Ploche ONE: exosomatických miRNA z pobrušnice laváži ako potenciálnych prognostických biomarkerov peritoneálnej metastázy v rakoviny žalúdka

Abstract

Peritoneálna metastázy je najčastejším typom recidívy u pacientov s rakovinou žalúdka (GC) a je spojená so zlou prognózou. Peritoneálnej výplach cytológie, ktorý sa používa pre vyhodnotenie rizika peritoneálnej metastáz, má nízku citlivosť. Tu sme hodnotili diagnostický potenciál exosomatických miRNA profilov v peritoneálnej tekutiny pre predikciu peritoneálnej šírenie v GC. Celková RNA bola extrahovaná z exosomy izolovaných z šiestich žalúdočné malígnym ascitom (MA) vzoriek, 24 peritoneálnej výplach tekutiny (PLF) vzoriek, a kultivačných supernatantov (cm) z dvoch ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka, ktoré sa líšia v ich potenciálu pre peritoneálnej metastázy. Expresia exosomatických miRNA bola hodnotená s Agilent Human miRNA microarrays a kvantitatívne reverznej transkripcie PCR (QRT-PCR). Analýza microarray uvedené nízku variabilitu v počte a intenzite signálu miRNA zistených medzi vzorkami. V šiestich MA tekutín, MIR-21 vykazovali najvyššiu intenzitu signálu. Identifikovali sme päť miRNA (MIR-1225-5p, MIR-320C, MIR-1202, mier-1207-5p a mier-4270) s vysokou expresiu vo vzorkách mA PLF z seróza-invazívnej GC a CM štandardu A vysoko metastatický GC bunkové línie; sa tieto kandidátske Mirna druhy, ktoré majú byť v súvislosti s peritoneálnej šírenia. Diferenciálnej expresie MIR-21, MIR-320C, a mier-1225-5p bola overená v PLF z seróza-invazívne a neinvazívne GC QRT-PCR a mier-21 a mier-1225-5p bolo potvrdené, že je spojený s serózna invázie v GC. PLF môže byť použitý k profilu expresie exosomatických miRNA. Naše výsledky naznačujú, že mier-21 a mier-1225-5p môžu slúžiť ako biomarkery peritoneálnej recidívy po kuratívnej resekcii GC, tým poskytuje nový prístup k včasnej diagnóze peritoneálnej šírenie GC

Citácia :. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, M Yashiro, Hirakawa K, et al. (2015) exosomatických miRNA z pobrušnice laváži ako potenciálnych prognostických biomarkerov peritoneálnej metastázy v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10,1371 /journal.pone.0130472

Editor: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, Spojené štáty americké

Prijaté: 1. februára 2015; Prijaté: 20.mája 2015; Uverejnené: 24.července 2015

Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

financovania: .. autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

mikroRNA (miRNA) sú malé (19-23 nukleotidov) nekódujúca RNA, ktoré fungujú ako post-transkripčný regulátory génovej expresie a hrajú dôležitú úlohu pri kontrole mnohých biologických procesov, vrátane diferenciácie buniek, proliferácie a apoptózy [1]. Mierny bolo preukázané, že majú onkogénne alebo nádoru potláčajúce aktivitu, a deregulovaný expresiu mnohých druhov miRNA bola zistená v niekoľkých nádorov, čo naznačuje potenciálne aplikácie miRNA ako biomarkery progresia rakoviny a metastáz [2-5].

miRNA sú balené do sekrečnej mikrovesikly (napr exosomy, apoptotických teliesok a prelievanie mikrovesikly), ktorý štít miRNA pred degradáciou RNázy a slúži ako vozidlá pre sekréciu miRNA do extracelulárneho priestoru a telových tekutín. Exosomy sú malé membránové vačky, ktoré sú zapojené do bunkovej imunitnej odpovede; Avšak v poslednej dobe sa stalo zrejmým, že exosomy obsahujú podstatné množstvo RNA a môžu byť zapojené do imunitne nezávislé regulačné mechanizmy. Podstata vynálezu Teraz bolo zistené, že môže vykonávať exosomy medzibunkový prenos miRNA, a podieľa sa tak na základe miRNA-signálnych mechanizmov [6]. Ďalej bolo zistené, vyššie hladiny exosomy miRNA obsahujúce v plazme pacientov s rakovinou, ako v tom, že u zdravých jedincov [7], čo naznačuje, že exozom báze sekrécia miRNA sa podieľa na vzniku rakoviny. Analýza aberantne expresie miRNA v sére, sliny, výkaly a moč bola použitá pre včasnú detekciu B-bunkového lymfómu, a ústne, črevné alebo typy nádorov močového mechúra [8-11].

Karcinóm žalúdka (GC) je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu spojených s celosvetovo [12]. Peritoneum je najčastejší miesto metastáz a opakovania GC, a malígny ascites (MA), spôsobené peritoneálnej šírenie rakovinových buniek, boli spojené so zlou prognózou. V súčasnej dobe nie sú k dispozícii žiadne spoľahlivé ukazovatele pre rozvoj zhubných peritoneálnej ascitu u pacientov s GC. exosomy miRNA obsahujúce predstavujú nový mechanizmus intercelulárnej signalizácie a môže priniesť vhľad do životného prostredia, ktoré umožňuje šírenie rakoviny v peritoneu [13].

V tejto štúdii, exosomy boli izolované z MA a pri operácii peritoneálnej laváži (PLF) vzoriek získaných od pacientov s GC, a kultivačné médium (CM), vysoko invazívnych peritoneálnych bunkových línií a miRNA potom boli extrahované z týchto vzoriek. Kvalita extrahované exosomatických miRNA a konzistencia miRNA expresných vzorov boli overené. Mirna profily expresie v MA, PLF a vzorky CM boli porovnané a boli identifikované kandidátne miRNA v súvislosti s peritoneálnej šírenia GC.

materiáloch a metódach

Pacienti

Všetci pacienti alebo ich opatrovníci za predpokladu, písomný informovaný súhlas. Štúdia bola schválená etickou komisiou Jokohama City University Hospital (Schválenie č A110127001).

MA a peroperačný PLF vzorky boli odobraté od pacientov GC s klinicko vlastnosťami uvedenými v tabuľke 1. Všetci pacienti boli predtým diagnostikovaná GC podľa histopatologické analýzy bioptických vzorkách odobratých z primárnych lézií a šiestich pacientov MA bol diagnostikovaný na prítomnosť ascitu od brucha vypočítaná tomografia (CT). Ascites boli tiež analyzované pomocou cytológie a všetky boli potvrdené ako pozitívne pre malígne ochorenie patológov; Zvyšné vzorky MA boli použité pre izoláciu miRNA. PLF bol intrao- zhromaždené z 24 GC pacientov (tabuľka 1). Po laparotómii, 100 ml fyziologického roztoku sa vleje do vaku z Douglas a peritoneálnej výplach vodou bolo odobratých pred chirurgickou resekciou nádoru. PLF bola analyzovaná pomocou cytológie a použité pre izoláciu miRNA. Medzi 24 PLF vzoriek, šesť boli testované za použitia miRNA microarray a 18 boli analyzované pomocou qPCR.

Bunková kultúra

Bunková línia OCUM-2M vznikla z primárneho nádoru scirrhous karcinómu žalúdka a bunková línia OCUM-2MD3 bol odvodený od OCUM-2M buniek s vysokým potenciálom pre peritoneálnej šírenie u nahých myší [14]. Bunky boli kultivované v Eaglovho média Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY) doplnenom 10% tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (FBS) a antibiotikum-antimykotikum pri teplote 37 ° C v 5% CO _{2 s inkubátor. Pre získanie buniek CM, OCUM-2M a OCUM-2MD3 bunky boli trikrát premyté DMEM bez séra doplnenom antibiotikami-antimykotikum a inkubujú sa v rovnakom médiu po dobu 48 hodín.}

Izolácia exosomy

Vzorky na izoláciu exozom boli pripravené, ako bolo opísané skôr [15]. Odstrániť veľké bunkové častice a zvyšky buniek, MA, PLF a CM boli centrifugovány pri 2000 × g
počas 15 minút pri teplote 4 ° C a prefiltruje cez 0,22 um filter (Millipore, Billerica, MA). Supernatant bol skladovaný pri -80 ° C až do použitia pri extrakcii miRNA.

Na vyzrážanie exosomy, vzorky boli odstredené pri 110,000 × g
dobu 70 minút pri 4 ° C. Exozom peleta sa premyje 11 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom (PBS) a opäť sa odstredí, ako je popísané. Peleta bola použitá na extrakciu RNA.

Celková extrakcie RNA a analýza

Celková RNA bola extrahovaná z exosomy za použitia kitu miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu a bola potom uložená pri -80 ° C až do ďalšej analýzy.

kvalita, koncentrácia a veľkosť celkovej exosomatických RNA bola hodnotená za použitia Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Pred analýzou, celková RNA bola pripravená s použitím Agilent RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies) podľa protokolu výrobcu.

miRNA microarray

miRNA získané z šiestich MA, šesť PLF, a dve vzorky CM boli analyzované za použitia Agilent Human miRNA microarrays (Agilent Technologies), ktoré obsahujú 1,226 ľudskej miRNA a 146 ľudskej vírusovej miRNA. Pre detekciu miRNA, 100 ng RNA bola označená a hybridizována za použitia súpravy Human miRNA microarray (rel 16,0; Agilent Technologies) podľa protokolu výrobcu (miRNA Kompletné označenie obalu a Hyb kit pre miRNA Microarray System). Hybridizácia signály boli detekované s G2505C DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) a naskenovaných obrazov boli analyzované pomocou Agilent Feature Extraction Software (v. 10.7.3.1). Analýza dát bola vykonaná s použitím Agilent GeneSpring GX softvér v. 11.0.2. (Log _{2 transformácie). Základná transformácia nebola vykonaná.}

Kvalita extrakcie miRNA bola analyzovaná podľa variability počtu microarray-detekovaný druhov miRNA, intenzita signálu, a korelácia miRNA expresie u vzoriek podľa priemer ± SD, variačný koeficient (CV) a korelačný koeficient (CC).

Voľba peritoneálnej metastázy špecifických miRNA

boli analyzované profilov expresie exosomatických miRNA vybrať miRNA, ktoré sú špecifické pre GC peritoneálnej šírenie pomocou nasledujúcej postupnou prístup. Krok 1: Mirna profily v CM z vysoko metastatických peritoneálnej OCUM-2MD3 buniek boli porovnané s tými, z rodičovských bez metastáz OCUM-2M buniek, a rozdielne exprimované miRNA (stredná násobok-zmenu, zlúčenina, 2) boli vybrané <. br>

Krok 2: šesť PLF vzorky boli rozdelené do dvoch skupín: T4 (n = 4) a T1-T3 (n = 2), v závislosti na štádiu rakoviny podľa veľkosti a rozšírenie nádoru (UICC-AJCC, 7 ^{ročník). Stupeň T4 GC sa vyznačuje najvyššou frekvenciou peritoneálnych metastáz v porovnaní s inými fázami [16]. Tieto miRNA profily expresie T4 skupiny boli porovnané s tými, skupiny T1-T3 a odlišne exprimovaných miRNA (stredná násobok-zmenu, zlúčenina, 2) boli vybrané}

Krok 3 :. Vybrané miRNA, ktoré boli spoločné oba kroky a, ktoré boli vyjadrené v MA sa ďalej filtruje podľa intenzity signálu. Tí s hodnotami intenzity viac ako log _{2 10 do MA a PLF boli vybrané ako kandidátskej miRNA v súvislosti s peritoneálnej metastázy; MIR-21 vykazovali najvyššiu priemernú intenzitu signálu medzi vzorkami MA. Diferenciálnej expresie miRNA druhov vybraný v kroku 3 bola overená v zostávajúcich 18 vzoriek PLF podľa QRT-PCR.}

Kvantitatívna analýza peritoneálnej metastázy špecifické miRNA expresie QRT-PCR

TaqMan microRNA skúšky (Life Technologies) boli použité na kvantifikáciu relatívnych hladín expresie MIR-21 (test ID. 000397), mier-320C (test ID. 241053_mat), mier-1225-5p (test ID. 002764), a mier-16 (test ID. 000391). Reverzný transkripcie bola vykonaná s použitím TaqMan miRNA RT Kit (Life Technologies) za nasledujúcich podmienok: 30 min pri 16 ° C, 30 min pri 42 ° C a 5 minút pri teplote 85 ° C. PCR bola vykonaná v 96-jamkových doštičkách za použitia 7500 real time PCR System (Life Technologies); Všetky reakcie boli vykonané v troch opakovaniach. Hladiny expresie cieľových miRNA boli normalizované k tomu MIR-16, ktorý bol použitý ako stabilne vyjadrené kontroly [17]. Pri analýze našich dát microarray z exosomatických miRNA v nádorových vzorkách ascites, MIR-16 predstavil najmenší variačný koeficient (CV = 4%) medzi vnútornými normami kandidátskych vrátane MIR-638 (CV = 8%), Let-7 a (CV = 8%), a 142-3p (CV = 23%).

Štatistická analýza

Spojité premenné boli porovnané s použitím Študent je t
-test. Ak je to nutné, t
-test bol upravený tak, aby porovnať nerovné odchýlky. Rozdiel medzi kategorické premenné bola hodnotená pomocou Fisherovho exaktného testu. Korelácia medzi dvoma premennými bol hodnotený za použitia Pearsonovho korelačného koeficientu. Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri P < 0.05. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou softwaru SPSS 21.0 pre Windows (IBM, Armonk, NY).

Výsledky

Kvantitatívna analýza extrahované RNA exosomatických

Celková RNA bola extrahovaná z exosomy izolovaných z MA, intraoperačnej PLF a buniek CM. Stredná koncentrácia extrahovaného exosomatických RNA bola 4,4 ng /ul (v rozmedzí od 1,2 do 6,1 ng /ul) pre MA a 6,4 ng /ul (1,7 až 16,4 ng /ul) pre PLF. Elektroferogramy odhalila veľký podiel malých druhov RNA prítomných v celej CM a klinických vzorkách, zatiaľ čo žiadna alebo len veľmi malá kontaminácia 18S a 28S ribozomálnej RNA (bez zreteľných píkov na zodpovedajúci molekulovej hmotnosti) bola pozorovaná (Obrázok 1).

Výkon miRNA microarrays

Ak chcete vyskúšať expresie exosomatických miRNA microarrays v každej skupine vzoriek, sme sa zaoberali počet detekovaných miRNA, percentil intenzity signálu, počet zachytených bežne miRNA a koreláciu miRNA expresie medzi skupinami. Počty miRNA druhov zistených v každej skupine čipu je znázornený na obr 2. V šesť MA a šiestich PLF vzoriek, to znamená čísla boli 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) a 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), v danom poradí. V každej skupine, variabilita v počte zistených miRNA medzi vzorkami bola nízka

rozdelenie intenzity signálu pre každú skupinu je prezentovaná na obr. 3; to ukazuje, spracované signály normalizované na 25, 50, 75, a 90 ^{percentilom v každej skupine. V 50 percentilu, log _{2 relatívne intenzity signálu pre MA (obr 3-1) a PLF (obr 3 a 2) vzorky a medzi troch skupín (MA, PLF a CM, obor 3 a 4) boli 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%) a 4,97 ± SD (CV = 5,24%), v danom poradí. Variabilita intenzity signálu medzi vzorkami v každej skupine, rovnako ako medzi skupinami bola nízka.}}

Počty miRNA spoločné medzi vzorkami v skupinách MA, PLF a CM boli 327, 263 a 354 , v uvedenom poradí, zatiaľ čo to bolo 194 pre tri skupiny (obrázok 4).

Tabuľka 2 ukazuje koreláciu expresie miRNA medzi každé dve vzorky. Najvyššie a najnižšie CC hodnoty boli 0,94 a 0,68, v uvedenom poradí; priemer CC všetkých vzoriek bol 0,79 (CV = 8,86%). V MA, PLF a CM skupiny, priemerné hodnoty CC boli 0,85, 0,88 a 0,90, respektíve a variabilitu v expresných profilov pre každú skupinu bola nízka.

Výber kandidátskych miRNA v súvislosti s peritoneálnej šírenia

k dnešnému dňu žiadne údaje boli k dispozícii na expresných profilov miRNA exosomatických spojených s peritoneálnej šírenia, z dôvodu nedostupnosti normálnych ascitických tekutín, proti ktorej porovnať MA expresné profily. Vybrali sme miRNA v súvislosti s peritoneálnej šírenie pomocou prístupu krok-múdry. Počet miRNA bežne zachytených v šiestich MA vzoriek bol 327. v krokoch 1 a 2, 140 a 118 metastázy špecifické miRNA boli vybrané v cm a PLF skupín, resp. Z týchto 327, 140 a 118 miRNA, päť miRNA boli vybrané ako kandidáti spojené s peritoneálnej šírenia (obrázok 5). Dve z nich (Mir-1225-5p a mier-320C) a mier-21 s najvyššou intenzitou signálu medzi MA špecifické miRNA boli overené ako sú rozdielne exprimované v 18 vzorkách PLF, pomocou qPCR (tabuľka 3).

Validation kandidátske miRNA expresie qPCR

Osemnásť PLF vzorky boli rozdelené do dvoch skupín v závislosti na metastatické fáze, T4 (dierované blany, n = 9) a T1-T3 (subserosa alebo menej, n = 9), a expresie MIR-21, MIR-320C, a mier-1225-5p bola analyzovaná pomocou QRT-PCR. Obrázok 5 ukazuje, že hladiny Mir-21 a mier-1225-5p u pacientov s T4-fáze GC boli významne zvýšil v porovnaní s tými, u pacientov T1-T3 (Mir-21, P = 0,027, a mier-1225-5p, P = 0,008, obr 5). Rozdiel v Mir-320C expresie medzi dvoma skupinami pacientov bol nesignifikantné (P = 0,928, obr 6).

Ďalej bola skúmaná korelácia medzi hladinami miRNA a klinické pozadia pacientov GC (tabuľka 4). Mir-21 a mier-1225-5p expresie bola významne vyššia u pacientov s rakovinou T4 fáze, než je v T1-T3-fáze u pacientov (p = 0,015). Žiadna významná korelácia bola zistená medzi miRNA expresie a ďalších klinických parametrov.

Diskusia

V tejto štúdii sme skúmali, prvýkrát, je obsah miRNA z exosomy izolovaných z MA a PLF GC pacientov. Naša štúdia ukazuje, že exosomatických miRNA môžu byť sústavne extrahovať z MA a PLF a že miRNA profily expresie môže indikovať stav pobrušnice u pacientov s GC.

Prognóza GC s serózna inváziou zostáva chudobná i po R0 resekcii, pretože vysoká miera recidívy, najmä peritoneálnej metastázy (PM) [18]. PM v GC je najzložitejšie typ opakovaní, pretože je ťažké predpovedať, rovnako ako k diagnostike. Aj keď ascites je najčastejším symptómom PM, mnoho pacientov s GC PM nevyvinú ascites. Medzi zobrazovacích diagnostických metód založených na vysokorýchlostnom špirálové CT je široko používaný pre posúdenie predoperačného stagingu GC a post-terapeutické sledovanie; Avšak, v prípade PM jeho diagnostickú presnosť je nedostatočná, najmä z dôvodu nízkej citlivosti [19]. Pomocou PET-CT vyšetrenie pre diagnostiku PM v GC je sporná, pretože bolo popísané, že FDG PET má zlú citlivosť pre detekciu PM v GC [20]. PLF sa stal ďalším cieľom pre diagnostiku a predikciu hodín v GC. Cytologické vyšetrenie počas operácie zhromažďujú PLF je použitá pre predikciu peritoneálnej recidívy [21] a používa sa pre GC stagingu v Japonsku [22]. Avšak, niektoré bádatelia uvádzajú, že PLF cytológie nevykazuje citlivosť požadovanú pre predpovede a detekciu PM [21], a navrhol použitie molekulárnych diagnostických metód, ako je RT-PCR, pre detekciu mikro-metastáz PLF. V multicentrickej prospektívnej štúdii, mRNA expresie génov kódujúcich karcinoembryonální antigén (CEA) a cytokeratin 20 (CK-20), vyhodnocuje pomocou RT-PCR, sa ukázala byť užitočné pre predikciu celkové prežitie a PM v GC [23] , Nevýhodou diagnostických metód mRNA založených je vysoká degradovateľnosť mRNA v priebehu chirurgických zákrokov.

Na rozdiel od toho miRNA uzavreté v exosomy zostať stabilné a môže cirkulovať v telesných tekutinách, ako je napríklad sérum, plazmu , sliny, moč, materské mlieko, a slzy, na dlhú dobu [24, 25]; exosomy boli tiež izolované z MA u rakoviny vaječníkov [26].

Podľa nášho najlepšieho vedomia, tam bol žiadna správa o exosomatických miRNA izolovaných z PLF pacientov GC. Levänen et al. zhromažďované exosomy z tekutine získanej bronchoalveolárnej lavážou a analyzované exosomatických miRNA vyjadrenie na zistenie alergie spojené s druhmi miRNA [27]. Liu et al. uvádzajú, že exosomy izolované z cervikovaginální laváži obsahovali vysoké hladiny MIR-21, ktoré by mohli byť použité ako biomarkeru rakoviny krčka maternice [28]. Tu sme analyzovali profilov expresie exosomatických miRNA v PLF GC pacientom microarray technológie miRNA s cieľom identifikovať kandidátne diagnostické miRNA biomarkerov pre predikciu metastáz v GC.

V našom vyšetrovaní, prvé úlohou ležal v kvantitatívnej izolácii exosomatických miRNA z PLF. Weber et al. hodnotená miRNA expresie v 12 telových tekutinách, a uvádzajú, že celková koncentrácia RNA v peritoneálnej kvapaline bola 775 ug /L [25], ktorý bol menší ako sme získali z MA a PLF-4400 a 6400 ug /l, respektíve na dôvod rozdiel môže byť metóda použitá na izoláciu celkovej RNA, pretože Weber et al. priamo extrahuje RNA z peritoneálnej tekutiny, zatiaľ čo my prvýkrát izolovaný exosomy a potom používa tieto na extrakciu RNA. Analýza kvality RNA, izolovanej z PLF preukázala množstvo malé (menej ako 200 nt) RNA druhov v CM a MA. Neboli zistené žiadne zreteľné 18S a 28S ribozomálnej RNA vrcholy v príprave, čo indikuje neprítomnosť kontaminácie vnútrobunkovej RNA.

Druhým problémom stretol v tejto štúdie bolo zapojených konzistencie v kvalite exosomatických miRNA izolovaný. V našej štúdii sme pozorovali nízku variabilitu v počte zistených druhov miRNA a intenzity signálu miRNA, a vysokú koreláciu expresie miRNA medzi vzoriek v každej skupine. Priemerné počty zistiteľných miRNA v RO a PLF boli 490 a 367, čo bolo v súlade s počtom miRNA (397) vopred zisteného v peritoneálnej tekutine [25].

PLF a vzorky MA vykazovali nízku variabilitu intenzita signálu (CV = 3,87% pre 50 ^{percentil). Okrem toho, miRNA expresné vzory boli vysoko korelované medzi vzorkami v každej skupine (CC > 0,850), ako aj medzi skupinami (0,8 > CC > 0,7). Tieto výsledky ukazujú, že PLF môže byť zdrojom s vysokým výťažkom kvalitné miRNA, ktoré ukazujú konzistentné expresné vzory v teste Microarray.}

profily expresie miRNA boli analyzované pre výber miRNA špecifických pre peritoneálnej metastázy. MIR-21 vykazovali vyššiu expresiu u pacientov s T4 fáze karcinómu ako u pacientov v skupine T1-T3. Fabbri et al. uvádzajú, že mier-21 a mier-29a v rakovinových-povolený exosomy ovplyvnený rast nádoru a šíriť prostredníctvom väzby na a aktivácia TLR v okolí imunitných buniek a indukciu prometastatic zápalovú reakciu [29]; Tento podporil názor, že exosomy nádorové odvodené od prispievať k premetastatic mikroprostredie [30, 31]. To môže znamenať, že T4 exosomy karcinómu odvodený vytvoriť premetastatic medzeru na pobrušnice, ktorý potom podporuje peritoneálnej inváziu po kuratívnu resekcii GC.

Použitie prístup krok-múdry, sme vybrali päť exosomatických miRNA (MIR-320C MIR-1202, MIR-1225-5p, mier-1207-5p a mier-7270) a overené Mir-320 a miR1225-5p výraz v PLF 18 pacientov CG pomocou QRT-PCR. Mir-1225-5p vykazovali vyššiu expresiu v T4 než v T1-T3 pacientov fáza CG, čo potvrdzuje výsledky získané mikročipu, pričom nebol zistený žiadny rozdiel hladín MIR-320 medzi skupinami pacientov. Mir-1225 sa zameriava na gén polycystické ochorenie obličiek, PKD1
, ktorý je často zmutovaný v autozomálne dominantným ochorením polycystických obličiek; tak, miR1225 môže mať vplyv na priebeh tohto ochorenia [31]. Avšak, vzťah medzi Mir-1225 a rakovinou zostáva nejasný. Mir-21 a mier-1225-5p môže pripraviť premetastatic výklenok do pobrušnice pre šírenie a vysporiadanie rakovinových buniek, metastázujúce, a preto môže znamenať predispozíciu pre peritoneálnej recidívy po kuratívnu resekcii GC.

PLF poskytuje informáciu o stave pobrušnice, ako sú zmeny v populácii imunitných buniek a sekréciu rastových faktorov a cytokínov [32, 33]. Cytológie a molekulárnej diagnostické testy sú založené na detekciu nádorových buniek, zatiaľ čo profilovanie miRNA v PLF môže byť použitý pre predikciu peritoneálnymi premetastatic fenotypu v GC, zaisťujúce efektívne preventívnych a liečebných opatrení.

• Ploche ONE: Zic1 Promoter hypermetylace v plazme DNA je potenciálny biomarkerov pre rakoviny žalúdka a intraepiteliálna Neoplasia
• Ploche ONE: microRNA-206: Účinná inhibícia progresie karcinómu žalúdka prostredníctvom c-Met Pathway