Ploche ONE: Zvýšená expresia receptora pre pokročilých glykácia konečných produktov (RAGE) súvisí so zlou prognózou v žalúdočnej Cancer

abstraktné

Pozadie

receptor pre pokročilých glykácia konečných produktov (RAGE) je onkogénne multidisciplinárny trans-membránový receptor, ktorý je nadmerne exprimovaný v mnohých ľudských nádorov. V poslednej dobe bolo preukázané, že RAGE je tiež zapojený do karcinogenézy a invázie tumoru. V tejto štúdii sme skúmali úrovne expresie a prognostickú hodnotu zlosť v primárnych karcinómov žalúdka (GC).

Metódy

Skúmali sme RAGE výraz v primárnom GC a párové normálne žalúdočnej tkanivo v reálnom doba kvantitatívnej RT-PCR (n = 30) a Western blot analýzy (n = 30). Ďalej sme vykonali imunohistochémia na 180 vzoriek parafínových GC, 69 uzavreté normálnych jedincov.

Výsledky

RAGE bol nadmerne vystavený u GC v porovnaní s priľahlými noncancerous tkanív ( P
<0,001) a vyššie RAGE expresie významne koreluje s histologického stupňa ( P
= 0,002), stav uzlín ( P
= 0,025), stav metastáz ( P
= 0,002) a Spoločný výbor American Cancer na javisku ( P
= 0,020). Okrem toho upregulace RAGE prejavu je nezávislý prognostický faktor v viacrozmerné analýzy pomocou Cox regresie modelu ( P
= 0,001).

Závery

RAGE Nadprodukcia môže byť užitočným markeru predpovedať priebeh GC a zlú prognózu

Citácia :. Wang D, Li, T, G Ye, Shen Z, Hu Y, Moju T, et al. (2015) Zvýšená expresia receptora pre pokročilých glykácia konečných produktov (RAGE) súvisí so zlou prognózou v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697

Akademický Editor: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, Taliansko

prijatá: 22.listopadu 2014; Prijaté: 13. februára 2015; Uverejnené: 10.04.2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená programom národného Key Klinická lekárska špecializácia, výskumného fondu verejného blaha v zdravotníctve priemysle (No.201402015), pričom hlavný program pre vedu a technológie program Guangzhou (No.201300000087) a Národný kľúčové technológie R &D program (No.2013BAI05B00). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

receptor pre pokročilých glykácia produktov (RAGE), bunkové povrchové molekuly vyjadrené v celej rade bunkových typov, je multiligand členom superrodiny imunoglobulínov [1]. RAGE bol zapletený do širokého spektra patologických reakcií, vrátane zápalu a rakoviny, založené na rôznych svojich ligandov [2]. Ako novo uznávané onkogénne trans-membránového receptora, že bolo preukázané, že sa podieľa na mnohých ľudských rakovín podporujúce rast, prežitie a metastatického šírenia [3]. Niekoľko štúdií preukázalo, že RAGE je up-regulovaná a stráca svoju charakteristickú granulárne štruktúru v primárnych nádorov [4]. Interakcia AGE-RAGE hrá kľúčovú úlohu v rozvoji rakoviny prostaty, a inhibíciou tejto interakcie má potenciál ako nové molekulárne ciele pre prevenciu alebo liečbu rakoviny [5]. Súčasná expresia RAGE a High-mobility group proteín B1 (HMGB1) bola podstatne spojená s kolorektálnym karcinómom inváziu a metastázy [4,6,7]. Navyše, RAGE expresie koreluje s angiogenézy a nádorových metastáz v ústnej spinocelulárneho karcinómu (OSCC), a môže byť nezávislý prognostický faktor recidívy a prognózou u pacientov s OSCC [8,9]. Okrem toho, genetický polymorfizmus génu RAGE môže byť prediktívne biomarker použité pre skríning pacientov citlivých na termoterapia a vyhodnotiť prognózu non-malobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC) u pacientov [10].

Avšak role hnevu u rakoviny žalúdka (GC) zostal nepolapiteľný. RAGE už skôr uviedlo úzko spojená s inváziu a metastázy rakoviny žalúdka [11]. Okrem toho, bolo oznámené, že blokáda RAGE signalizácie potlačený rast a metastázy rakovinových buniek žalúdka [12]. V vyšetrovanie rolí zlosť v GC patogenéze a progresii a dosah ich polymorfizmov génov na funkciu receptora, Gu et al [13] preukázali, že RAGE Gly ^{82Ser polymorfizmus môže byť spojené so zvýšeným rizikom začatia alebo progresie karcinómu žalúdka. Avšak, ak je nám známe, je vzťah medzi expresiou RAGE a prognózu pacienta GC je neznáma.}

V tejto štúdii sme analyzovali expresiu RAGE v GC pomocou real-time kvantitatívne RT-PCR (QRT-PCR), western blotting a imunohistochémia (IHC). Identifikovali sme vzťah medzi expresiou RAGE a klinicko-rysy GC, a potom hodnotila prognostický význam RAGE výrazu pre pooperačné prežitie pacientov GC.

materiáloch a metódach

tvrdenie etika

Táto štúdia bola schválená etickou komisiou Nanfang Hospital a písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých týchto pacientov účastníkoch.

Pacienti a tkanivové vzorky

Tridsať párové čerstvé mrazené žalúdočné rakovinové a zodpovedajúce nerakovinové tkanivá sliznice (vyrezané > 10 cm od okraja GC), vzorky boli odobraté od pacientov GC do 30 minút po resekcii a okamžite uložené v kvapalnom dusíku až do použitia. Ďalším 180 parafínové vloženej GC tkaniva bloky a 69 kontrolných vzoriek zo spárovaných normálnych žalúdočných tkanivách odobratých z distálnej resekčné okraje boli získané z uložených súborov odboru všeobecnej chirurgie, Nangfang Hospital, južnej Medical University, boli zhromaždené chirurgicky v období od januára 2007 do decembra 2008. 180 pacienti zahrnutie 120 mužov a 60 žien vo veku 22-78 rokov (priemer, 55,62 rokov). Žiadny z týchto pacientov boli liečení rádioterapiou alebo chemoterapiou pred chirurgickým zákrokom. Histopatologické typ a štádium po resekcii týchto vzoriek boli stanovené v súlade s kritériami klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie a spoločného výboru amerického rakoviny (AJCC) Cancer Staging Manual (7. vydanie, 2010). Medzi nimi, 125 pacientov fázy I-III dostal radikálnej resekcii (19, 25 a 81 pre stupňa I, II a III, v tomto poradí), a 55 pacientov Stage-IV získanej paliatívnej chirurgický zákrok a /alebo chemoterapiu. Metastázy zasiahnutých vzdialených orgánoch u pacientov Stage-IV zahŕňali pobrušnicu, vzdialené lymfatické uzliny, pečeň, priečneho tračníka, vaječníkov alebo vajcovodu, pankreasu, čreva, kosti, pľúca, mozog a dolnej dutej žily. Pacienti boli sledovaní až do smrti alebo na posledný follow-up dáta (30 december 2013). Stredná doba sledovania bola 48 mesiacov (od 2 do 82 mesiacov).

Total extrakcie RNA a real-time kvantitatívne RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná z mletého tkanív s TRIzolu činidlo (Takara, Japonsko) a reverznej transkripcii na prvé vlákno cDNA pomocou TaqMan reverznej transkripcii Kit (Takara, Japonsko). Potom 0,5 až do 1 ul alikvótne cDNA boli použité ako Temple pre amplifikáciu fragmentu RAGE (vpred: 5 AAACATCACAGCCCGGATTG-3, zadná strana: 5 TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) za nasledujúcich podmienok: 95 ° C počas 30 s; 40 cyklov 95 ° C počas 5 sekúnd; 60 ° C počas 30 sekúnd; a topí pri teplote 95 ° C počas 5 sekúnd, nasleduje 60 ° C po dobu 1 minúty a chladenia pri teplote 50 ° C počas 30 sekúnd. PCR a zber dát boli vykonané na LightCycler480 System (Roche, švajčiarsky) s 2 × SYBR Green master mix kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA). RAGE expresie bola normalizovaná k tomu GAPDH.

Western blot analýza

Western blotting bol uskutočnený podľa štandardných metód, ako bolo opísané skôr [14]. Stručne povedané, tkanivá boli rozdrvené a lyžovanie RIPA pufra pre lýzu a lyzáty boli zozbierané centrifugáciou (12000 otáčok za minútu) pri teplote 4 ° C počas 30 minút. Koncentrácie proteínu boli stanovené pomocou Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Približne 50 ug vzorky sa oddelí elektroforeticky na 10% dodecylsulfát sodný (SDS) -polyacrylamide géloch a prenesené na polyvinylidendifluoridovou membránu. Po blokovaní nešpecifických väzobných miest, bola membrána inkubovaná s králičie polyklonálne protilátkou anti-RAGE (Santa-Cruz, CA, USA) v riedení 1: 1000 pri teplote 4 ° C cez noc. Po troch premytí TBST (tris-vyrovnanom fyziologickom roztoku Tween-20) po dobu 10 minút, boli membrány inkubované so sekundárnou protilátkou v riedení 1: 3000 pri teplote miestnosti po dobu 60 min. Proteíny boli detekované s rozšíreným systémom chemiluminiscencie (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), a normalizuje na beta-aktínu detekované za použitia myší anti-ľudský beta-aktínu protilátky (riedenie 1: 1000, Sigma, St. Louis, MO , USA).

Imunohistochemické stanovenie

Tento test IHC bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [12,14]. Stručne povedané, bola sklíčka deparafinizovány dimetylbenzenem a rehydratuje pomocou gradientu zmesi etanolu (100%, 95%, 90%, 80% a 70% etanol) do vody. Po premytí PBS (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok) trikrát, bola sklíčka varí získavanie dát vyrovnávacej pamäte antigénu, 0,01 M citrát sodný, kyselina chlorovodíková (pH = 6,0), po dobu 30 minút v mikrovlnnej rúre. Po endogénnej aktivita peroxidázy bola zastavená 3% H 2O _{2, následne po troch premytí PBS, nešpecifické protilátky väzba bola blokovaná inkubáciou sklíčka s 10% normálnym kozím sérom neimúnnych. Rezy boli potom inkubované pri 4 ° C cez noc s králičie polyklonálne RAGE protilátky (Santa-Cruz, CA, USA) v riedení 1: 400 a následne sa inkubujú s chrenovou peroxidázou (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Po premytí v PBS boli rezy potom sa vyvíjal za použitia 3,3-V-Diaminobenzidine (Sigma), premytá pod tečúcou vodou a jemne kontrastne hematoxylínom pred dehydratáciou a krycie sklíčko montáž. Negatívne kontrolné experimenty boli vykonávané nahradením primárnej protilátku v PBS.}

imunologické bola analyzovaná dvoma nezávislými pozorovateľmi (Y.X. a L.Z.), ktorí boli zaslepení na výsledku pacienta a ďalších klinicko parametrov. Detekčný systém RAGE bol popísaný skôr [12]. Všetky vzorky boli rozdelené podľa veľkosti imunoreaktivity: 0, < 5%; 1, 5% až 10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. Farbenie intenzita bola hodnotená ako 0, negatívne; 1, slabý; 2, stredné; 3, silný. V každom prípade je celková imunologickej skóre tiež známy ako index farbenie (SI), sa vypočíta tak, že percento pozitívnych buniek s výsledkom intenzity farbenia, čím sa získa hodnotu medzi 0 a 12. V tejto štúdii optimálna prahová hodnota bola označené takto: sI < 8 sa používa na označenie nízky RAGE výraz a SI≥8 high RAGE výraz

Štatistická analýza

Štatistická analýza bola vykonaná pomocou štatistického softvérového balíka SPSS (SPSS verzia 19.0. , SPSS, Chicago, IL, USA). Spárovaného-vzorky t-test bol použitý k porovnaniu Rage mRNA a hladín proteínov v rakovinových a susediacich vzorky nenádorové tkaniva. Test Mann-Whitney U alebo Pearson Chi-Square test bol použitý na porovnanie skóre SI získané imunohistochemické analýzy GC a zodpovedajúce normálne slizničné tkanivá. Vzťah medzi RAGE prejavu a klinicko-charakteristiky boli analyzované pomocou Pearson Chi-kvadrát testu. Krivky prežitia boli vypočítané podľa metódy Kaplan-Meier a analyzované pomocou log-rank testu. Cox proporcionálny nebezpečenstvo regresný model bol použitý pre jednorozmerné a viacrozmerné analýzy posúdiť pomer rizika (HR) a identifikovať faktory, ktoré predpovedajú prežitie. Obojstranná hodnota p. ≪ 0,05 boli považované za štatisticky významné

Výsledky

Nadprodukcie zlosť v ľudskej GC

Na objasnenie role RAGE vo vývoji GC a postup, najprv analyzovali jeho expresiu vo vzorkách GC a uzavreté priľahlé nenádorové tkaniva na úrovni mRNA. Real-time kvantitatívna analýza RT-PCR ukázala, že RAGE bol nadmerne exprimovaný vo väčšine tkanív GC v porovnaní s ich normálnymi náprotivkami (19/30, 63,3%) (obrázok 1). RAGE bol podobne up-regulované na úrovni proteínu v GC, ako je znázornené pomocou Western Blot a IHC testoch. Zvýšená hladina expresia RAGE bol nájdený u Western blot analýzy u 26 z 30 (86,7%), GC v porovnaní s normálnymi tkanivami (obrázok 2). Parafínových blokov (n = 249) zo 180 pacientov GC bola hodnotená na expresiu RAGE proteínové IHC (tabuľka 1). Chýba alebo nízku farbenie (SI < 8) normálne žalúdočnej sliznice bolo pozorované u 55 z 69 prípadov (79,7%), zatiaľ čo vysoká farbenie (SI≥8) bol zaznamenaný vo väčšine tkanív (GC 111/180; 61,7%). RAGE expresie bola významne vyššia u GC tkanivách (n = 180; SI = 6,22) v porovnaní s normálnymi tkanivami žalúdka (n = 69; SI = 2,09; P Hotel &0,001). Reprezentatívne príklady slabých, stredne silné farbenie (micrographs s 200 × zväčšenie) sú znázornené na obrázku 3.

Združenie RAGE prejavu s klinicko-patologické rysy

na základe kategórií, ktoré sme definovali v Based sekcia Methods, dáta ukázali, že vysoká expresia RAGE bol významne koreluje s histologického stupňa ( P
= 0,002), stav uzlín (N etapy P
= 0,025), status metastáza (M štádium, P
= 0,002) a AJCC etapa ( P
= 0,020), ale nebol s pohlavím, vekom, veľkosť nádoru, lokalizácia nádoru, Lauren klasifikácie alebo invázie tumoru (tab 2).

Korelácia medzi expresiou RAGE vychádza z IHC a prežitie pacienta

Kaplan-Meier krivka ukázala, že pacienti v high-RAGE skupina mala výrazne horšie celkové prežívanie než pacienti pri fotografovaní za nízkej RAGE skupina ( P Hotel < 0,001, obr 4A). Pacienti s vysokou expresiou RAGE tiež mal výrazne horšie celkové prežívanie ako pacienti s nízkou expresiou RAGE vo fáze AJCC III /IV podskupiny (n = 136; P Hotel &0,001, obr 4C), ale nie v etapa AJCC i /II podskupiny (n = 44; P
= 0,695, obr 4B).

Jednorozmerné a viacrozmerné analýzy

Jednorozmerná analýza ukázala významný vzťah medzi celkovou prežitie a vek, invázie nádoru, stav uzlín, stav metastáz, AJCC fázy a RAGE expresie (pozri tabuľku 3). Všetky tieto faktory sú zahrnuté v základe viacnásobnej Coxovho modelu proporčne rizík s cieľom prispôsobiť účinkov premenných. Na základe tohto modelu, úrovne RAGE expresie na báze (95% interval spoľahlivosti (95% CI) = 1,357-3,383; pomer rizika (HR) = 2.143 P
= 0,001) a nádorové invázie (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 - 96,874; P
= 0,028) boli potvrdené ako nezávislé prognostické faktory (tabuľka 3)

Diskusia

GC zostáva jedným z najviac smrteľných ľudských malignít. , a to najmä vo východnej Ázii. Napriek pokrokom v diagnostike a terapii, je prognóza pre rakovinu žalúdka je stále žalostný a závisí na rade charakteristík karcinómu, ako je nádorový rast, diferenciáciu, invázia a vzdialených metastáz [15]. GC tvorbe nádorov a progresiou sú zle pochopil, komplexné, viackrokové spôsoby regulované vnútorných a vonkajších bunkových signálov s viacerými génov a proteínov zmeny. Je veľmi dôležité identifikovať a pochopiť molekulárne mechanizmy, z ktorého iniciácii a progresii nádoru vyvinúť racionálny a rakovinou špecifické prístupy k diagnostike a liečbe GC.

V tejto štúdii sme skúmali stav RAGE výraz v GC ako na mRNA a nízka hladina bielkovín a zistil, že RAGE bol pozoruhodne up-regulovaná v ľudských tkanivách GC v porovnaní s normálnou žalúdočnej epitel. IHC analýza bola vykonaná pre ďalšie overenie tohto upregulaci RAGE prejavu v primárnom GC. Pozorovali sme, že vysoká úroveň RAGE expresie bola významne spojená s histologického stupňa, stavu uzlín, stav metastáz a AJCC fáze GC, podobne ako v predchádzajúcich zistení v OSCC a NSCLC [9,10]. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že RAGE môžu byť zapojené do progresie GC.

Tiež sme zistili, prvýkrát, že RAGE expresie je silným prediktorom zlou prognózou pre pacientov GC, podobne ako je tomu u kolorektálneho karcinómu, hepatocelulárneho rakovina, OSCC a NSCLC [9,10,16,17]. Zdá sa však, prognostický dopad RAGE prejavu líšiť v závislosti na fáze rakoviny (obr 4). V tejto štúdii, analýza prežitia naznačujú, že invázia tumoru a RAGE výraz nezávisle predpovedal zlé celkové prežitie. Relatívne malé veľkosti vzoriek zo štádia I a skupiny II by mohol byť zodpovedný za rozdiel. Väčšina pacientov s GC v Číne sú diagnostikované v v pokročilej fáze z dôvodu nedostatku účinného skoré detekcie. Okrem toho, výraz RAGE má užší 95% CI a zdá sa, aa lepšie predpovedať na GC v porovnaní s nádorovú inváziu v tejto štúdii.

RAGE je uznanie receptor vzor, ​​ktorý sa viaže viac ligandy odvodené od poškodenej bunkové prostredie, a hrá zásadnú úlohu v podpore gastrointestinálne tumorogenézy [18]. Tiež ako dôležitý mediátor zápalové, RAGE mohol modulovať presluchy medzi prežitia ciest a autofagie v nádorových bunkách a podporovať prežitie nádoru prostredníctvom udržanie autofagie a obmedzovanie apoptózu [19]. Kuniyasu et al
. [11] uviedli, že RAGE expresie je úzko spojené s inváziou a metastáz u pacientov s GC, čo nám poskytuje experimentálne základ pre funkčné štúdie RAGE u rakoviny žalúdka. Následne Xu et al [12] preukázali, že porazený z RAGE znížila proliferácie GC buniek a invázie rakoviny žalúdka, znížená expresia Akt PCNA a MMP-2 a indukovanú apoptózu a cyklu zatknutie. Preto cielené inhibíciu RAGE alebo jeho ligandy môžu slúžiť ako nové ciele pre zlepšenie súčasných postupov liečby rakoviny.

K dnešnému dňu je hodnota zacielenie RAGE pre prípadnú včasný zásah a prevenciu v GC zostáva nejasný. Avšak, niektoré štúdie preukázali úlohu RAGE v iných typov rakoviny a preukázali, že blokáda RAGE znížil rast a metastázy oboch implantovaných nádorov a nádorov rozvojových spontánne u vnímavých myší. Inhibícia RAGE znížila proliferáciu v nádorových bunkách prsníka a indukovanú apoptózu a inhibuje rast rakoviny prostaty [20,21]. RAGE dysfunkcia tiež inhibovaná angiogenézy a progresie rakoviny hrubého čreva, a predĺžil prežitie v rakoviny pankreasu [22-24]. Blokáda RAGE s rozpustným RAGE (sRAGE) oslabený poškodenie pečene, čím sa zlepšuje prežitie, chráni proti hepatocelulárna nekróza a zvýšenie expresie proregenerative tumor cytokínov nekrotizujúceho faktoru-a [25]. Okrem toho, Moy et al. [26] zistili, hraničné štatisticky významný inverzný vzťah medzi kontinuálne expozície sRAGE a rizikom rakoviny pečene, čo naznačuje, že sRAGE môže chrániť proti zápalových účinkov spôsobených aktiváciou RAGE. Tieto zistenia súhlasne ukázali, že RAGE môže tiež pôsobiť ako potenciálny terapeutický cieľ v GC. Vzhľadom k svojej biologické vlastnosti, RAGE a jeho deriváty boli považované za nový ukazovateľ pre malígnym potenciálom, vrátane GC. Zlosť Gly ^{82Ser polymorfizmus bolo preukázané, že je spojená so zvýšeným rizikom rozvoja alebo progresie GC v case-control štúdii nemocnice na báze [13].}

V tejto štúdii sme zistili, že upregulace RAGE expresie významne spojená so zlými vlastnosťami klinicko a zlé celkové prežitie, čo naznačuje, že to môže prispieť k malígnym potenciálom GC. Preto RAGE by teda slúžiť ako cenný nového biomarkeru pre predikciu prognózy a potenciálny terapeutický cieľ pre pacientov s GC. Avšak, ďalšie štúdie sú oprávnené na objasnenie základných mechanizmov RAGE nadmernej expresii, a tým prispieť k lepšiemu porozumeniu a ďalej rozvíjať jeho potenciálne využitie.

Poďakovanie

Ďakujeme Dr. Yan Xiao a Dr Liang Zhao z katedry patológie na patologickej diagnózy a potvrdenie výsledkov IHC.

• Ploche ONE: prognosticky Význam Predúprava Serum CEA hladín v rakoviny žalúdka: Meta-analýzy zahrňujúce 14.651 Patients
• Ploche ONE: LAPTM4B-35, Rak-súvisiace Gene je spojená so zlou prognózou v TNM štádiu I-III žalúdočné pacientov s nádorovým ochorením