Ploche ONE: microRNA-206: Účinná inhibícia progresie karcinómu žalúdka prostredníctvom c-Met Pathway

abstraktné

mikroRNA sú endogénne nukleotidov RNA s krátkym reťazcom, ktoré regulujú funkciu génu priamou väzbou cieľových mRNA. V tejto štúdii sme skúmali účinky mikroRNA-206 (MIR-206) o vývoji rakoviny žalúdka. Mir-206 sa prvýkrát potvrdené, že downregulated vo vzorkách s karcinómom žalúdka. Naopak, up-regulácia c-Met bola potvrdená vo vzorkách tkanív ľudského karcinómu žalúdka, s jeho úrovňou nepriamo úmerná MIR-206 expresie. Zavedenie MIR-206 inhibuje proliferáciu buniek indukciou G1 bunkového cyklu, rovnako ako migrácia a invázia. Okrem toho významné proliferácie a /alebo migrácie súvisiace molekuly, ako je c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt a p-EQF sa potvrdili byť downregulated analýzou Western blot. Zacielenie c-Met tiež priamo ovplyvnená proliferáciu AGS bunka, migrácie a invázie. In vivo
, MIR-206 exprimujúce nádorové bunky tiež zobrazená rast oneskorenie v porovnaní s nepostihnutých nádorových buniek. Naše výsledky ukazujú, že mier-206 potlačená c-Met expresiu v karcinómu žalúdka a môže fungovať ako silný nádorový supresor v c-Met zvýšene exprimujúcich nádorov. Inhibícia MIR-206 funkcia by mohla prispieť k aberantne bunkovej proliferácie a migrácie, čo vedie k rozvoju rakoviny žalúdka

Citácia :. Zheng Z, D Yan, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) microRNA-206: Účinná inhibícia progresie karcinómu žalúdka prostredníctvom c-Met dráhy. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

prijatá: 4. februára 2015; Prijaté: 01.5.2015; Uverejnené: 17.července 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto práca bola podporená čiastočne Národná prírodná Science Foundation of China Grant 81100671 (DY), provincia Zhejiang Natural Science Foundation of China Grant Y2110609 ( DY), a Wenzhou Science & Technológia Bureau Grant Y20080096 (DY). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu v spojení vo svete [1]. Jeho chorobnosť a úmrtnosť je obzvlášť viditeľný v ázijských krajinách v dôsledku rôznych vplyvov [1]. Vzhľadom k tomu, jej prezentácie je často spájaný s pokročilým ochorením, existuje naliehavá potreba pokroky v jeho odhalenie a nakoniec jeho riadenie. V súčasnej chápanie mikroRNA (miRNA) na ovplyvňovanie tvorby rakoviny žalúdka dochádza rýchlym tempom.

Od prvého opisu miRNA v hlísty C
. elegans
v roku 1993, vplyv týchto malých nekódovacích RNA prekročila viac pobočkami molekulárnej biológie [2]. Mierny sú vysoko tkanivovej špecifické biomarkery s potenciálom meniť a transformovať rezidentný tkanivo. Vzhľadom na to, že nadmerná expresia a pod expresie boli oba spojené s tumorigenezí [3], ich úloha ako onkogénov a supresorových génov nádoru sú obaja dobre zavedené [4, 5]. V priebehu posledných niekoľkých rokov, ich vplyv na vývoj a detekcie zhubných tumorov, vrátane rakoviny žalúdka sa pomaly objasnený. Už existuje niekoľko miRNA identifikovanej v karcinómu žalúdka anti proapoptotický mechanizmus, ako je Mir-21 a mier-148a [6, 7]. Ďalšie cesty ovplyvňované miRNA zahŕňajú progresiu bunkového cyklu, zahŕňajúce MIR-222/221, MIR-106b /93/25 a mier-24 [6, 7].

Jednou z ďalších sľubných nových miRNA na tuhé orgánu nádory patrí MIR-206 [8]. Tento konkrétny miRNA patrí do skupiny "myomiRs", ktoré sa podieľajú na rozvoji kostrového svalstva [9]. Potom, čo bola spojená rad ďalších ochorení, vrátane srdcových ochorení, chronickej obštrukčnej choroby pľúc a Alzheimerovej choroby, jej úloha v onkogenézy získal kontrolu v poslednej dobe, vrátane rabdomyosarkom, rakoviny pľúc, rakoviny hrubého čreva, schwannom, a rakoviny žalúdka [8, 9]. Hoci zvýšená v niekoľkých typov rakoviny, vrátane vaječníkov a Waldenströmova makroglobulinémia, mier-206 je väčšinou potlačený u zhubných tumorov [9]. MIR-206 Už skôr bolo preukázané, že inhibuje proliferáciu žalúdočné rakoviny čiastočne potlačením cyklin D2 [10]. V rámci tohto vyšetrovania sme sa zamerali na úlohu Mir-206 v žalúdku rakoviny onkogenézy prostredníctvom c-Met dráhy, ktorá bola tradične vplyvnú signalizačné dráhu pre onkogenézy v rôznych nádorov [11]. c-Met bol predpovedal a preukázané, že cieľový gén viac miRNA vrátane MIR-206 [9, 12].

Výsledky

Potlačenie MIR-206 viedlo k zvýšeniu c-Met expresia v karcinómu žalúdka

Real-time RT-PCR analýza bola vykonaná pre detekciu expresie Mir-206 v 40 vzorkách žalúdočných nádorových a normálnych tkanivách. Bolo zistené, hladiny MIR-206 vo väčšine vzoriek tkanív žalúdočné nádoru (34/40), aby sa výrazne nižšie ako normálne tkanive (obr 1A). MIR-206 expresia bola nepriamo úmerná úrovni c-Met pozorovala vo vzorkách nádorov (obr 1B). Väčšina vzoriek nádoru, so zníženou expresiou MIR-206, vykazovali vysoký podiel (viac ako 50%) c-Met farbenie. Naopak nádory s normálnou expresiou Mir-206 vykazovali veľmi slabý alebo negatívne expresiu c-Met.

MIR-206 indukovanú G1 zatknutie a množenia potlačený bunkovej migrácie a invázie AGS rakovinových buniek žalúdka

Ako MIR-206 expresie bol znížený vo vzorkách s karcinómom žalúdka, sme sa snažili zistiť, či zavedenie MIR-206 mal nejaký biologický účinok na AGS bunky. AGS buniek transfekciou molekulou MIR-206 vykazovali inhibíciu bunkového rastu v porovnaní s negatívnou kontrolou na základe testu MTS (obr 2A). FACS analýza buniek ukázala, G1 bunkového cyklu (Obr S1). Počet kolónií bol tiež redukuje transfekcia MIR-206 (obr S2).

MIR-206 môže inhibovať migráciu a inváziu buniek (AGS Obr 2B a obr S3). Dramatické zníženie migrácie smerom k dolnej komory bol pozorovaný v Mir-206 transfektovaných buniek AGS (86 ± 15 vs. 165 ± 16 v AGS bunkách, P
< 0,01, n = 3). Okrem toho bunky transfekované s Mir-206 ukazujú, že HGF-indukovanej invazívnosť bola tiež výrazne obmedzila nasledujúce MIR-206 transfekciu (57 ± 12 vs. 116 ± 14 v AGS bunkách, P
< 0,01, n = 3).

MIR-206 downregulated c-Met expresiu a proteíny ďalší bunkový cyklus podklady k

už skôr sme identifikovali c-Met ako priamy cieľ MIR-206 [9]. Western blot analýza potvrdila, že c-Met expresia bola znížená o MIR-206 transfekcia v AGS bunkách (obrázok 3). Súčasne mimomaternicové MIR-206 tiež down-regulovaná expresia CDK4, p-Rb, p-Akt a p-EQF.

znižujúce množstvo c-Met inhibuje množenie rakovinových buniek žalúdka, migrácie a invázie

Next, c-Met špecifické siRNA bol prvýkrát použitý k zníženiu expresie c-Met v bunkách AGS (S4 Obr). MTS testy boli vykonávané pre detekciu proliferácie buniek. AGS buniek transfekciou siRNA c-Met, vykázali zníženú rastu buniek v porovnaní s negatívnymi kontrolnými bunkami (obr 4A; 25.10 ± 3,81% zníženie). Ako HGF-indukovanej migrácie a invázie boli znížené pri porovnávaní c-Met siRNA transfekciou buniek s negatívnymi kontrolnými transfekciou buniek. Ako je uvedené na obrázku 4B a S5 na obr, zníženie migrácie (88 ± 10 vs. 155 ± 15, P < 0,01, n = 3) a invázie (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P < 0,01, n = 3) boli obaja štatisticky významné.

Zavedenie MIR-206 potlačený rast tumoru in vivo

Ďalej sme skúmali, či zvýšená expresia MIR-206 by mohla potlačiť rast nádoru in vivo
. Po 8 týždňoch od priemernej objemy nádorov boli významne nižšie z buniek infikovaných lentivirus exprimujúcich MIR-206, v porovnaní s kontrolou (obrázok 5).

Diskusia

Karcinóm žalúdka zostáva významný zdravotný starostlivosť záťaž na celom svete cez rokoch výskumu [1]. Podľa Svetovej zdravotníckej organizácie rakovina žalúdka zostáva jedným z najlepších rakovinou etiológie s vysokou mierou úmrtnosti [1]. Rovnako ako u iných zhubných tumorov, je stále jasnejšie, že lepšie pochopenie nádoru onkogenézy je nevyhnutné zlepšiť prognózu týchto pacientov. Je prevláda v ázijských krajinách, údaje sa objavujú na rolu miRNA na rozvoj alebo potlačenie rakoviny žalúdka [6].

miRNA majú dvojitú funkciu, pokiaľ ide o žalúdočné rozvoja rakoviny [6, 13]. Niektoré miRNA sú nádorové supresormi a ďalšie sú oncomiRs [6]. Ueda et al. nájdených 22 miRNA upregulovány a 13 downregulated v plazme pacientov s rakovinou žalúdka [13]. Ciele, ktoré sú predmetom vyšetrovania v prípade rakoviny žalúdka patrí regulátory p16, pomocou Mir-24 a p21 cez MIR-222/221 a mier-106b /93/25 [6]. Iné, ako sú MIR-21, môže byť up-regulovaná až u 92% vzoriek žalúdočnej rakovina tkanív [14]. Kandidátov na rakovinu žalúdka, ktorá slúži ako nádorové supresormi zahŕňajú MIR-181b, mier-101 a mier-486 [6]. Napríklad, mier-101 je myšlienka zamerať EZH2, COX-2, MCL-1 a Fos [15]. Mier-486 je myšlienka mať vplyv na OLFM4, prípadne ovplyvňovať apoptózu po prúde [16].

Po zistení, že väčšina miRNA slúži ako nádorové supresormi, sme skúmali c-Met dráhu u rakoviny žalúdka. Pri štúdiu c-Met cestu pre rhadbomyosarcoma, sme zistili, že dôležitosť tejto cesty v sarkóm [9]. c-Met je známe, že ich poškodeniu v karcinómu žalúdka [11, 17-19]. MET protoonkogen kóduje proteín známy ako receptor rastového faktora hepatocytov (HGF), ktorá vykazuje aktivitu tyrozínkinázy [18]. bežne nájdeme vyjadril len v kmeňových bunkách, ale tiež videli jeho dysfunkcie v onkogenézy [18]. V tejto štúdii sme boli schopní potvrdiť, že c-Met sa významnou mierou podieľa na rakovinu žalúdka a jeho úloha ako MIR-206 cieľa je rozhodujúca v onkogenézy.

progresiu bunkového cyklu je ich poškodenie v karcinómu žalúdka. Na predchádzajúcich správach založené, cyklin D2 je zvýšená u karcinómu žalúdka, ak sa MIR-206 ovplyvnený [10]. MIR-206 bolo preukázané, že je silným prognostický marker [10]. Jeho zníženie expresie je spojená s kratšou celkové prežitie. Obnova MIR-206 vedie k G0 /G1 zastavenie bunkového cyklu, čo potvrdzuje jej úlohu ako nádorový supresor. Naša práca tiež ukázal, bunkový cyklus porucha regulácie s CDK4 a fosforylovaného-Rb bola ovplyvnená. CDK4 je členom cyklin závislé kinázy Ser /thr proteín kinázy. To vedie k G1 fázy progresie. Okrem toho kinázy vedie k fosforylácii Rb, ktorý je nádorový supresor podieľa na progresiu bunkového cyklu.

Aj keď podobné nálezy boli potvrdené v žalúdku, vaječníkov a prsníka, role MIR-206 sa zdá mať opačný účinok na rakovinu hrubého čreva [6, 20]. Inverzný korelácia bola zistená medzi Mir-206 a KLF4 v paneli rakoviny ľudského hrubého čreva [20]. KLF4, ktorý má onkogénne vlastnosti v iných zhubných nádorov ako je rakovina prsníka, kože a pľúc, funguje ako nádorový supresor v rakovine hrubého čreva [20]. Ktorého zriaďovateľom je hyper-Súbežne sa metylujú zvýšenou hladinou MIR-206, ktoré vedú k downregulace KLF4 [20]. Tieto zistenia naznačujú, že mier-206 nemusí fungovať rovnako vo všetkých epitelových bunkách, čo neguje jedna veľkosť pre všetkých prístup chemoterapeutiká.

V tejto štúdii sme identifikovali mechanizmus pre reguláciu génovej expresie c-Met cez Mir-206 v rakoviny žalúdka. c-Met nadmerná expresia MIR-206 po down-reguláciu sa zdá byť obyčajná etiológie pre patogenéze rakoviny žalúdka u väčšiny vzoriek skúmanej v tejto štúdii. V súhrne sme preukázali, že mier-206 negatívne moduluje c-Met signálne dráhy zapojené do bunkovej proliferácie a migrácie. Naša štúdia sa snáď mať závažné klinické dôsledky v liečbe rakoviny žalúdka. Mier-206 je kandidátom pre imunohistochemické zisťovanie malých nádorov a možný cieľ pre biologických liečiv.

Materiály a metódy

bunkovej kultúre

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie, AGS, zakúpené od ATCC (Manassas, VA), sa pestujú v Hamově F-12 médiu (Invitrogen, Carlsbad, CA), doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

Ethics vyhlásenie

Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami a schválenie Starostlivosť o zvieratá a ich využitie výboru Wenzhou lekárska univerzita (povolenie číslo: WZMCOPT-043011). Štyridsať nádorové vzorky žalúdočné a normálne darcovskej žalúdočné tkaniva boli získané od druhej pridružená nemocnice Wenzhou lekárskej univerzity (Wenzhou, Čína). Zber vzoriek bol schválený Wenzhou Medical University etickou komisiou o výskumu vykonávaného na človeku, a písomný informovaný súhlas bol získaný od každého prípadu. Všetky experimenty boli vykonávané v súlade s Helsinskou deklaráciou a vnútroštátnymi právnymi predpismi.

Kvantitatívny RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná z ľudských vzoriek žalúdočnej nádorových a normálnych kontrol s TRIzolu činidla (Invitrogen). 10 ng celkovej RNA bolo použité k cDNA syntézy TaqMan microRNA reverznej transkripcie Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), a mier-206 úrovne expresie bola kvantifikovaná pomocou testu TaqMan microRNA (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR sa uskutočňuje za použitia Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Imunohistochemické farbenie na c-met

oddieloch formalínom fixovaných parafínových ľudské nádorové vzorky žalúdočné (5 um) boli vyrobené a de-paraffinized xylénom a etanolom. Sklíčka boli ošetrené 0,3% peroxidu vodíka a potom inkubované cez noc pri 4 ° C s c-Met protilátok 1: 300 riedenie (CST, Beverly, MA). Imunohistochemické farbenie bolo vykonané za použitia Envision HRP /detekčného systému DAB (Dako, Glostrup, Dánsko).

testu proliferácie buniek

AGS bunky boli umiestnené v 2000 buniek na jamku v 96-jamkových doštičkách ( costar, High Wycombe, UK) pre každú transfekciu. Transfekcia boli vykonané s činidlom (Lipofectaminu RNAiMAX; Invitrogen), v troch vyhotoveniach. Pre každú jamku bolo použitých 50 nM MIR-206 má rovnakú funkciu ako molekula (Ambion, Austin, TX), alebo negatívna kontrola (Ambion) transfekcia. Po 72 hodinách kultivácie, množenia buniek bola hodnotená testom MTS (CellTiter 96 vodných, Promega, Madison, WI).

Transwell testy migrácie

24 hodín po transfekciu, AGS bunky boli zozbierané trypsinizací a raz umytá roztokom D-Hanks (Invitrogen). Na meranie bunkovú migráciu alebo inváziu, 8-um veľkosti pórov kultúru alebo Matrigelu vložky (Transwell; Costar) boli umiestnené do jamiek 24-jamkových kultivačných doštičiek. V spodnej komore, 400 ul F-12 s obsahom 10% FBS a bolo pridané 20 ng /ml HGF. Potom, 5x10 ^{4 bunky boli pridané do hornej komory. Po 20 hodinách inkubácie sa bunky, ktoré migrovali cez póry boli zafarbené kryštálovú violeťou a pozorované pod mikroskopom (Zeiss, Oberkochen, Nemecko) za použitia 20X cieľ.}

Western blot analýza

AGS bunky (1x10 ^{5) boli nasadené na 6-jamkových doštičkách a pestované v F-12 počas 24 hodín pred transfekcia. 72 hodín po transfekciu boli bunky premyté studeným PBS a podrobí sa lyzačného pufra (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /l dodecylsulfát sodný [SDS], 100 mM dithiothreitolu). Proteínové lyzáty (20 ug každého) boli oddelené za použitia 8% SDS-polyakrylamidovom gélu, potom elektro-prenesené na nitrocelulózový filter membrány. Membrány boli blokované pufrom obsahujúcim 5% odstredené mlieko v PBS s 0,05% Tween-20 počas 2 hodín a inkubované cez noc s protilátkou pri 4 ° C. Po druhom premývaní PBS obsahujúcom 0,05% Tween-20, boli membrány inkubované s peroxidázou konjugovanou sekundárnej protilátky (Millipore, Darmstadt, Nemecko) a vyvinula so zvýšenou detekčnej súpravy chemiluminiscencie (Pierce, Rockford, IL). GAPDH bola použitá ako kontrola nanášania. Protilátky pre CDK4, p-Rb, EKR, Akt, p-EKR, p-Akt, c-Met a GAPDH boli od Cell Signaling Technology (Beverly, MA).}

siRNA testy

c-Met-špecifická siRNA (Ambion) a negatívne kontrolné siRNA (Ambion) boli použité k znižuje expresiu c-Met expresiu v bunkách AGS. 50 nM c-Met-špecifickú siRNA alebo siRNA negatívna kontrola bola transfekována do buniek s AGS Lipofectaminu RNAiMAX. MTS test bol vykonaný 72 hodín po transfekciu, zatiaľ čo transwell a Matrigelové testy boli vykonávané 24 hodín po transfekciu, ako je popísané vyššie.

in vivo rast nádoru
Test

pre-mikroRNA expresné konštrukty Lenti-MIR-206 a vektorové riadenie pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP boli zakúpené od systému Biosciences (Mountain View, CA). AGS bunky boli infikované lentivirus exprimujúcich MIR-206, alebo negatívna kontrola. Samiciam nahých myší, 6 týždňov staré, boli vrúbľovať bunkami AGS (8x10 ^{6) expresie MIR-206, alebo negatívne kontroly vo svojich bokov, a potom bola usmrtená po 8 týždňoch. Veľkosť nádoru bola meraná a objem sa vypočíta podľa vzorca: ( L
x W
2) x 0,5, ( L
dĺžku; W
, šírka) podľa metódy minulosti hlásené [21]. Všetky štúdie a postupy boli schválené Výborom pre Wenzhou Medical University starostlivosť o zvieratá a ich používanie.}

Štatistická analýza

Všetky údaje boli uvedené ako stredná hodnota ± SEM. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota ± SEM z výsledkov získaných z triplikátech v jednom experimente. Výsledky predstavujú výsledky získané v troch oddelených pokusoch. Rozdiely medzi experimentálnymi skupinami a kontrolnej skupiny boli analyzované pomocou Studentovho t
-test. Štatistická významnosť bola prijatá na P Hotel < 0.05.

Podporné informácie
S1 Obr. FACS analýza AGS buniek transfektovaných s Mir-206.
AGS bunky boli zbierané 48 hodín po transfekciu s Mir-206 alebo NC, zafarbené propidiumjodidom a analyzované prietokovou cytometriou. Desať tisíc buniek bolo hodnotené v každej vzorke. Medzi reprezentatívne výsledky v troch nezávislých experimentov sú znázornené
doi :. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001
(TIF)
S2 Obr. Tvorba kolónií test.
AGS buniek transfektovaných s Mir-206 alebo NC boli vrúbľovať v nízkej hustote. Po 7 dňoch, tvorba kolónií bola určená pomocou farbenia kryštálovou violeťou. Typické sú zobrazené výsledky v troch nezávislých experimentoch
doi :. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002
(TIF)
S3 Obr. Účinky Mir-206 na AGS buniek bola hodnotená pomocou Transwell a Matrigel testu.
Počtu buniek, ktoré migrovali do kultivačného vložky pórov (hore), alebo sa napadol skrz vložku póry Matrigel (dole) bol fotografovaný za použitia 20X mikroskop cieľ
doi :. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003
(TIF)
S4 obr. . Zníženie expresie c-Met u siRNA
Western blot analýza bola vykonaná na potvrdenie potlačenie c-Met expresiu po Lipofectamine transfekciu AGS buniek buď s c-met siRNA alebo negatívne kontrolou (NC)
doi :. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004
(TIF)
S5 obr. Účinky c-Met siRNA na AGS buniek bola hodnotená pomocou Transwell a Matrigel testu.
Počtu buniek, ktoré migrovali do kultivačného vložky pórov (hore), alebo sa napadol skrz vložku póry Matrigel (o) bol fotografovaný za použitia 20x mikroskop cieľ
doi :. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005
(TIF)

• Ploche ONE: exosomatických miRNA z pobrušnice laváži ako potenciálnych prognostických biomarkerov peritoneálnej metastázy v rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Zlepšenie účinky žiarenia od Ursolová kyselina v BGC-823 ľudský adenokarcinóm žalúdka bunková línia rakoviny