a 0,42, resp. Výsledky zástupca MSP test na Zic1
promotér metylácie sú znázornené na obrázku 2.

Združenie klinicko-funkcií s Zic1
promótor metylácie v plazme GC pacientov

sme potom korelované s klinicko-patologické rysy s Zic1
promotér sadzba metylácie v plazme pacientov GC pre identifikáciu akýchkoľvek asociácie. Výsledky odhalili žiadne výrazné súvislosti medzi Zic1
promotér metylácie rýchlosť a klinické parametre, vrátane veľkosti nádoru, diferenciácie stupňa, stavu lymfatických uzlín, hĺbka invázie nádoru a TNM štádiu (p > 0,05) (tabuľka 1) .

Kombinovaná stanovenie Zic1
hypermetylace a hladina CEA

význam kombinované určenie Zic1
hypermetylace rýchlosť a hladina CEA pre bol analyzovaný diagnostika a včasná predikcie GC. Merali sme hladinu CEA v 9 NCS, 24 pacientov gin a 71 GC pacientov pred liečbou. Citlivosti úrovne CEA v skupinách GC, IN, a EGC bolo 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) a 10,5% (2/19), v uvedenom poradí. Vo všetkých 3 skupín, citlivosť Zic1
metylácie promótorom bola významne vyššia než hladiny CEA (p menšie ako 0,05).

Kombinovaná Stanovenie Zic1
hypermetylace a hladina CEA v GC skupine.

v GC skupine, citlivosti a špecifickosti kombinované určenie Zic1
promotér metylácie rýchlosti a hladiny CEA (skúšanie tandemovou) boli 16,9 % a 90,9%, v danom poradí (tabuľka 2). Citlivosť kombinovanej analýze týchto dvoch parametrov (paralelné vyšetrenie) bola 69,0% (tabuľka 2), ktorá bola vyššia ako citlivosti dosiahnuté pri testovaní buď samotného parametra. Analýza ROC krivky bola vykonaná posúdiť význam metylácie DNA rýchlosti a úrovne CEA pre GC diagnózu. AUC Zic1
testovanie promotér metylácie sám bol 0,610 (S1 obrázok), a že pre kombinovanú posúdenie Zic1
promotér metylácie a hladiny CEA (skúšanie tandemovou) bol 0,539 (S2 obr) , A to najmä, ak je Zic1
metylácie promótorom a úroveň CEA boli testované paralelne sa AUC zvýšila na 0,633 (obrázok 3). Na základe vyššie uvedených výsledkov na základe, kombinované určenie bolo zistené, že sú synergické v porovnaní s použitím samotného každej metódy Zic1
metylácie promótorom rýchlosť a úroveň CEA (paralelné testovanie) pre GC diagnózu.

kombinované stanovenie Zic1
hypermetylace a hladina CEA v skupine GPI.

v skupine GPI, citlivosti a špecifickosti kombinované určenie Zic1
promótor miery metylácie a hladina CEA (testovanie tandem) bol 15,8% a 100,0%, v danom poradí (tabuľka 3). Kombinovaná vyhodnotenie týchto dvoch parametrov (paralelné testovanie) mali najvyššiu citlivosť na 65,3%, s pozitívne prediktívne hodnotou a dosahuje 98,4% (tabuľka 3). Analýza ROC krivky bola vykonaná posúdiť význam metylácie DNA rýchlosti a úrovne CEA pre GPI diagnózu. AUC Zic1
testovanie promotér metylácie sám bol 0,792 (S3 obrázok), a že pre kombinovanú posúdenie Zic1
promotér metylácie rýchlosť a hladina CEA (paralelné testovanie) bola 0,771 (obr 4). Z tohto dôvodu, detekcia Zic1
metylácie promótorom môže byť účinnejšia alternatívou pre diagnostiku GPI.

Diskusia

V poslednej dobe bolo zistené, že mnoho génov, ktoré majú byť methyluje v tkanivách GC vrátane E-cadherin
RASSF1A
p16
GSTP1
SOCS1
SFRP1
a Ptení
[17]. Uvádzané metylácie frekvencie sa pohybovali od 56% do 96% [17]. Metylácie DNA bola tiež pozorovaná vo vzorkách krvi od pacientov s GC. Bolo zistené, že niekoľko ZTS sa methyluje vo vzorkách krvi od pacientov GC, vrátane p16
E-cadherin stroje a RAR
, s detekciou sadzby vo výške 37% na 48%, respektíve [18-21].

Zic1
je aberantne downregulated u určitých typov rakoviny, ktoré svedčia o jeho funkciu ako ZTS. Naše predchádzajúce práce bolo zistené, že Zic1
promótor je často methyluje v primárnych rakovinových tkanivách žalúdka, s vysokou mierou detekcie 94,6%, ale nie v normálnej žalúdočnej tkanive [14]. Naše výsledky ukázali, že Zic1
je nový kandidát TSG, ktorá je downregulated cez promótor hypermetylace v GC. Avšak, na nášho najlepšieho vedomia, žiadne štúdie skúmali plazma Zic1
promotér metylácie v GC alebo ginu.

V tejto štúdii sme prvýkrát preukázali, že aberantne metylácie Zic1
promótor by mohol byť detekovaný v plazme z GC a Gin pacientov pri frekvencii 60,6% a 54,0%, v danom poradí, ktoré boli významne vyššie ako u NCS. Tieto výsledky sú v súlade s tými predchádzajúcimi štúdiami [14]. Z diagnostického hľadiska, Zic1
metylácie promótorom vykazovali vysokú špecificitu pre rozlíšenie NCS z GC a Gin pacientov (100%). Naše výsledky tiež ukázali, že detekcia Zic1
metylácie promótorom rýchlosť mala vysokú pozitívnu prediktívnu hodnotu a pozitívne pravdepodobnosti pomer a AUC pre GC a Gin diagnózy, čo naznačuje, že Zic1
posúdenie metylácie promótorom má potenciál nástroj pre diagnózu a skoré predikciu GC.

Mnoho predchádzajúce štúdie sa zamerala na krv metylácie DNA periférnej oblasti GC skôr než u pacientov, gin, len hŕstka štúdií zameraných na metylácie DNA v ginu. Vývoj endoskopických techník umožnilo dostupnosti účinnejších a menej invazívne liečby EGC a Gin pacientov. Celkovo možno povedať, skríning pre gin prispieva k monitorovaniu GC a znižovanie počtu úmrtí GC účely. Jeden zaujímavý aspekt tejto štúdie je to, že sme ukázali aberantne Zic1
metylácie promótorom v plazme u pacientov Gin, pričom miera detekcie, ktorá bola významne vyššia ako u NC jedincov (p 0,001). V budúcnosti, detekcia hypermetylace na Zic1
promotér by mohli byť použité ako skorá varovný signál alebo na skríning GC u vysoko rizikových skupín.

Tiež sme hodnotené Zic1
metylácie promótorom v plazme pacientov GC v spojení s rôznymi klinicko parametrami. Nebol nájdený štatisticky významný vzťah medzi Zic1
promotér metylácie a rôzne klinické parametre, vrátane veľkosti nádoru, diferenciácie stupňa, stavu lymfatických uzlín, hĺbka invázie nádoru a TNM štádiu; Avšak v našej predchádzajúcej štúdii [15], Bolo zistené, Zic1
metylácie byť zapojený do GC invazivitě. V tejto štúdii väčšina pacientov GC boli diagnostikované a liečené v ranom štádiu, čo môže mať vplyv na konečné výsledky. Overenie vo väčšej populácii by mohla poskytnúť vhľad do týchto odlišných výsledkov. Či existuje korelácia medzi úchylné Zic1
promotér metylácie a GC klinické charakteristiky vyžaduje objasnenie zo strany ďalšiu analýzu.

CEA je klasický nádorový marker, ktorý sa bežne hodnotená v klinickej praxi. Táto značka je považovaná za najčastejšie prítomné u pacientov s neskorým GC; Avšak, mnoho štúdií ukázali, že metylácie DNA môže byť detekovaná začína v raných fázach GC. V našej štúdii, čo ROC krivka bola vytvorená zhodnotiť význam kombinovanej detekcie Zic1
promotér metylácie frekvencie a hladiny CEA (paralelné testovanie) pre diagnostiku GC, ukázať, že ich spoločný detekcie vyrobených viac významné výsledky, než detekciu samotného buď parametra. Preto navrhujeme, aby v kombinácii meraní Zic1
promotér metylácie frekvencie a hladiny CEA môže zvýšiť diagnózu GC.

Na záver, naše výsledky ukázali, že meranie Zic1
promotér metylácie v DNA z plazmy má význam pre včasnú detekciu GC a pre posudzovanie rizika v populácii s vysokým rizikom. Kombinované meranie Zic1
promotér metylácie frekvencie a hladiny CEA (paralelné skúšky) môže zvýšiť súčasné usmernenia pre včasnú diagnostiku GC; sú však potrebné ďalšie štúdie s väčšou veľkosti vzorky a klinické overenie.

Podporné informácie
S1 Obr. Detekcia vzoriek plazmy Zic1
promotér metylácie v rakovine žalúdka (GC).
An ROC krivku pre hodnotenie významu Zic1
testovanie promotér metylácie pre GC diagnózu.
Doi : 10,1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 obr. V kombinácii detekcie vzoriek plazmy Zic1
metylácie promótorom a (testovanie tandem) úroveň CEA u karcinómu žalúdka (GC).
An ROC krivku pre hodnotenie závažnosti kombinované detekciu dvoch parametrov (testovanie tandem .) GC diagnózu
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 obr. Detekcia vzoriek plazmy Zic1
promotér metylácie v žalúdočných intraepiteliálna neoplázia (GPI).
An ROC krivku pre hodnotenie závažnosti Zic1
testovanie metylácie promótor pre GPI diagnózu.
doi: 10,1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

• Ploche ONE: Regulačné B Cell funkcia je potlačená fajčenie a obezita v H. pylori-infikovaných pacientov a koreluje so zvýšeným rizikom rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: exosomatických miRNA z pobrušnice laváži ako potenciálnych prognostických biomarkerov peritoneálnej metastázy v rakoviny žalúdka