Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Vysoko výkonný sekvenovanie a Copy Number Variation detekcie pomocou formalínu Pevné zaliate tkaniva v metastázami do žalúdka Cancer

abstraktné

V ére cielenej liečby, mutácie profilovanie rakoviny je kľúčovým aspektom výroby terapeutických rozhodnutie , Charakterizovať rakoviny na molekulárnej úrovni, je použitie formalínom fixované do parafínu zaliate tkaniva, je dôležitý. Testovali sme Panel v2 Ion AmpliSeq Cancer Hotspot a NCounter variácií v počte kópií teste u 89 vzoriek žalúdočnej rakovinou formalínom fixovaných parafínových určiť, či sú použiteľné v archívnych klinických vzoriek pre personalizované cielenej liečby. overená sme výsledky s Sanger sekvenovania, real-time kvantitatívnej PCR, fluorescenčnej in situ hybridizácia a imunohistochemické vyšetrenie. Často zistená somatické mutácie zahrnuté TP53
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4,5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) a SMAD4
(3,4%) , Amplifikácia HER2
CCNE1
MYC
KRAS stroje a EGFR
gény boli pozorované u 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) a 1 (1,1%) prípadov, v uvedenom poradí. V prípadoch s amplifikáciou, fluorescenčnej in situ hybridizácia na HER2
overené amplifikáciu génu a imunohistochémia pre HER2, EGFR a CCNE1 overila zvýšenú expresiu proteínov v nádorových bunkách. Na záver sme úspešne vykonal polovodičové báze sekvencovania a NCounter počtom kópií variácie analýzy vo vzorkách karcinómu žalúdka formalínom fixovaných parafínových. Vysoko výkonný skríning v archívnych klinických vzoriek umožňuje rýchlejšie, presnejšie a nákladovo efektívnu detekciu hotspot mutácií alebo zosilnenie v génoch

Citácia :. Kim S, Lee J., Hong mi, IG, Kang SY, ha SY, et al. (2014) Vysoko výkonný sekvenovanie a Copy Number Variation detekcie pomocou formalínu Pevné zaliate tkaniva u metastázujúcej rakoviny žalúdka. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10,1371 /journal.pone.0111693

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

Prijaté: 28. apríla 2014; Prijaté: 29. septembra 2014; Uverejnené: 05.11.2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Táto štúdia bola podporená grantom z Kórey zdravotníckej techniky R &D projektu, Ministerstvo zdravotníctva &Co. Welfare záležitosti, Kórejská republika (A101130) a grantu Samsung Biomedical Research Institute (# SBRI-SP1B20112). Táto štúdia bola podporená tiež Samsung Medical Center intramurálním grantu, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Spoluautori Seokhwi Kim, Jeeyun Lee Min Eui Hong, In-Gu robiť, tak Young Kang Sang Yun ha, Seung Tae Kim, SE Hoon Park, vyhral Ki Kang, min-GEW Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae Sung Kim a Kyoung-Mee Kim sú zamestnaní Samsung Medical Center. Spoluautor Duk-Hwan Kim je zamestnaná Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute a Samsung Medical Center poskytol podporu vo forme platov pre autorov Seokhwi Kim, JL, meh, IGD, SYK, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL TSS, JMB, Sung Kim, KMK a DHK , ale nemal žiadnu ďalšiu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie zverejniť alebo prípravu rukopisu. Konkrétne role týchto autorov sú vyjadrené v sekcii "Autor príspevku"

Konflikt záujmov :. Autori majú tieto záujmy: Táto štúdia bola financovaná sčasti Samsung Biomedical Research Institute a Samsung Medical Center. Spoluautori Seokhwi Kim, Jeeyun Lee Min Eui Hong, In-Gu robiť, tak Young Kang Sang Yun ha, Seung Tae Kim, SE Hoon Park, vyhral Ki Kang, min-GEW Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae Sung Kim a Kyoung-Mee Kim sú zamestnaní Samsung Medical Center. Spoluautor Duk-Hwan Kim je zamestnaná Samsung Biomedical Research Institute. Nie sú žiadne patenty, výrobky vo vývoji alebo predávaných výrobkov vyhlásiť. To však nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Aj keď rakovina žalúdka je štvrtým najbežnejším typom rakoviny na svete, to je druhá najčastejšou príčinou smrti. [1] Jej výskyt je výrazne vyššia v ázijských krajinách, vrátane Kórei, kde sa jedná o druhou najčastejšou rakovinou. [2] V poslednej dobe niekoľko cielených terapeutika pre karcinóm žalúdka boli objavené, ktoré poskytujú ďalšie možnosti pre lekárov a pacientov [3] - [5]

V čase cielenú terapiu, mutácie profilovanie rakoviny kauzativní. je rozhodujúci pre terapeutické rozhodnutia. Pokusy na profil mutácie boli zhotovené použitím tradičného Sanger sekvenovania; to však nie je optimálna metódou v klinickej praxi z dôvodu nákladov, času a práce potrebné. Okrem toho Sanger sekvenovanie si vyžaduje značné množstvo DNA; vyhodnotenie malé množstvo vzorky pre niekoľko génov v rovnakej dobe nie je možné. Zavedenie ďalšej generácie sekvenčných metód (NGS) má vyriešiť tento problém tým, že multiplex, vysokou priepustnosťou sekvencovania mnohých vzoriek pre viac génov súčasne. [6], [7] Jeden z platformy NGS sa Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel, spolieha na non-optickú detekciu vodíkových iónov v polovodičovej zariadení, [8] a je schopný detekovať 2.855 onkogénne mutácie v 50 bežne mutovaných génov (tabuľka S1). Je lepšie ako iné metódy sekvencovania masové spektroskopia báze, poskytuje výsledky sekvenovania rýchlejšie a pri nižších nákladoch. [8] Je použiteľná v parafínových (FFPE) vzoriek tkaniva formalínom fixovaných s malým množstvom DNA. Vzhľadom na to, že zaisťuje vysokú citlivosť pri skríningu známy onkogénne mutácie, [9], [10] Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel je výber z 5 hlavných onkologických centier v Spojených štátoch pre molekulárnu diagnostiku v cielenú terapiu [11].

Amplifikácia onkogénov je hlavným mechanizmom pre génovú nadmernú expresiu a prispieva k rozvoju nádoru. [12] Medzi príklady patrí zosilnenie HER2
MET
FGFR2 stroje a Kras
gény v karcinómov žalúdku. [13], [14] Pri zisťovaní počtu kópií variácií (CNVs) v klinických vzorkách, fluorescenčnej in situ hybridizácia (FISH) a /alebo imunohistochemické (IHC), bol široko používaný. Avšak, vysoké náklady a malej veľkosti vzoriek biopsie materiálov obmedziť použitie týchto metód, a tam je ešte potreba ďalšieho vysokou priepustnosťou technológia sa ľahkou dostupnosťou, vysokou citlivosťou a nízkym nákladom. NCounter CNV CodeSets (Nanostring technológie, Life Sciences, Seattle, WA) poskytujú vynikajúcu presnosť a reprodukovateľnosť pre štúdium všetkých veľkostí a produkovať lepšie, rýchlejšie výsledky s podstatne menším úsilím, než s real-time kvantitatívnej PCR (qPCR) alebo CNV polí [ ,,,0],15].

Lepšie prispôsobené liečba rakoviny môže zlepšiť výsledky liečby. Vzorky pacientov nádorové bude potrebné, aby charakterizoval rakoviny na molekulárnej úrovni a identifikovať podskupiny ochorení, ktoré by mali prijímať rôzne procedúry. Použitie FFPE tkaniva je dôležitá pre umožnenie takejto štúdie. [16] Tu sme testovali AmpliSeq a NCounter vlastné CNV panely vo FFPE vzoriek rakoviny žalúdka zistiť, či sú použiteľné v archívnych klinických vzoriek pre personalizované cielenej liečby.

Materiály a metódy

Ukážky

percento nádorových buniek s viac ako 75%, sa vyberú do mikroskopiou z nefarbených sekcií 4 mm v porovnaní s H &E zafarbia snímky, a genomická DNA bola extrahovaná za použitia Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) v súlade s pokynmi výrobcu od 96 pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka. Po extrakcii, sme merali koncentrácie, rovnako ako pomer 260/280 a 260/230 nm pomocou spektrofotometra (ND1000, NanoDrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Každá vzorka bol potom kvantifikovaný s qubit fluorometri (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA). Genómovej DNA s > 10 ng merané qubit fluorometri bol podrobený príprave knižnice a sedem vzoriek sa nepodarilo skonštruovať knižníc a z tejto štúdie boli vylúčené. A konečne, 89 prípadov bolo nakoniec analyzované a zahŕňal 31 samicu a 58 pacientov mužského pohlavia. Tabuľka 1 uvádza klinické a patologické rysy pacientov v tejto štúdii. Recidíva alebo metastáza vyvinula u 11 pacientov s mediánom follow-up obdobie 76 mesiacov (v rozmedzí 5,5 - 149,3). Štúdia bola schválená etickou komisiou inštitucionálne (IRB) v Samsung Medical Center. Všetky klinické vyšetrenie bola vykonaná v súlade so zásadami vyjadrenými v Helsinskej deklarácie. Písomný informovaný súhlas bol upustiť od IRB kvôli retrospektívnej analýzy a anonymných dát. Vzorky boli odobraté ako súčasť rutinného lekárskeho zákroku a boli zhromaždené autormi pre túto štúdiu. boli všetci de-identifikovať vzorky od zosnulých pacientov alebo živých pacientov, vrátane odstránenia a všetkými demografických údajov, a to pred analýzou a informovaný súhlas forme bola upustiť od IRB.

Ion AmpliSeq panel rakovina v2

Použili sme Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) pre detekciu časté somatické mutácie, ktoré boli vybrané na základe literárneho prehľadu. Skúma 2855 mutácie v 50 bežne mutovaných onkogénov a tumor supresorových génov (tabuľka S1). Po prvé, 10 ng DNA z každého zo 89 vzoriek FFPE nádorových prešiel jediný skúmavkách a multiplexové PCR amplifikácie s použitím Ion AmpliSeqCancer Primer bazéna a činidiel Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). Liečba výsledných amplikónov s FUPA Reagent natrávené primery a fosforylované amplikónov. Fosforylovanej amplikóny boli naviazané na Ion adaptéry a čistí. Pre Barcoded prípravu knižnice, sme nahradili s čiarovým kódom, adaptéry z Ion Xpress čiarových kódov adaptéry 1-96 Kit pre non-čiarovým kódom adaptéra zmes dodávanú v súprave Ion AmpliSeq knižnica. Ligovaný DNA prešla nick-transláciu a zosilnenie na dokončenie spojenie medzi adaptéry a amplikóny a generovať dostatok materiálu pre následný prípravu šablóny. Dve kolá Agencourt AMPure XP Reagent viazanie na 0,6 a 1,2 pomeroch objem húsenice-k-vzorka odobratá vstupné DNA a nezapísané v obchodnom registri priméry z amplikónov. Konečné molekuly knižnice boli 125 ~ 300 bp vo veľkosti. Potom sme previedli knižnice do Ion OneTouch systému pre automatizovanú výrobu šablóny. Sekvenovanie bolo vykonané na Ion PGM sekvenceru v súlade s pokynmi výrobcu. Použili sme IonTorrent softvér pre automatizovanú analýzu dát.

Ak chcete merať citlivosť a špecifickosť panelu rakoviny Ion AmpliSeq, boli použité celé výsledky sekvenovania exome zo 4 vzoriek rakoviny žalúdka sa známym stavom mutácie [17].

NCounter Copy Number Variation CodeSets

Pre detekciu CNV, NCounter Copy Number Variation CodeSets boli použité s 300 ng čisteného genómovej DNA extrahovanej z 2-3 úsekov 4-um hrubé FFPE zástupcu nádorových blokov s použitím QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA bola fragmentovaný štiepením Alul a denaturujú pri 95 ° C. Fragmentované DNA bola hybridizována s codeset 86 génov v NCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) počas 18 hodín pri teplote 65 ° C a spracované v súlade s pokynmi výrobcu. NCounter Digital Analyzer počítal a do tabuľky signálov reportér sond a priemerný počet počtov > 3 boli volány a potvrdené IHC, FISH alebo real-time PCR

IHC HER2, EGFR (HER1) a CCNE1.

pre overovanie výsledkov získaných z CNV NCounter, sme vykonali IHC HER2 vo všetkých prípadoch, a EGFR a CCNE1 vo vybraných prípadoch. Po Deparafinizace a rehydratáciu, 4 mm sekcie na silánom potiahnutá sklíčka boli imunohistochemicky na HER2. HercepTest (Dako, Glostrup, Denmark) bola použitá v súlade s pokynmi výrobcu, ako bolo popísané vyššie. [18] EGFR sme použili anti-NCL-L-EGFR-384 myší monoklonálnu primárnu protilátku (1: 100 zriedenie; Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, UK) a pre CCNE1 sme použili anti-CCNE1 /cyklín E1 protilátky (klon HE12; 1: 200 zriedenie; Thermo Fisher Scientific, MA). Ventana BenchMark XT systém automatizované slide spracovanie bola použitá podľa protokolu výrobcu. Odborník patológ (KMK) zhodnotil výsledky

FISH HER2

FISH bola vykonaná s použitím dual-farebné DNA špecifické sondy z PathVision ™ (Abbott /Vysis :. LSI HER2 SpectrumOrange ™ a CEP 17 SpectrumGreen ™), ako už bolo popísané v prípadoch s nepresvedčivé zvýšenej expresie HER2. [19] Počítali sme hybridizácii signály v 20 jadier na vzorku pod fluorescenčným mikroskopom (Zeiss Axioskop) pomocou filtrov sady odporúčaných Vysis (DAPI /Spectrum Orange duálny pásmové, DAPI /Spectrum Green dual pásmovým). Všetky prekrývajúce sa jadrá boli vylúčené, a boli hodnotené iba jadra s výraznou jadrovej hranice. HER2
gén bol považovaný zosilnený, keď pomer FISH signál HER2 /CEP17
bol väčší alebo rovný 2,0 [20].

Real-time PCR pre KRAS a MET zosilnenie

sme použili DNA získané z FFPE karcinóm žalúdka nádorových tkanivách. Reakčná zmes obsahovala 2 uL genómovej DNA šablóny, 10 ul TaqMan univerzálnej PCR master zmesi (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) a 0,2 uM každého primeru. Pre presné zistenie zmien KN, sme analyzovali tri rôzne regióny Kras
génu: región vnútri intronom 1 (TaqMan počet kópií testu Hs06943812_cn), región vnútri IntronA 2 (Hs002534878_cn) a región vnútri exónu 6 (Hs02739788_cn). . U sa stretol
gén, sme použili priméry ako bolo opísané skôr [21]

sme merali počtom kópií zisk pomocou nasledujúceho profilu: 2 min pri 50 ° C, denaturácia pri teplote 95 ° C počas 10 min, nasledovalo 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C po dobu 1 min. Zistili sme relatívnej kvantifikácie za použitia rýchleho real-time systém 7900 HT PCR v štyroch vyhotoveniach. RNázaP Testovacia súprava (Applied Biosystems) bol použitý ako kontrola. Po zosilnenie, sme dovážané výsledky experimentov, ktoré obsahujú hodnoty prah cyklu pre daný počet kópií a referenčným testom do CopyCaller Software (Applied Biosystems) za post-PCR analýzu dát, ako bolo popísané vyššie. [22] sme priradený stav zisku CN a počet Kras
kópií založené na súlad výsledkov v najmenej dvoch z troch sond.

Analytické metódy

vylúčené sme všetky synonymické zmeny po automatizovaný mutácií volaní algoritmus bol použitý na detekciu mutácií domnelé. Opakujúce sa hovory vo viac ako 10 z 89 vzoriek bol považovaný za falošný poplach a boli vylúčení. Použili sme hodnôt cut-off o viac ako 6% variantov frekvenciou a viac ako X100 pokrytie odhaliť skutočné mutačné zmeny v súlade s predchádzajúcimi štúdiami a našej vlastnej skúsenosti. [9], [10] filtrovaný sme sa single-nucleotide polymorfizmy po ručnom skúmania každého polymorfizmu v Katalógu somatické mutácie v rakovine (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic~~HEAD=pobj) ( Postava 1). U známych génov zmutovaných v žalúdočných karcinómov ( TP53
APC
PIK3CA
STK11
CDKN2A
KRAS
Hraše
BRAF stroje a CTNNB1
), bola vykonaná manuálne preskúmanie automatické volacie výsledkov chytiť škodlivé mutácie sa mierne nízko- varianta frekvenciu.

Výsledky

Výsledky Ion AmpliSeq rakovina paneli

koncentrácie DNA, ich koncentrácia fold, priemer pokrytie vzoriek, celkový počet základní, > Q20 bázy, číta, znamená čítať dĺžku, mapované číta, on-cieľ sadzba (%), stredná hĺbka a konzistentnosť výsledkov sú uvedené v tabuľke S2. Celkovo sme získali 8178 variantné volanie z 89 vzoriek, z nich 3554 hovory boli non-synonymické zmeny. Po odfiltrovaní opakovaných volaní, < 6% variantné alela frekvencie, < 100X pokrytia a tie v regióne intronom, bolo vybraných 65 variantov volanie. Ďalej sme preverili automatizované volania v dobre známych mutácií, napríklad BRAF
KRAS stroje a PIK3CA stroje a mohol uložiť dva varianty hovory, ktoré boli v priebehu filtrovania vylúčené procesy. Tridsať deväť z 89 vzoriek (43,8%) kryl aspoň jednu mutáciu (obrázok 1). Dva prípady ukázali, 22 a 5 mutácie, resp. Druhý prípad kryl MLH1
somatickou mutáciu [missense mutácie v exóne 20: c.1147A > G (p.M383 V)] a MLH1
promotér hypermetylace so stratami MLH1 proteínu pomocou IHC vyššie popísané metódy [23], čo naznačuje, hyperzmutovanou nádor. Avšak, aj keď mutácie nájdené v prvom prípade prešiel varianty frekvencie a pokrytie cut off, tieto mutácie neboli potvrdené sekvenovaním Sanger, čo naznačuje, falošne pozitívne v tomto prípade z dôvodu zlej kvality DNA. Takže, tento prípad bol z konečných výsledkov analýz vylúčené. Často zistená somatické mutácie zahrnuté TP53
(24 prípadov, 27,0%), APC
(9 prípadov, 10,1%), PIK3CA
(5 prípadov, 5,6%), %), Kras
(3 prípady, 3,4%), SMO
(4 prípady, 4,5%), STK11
(3 prípady, 3,4%), CDKN2A
(3 prípady, 3,4%), a SMAD4
(3 prípady, 3,4%), ako je uvedené v tabuľke 2. Tabuľka 2 tiež zhrnuté zmeny aminokyselín v často mutovaných génov. Identifikovali sme 19 pacientov (21,3%) s dvoma alebo viacerými jedinečných a sprievodné somatických mutácií.

V štyroch vzorkách karcinómu žalúdka sa známou mutácií frekvenciou určených celé sekvenovanie exome a potvrdených Sangerovo sekvenovania sme identifikovali somatické mutácie v TP53
erbB4 stroje a CTNNB1
s žiadnymi falošne pozitívnych volania v iných génov (Tabuľka S3).

Amplification by NCounter a validáciu IHC, FISH alebo real-time PCR

zosilnením HER2
CCNE1
MYC
KRAS stroje a EGFR
gény boli pozorované u 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) a 1 (1,1%) prípadov, v danom poradí (tabuľka 3). Neboli sme prítomní zosilnenie o štatút trhového
FGFR2
CDK4 stroje a CDK6 v žiadnom z prípadov. V prípadoch s amplifikáciou, IHC pre HER2, EGFR a CCNE1 ukázal zvýšenú expresiu proteínov v nádorových bunkách (obrázok 2A, B a C). V jednom prípade s HER2 2+ strany HercepTest, FISH ukázala heterogénne zosilnenie HER2
génov (obrázok 2D).

v real-time PCR pre KRAS
jednom prípade s zosilnenie preukázali zvýšený počet kópií (36, 37 a 49); V prípadoch, ktoré boli negatívne na Kras
amplifikácie nedošlo k nárastu počtu kópií (0,9 až 2,4, priemer 1.4).

sa stretol
gén, nájdeme nie pozitívny prípad z dôvodu ich vzácnosti [21]. Z tohto dôvodu sme použili dodatočný desať (päť každý zosilnený a non-zosilnený) vzorky rakovina žalúdka a MET
zosilnený rakovinou žalúdka bunkových línií (MKN45 a SNU5) so známymi počtu kópií a mRNA sumy. CNVs detekovaný NCounter dobre korelovala s počtom kópií detekovanej real-time PCR (tabuľka S4) a mRNA úrovni THZ,
génu (porovnávacia skúška Pearsonovho; r = 0,874, p = 0,001). (Obr S2)

Diskusia

použitím Ion AmpliSeq v2 sme zistili, že 39 z 89 vyspelých vzoriek adenokarcinóme žalúdka obsahoval somatické mutácie, ktoré preukazujú, že táto platforma je ľahko použiteľná v archívnych vzoriek FFPE tkanív. TP53
bol najčastejšie mutácie, nasledovaný APC
PIK3CA stroje a KRAS
. Navyše naším zvykom CNV panel úspešne zistený nárast CN HER2
CCNE1
MYC
EGFR stroje a KRAS
gény, ktoré sme potvrdené IHC a real-time PCR

mutačné frekvencie v kozmickom databáze odhaliť značné podobnosti s údajmi sme získali z tejto štúdie :. TP53
(32%), PIK3CA
(10%), KRAS
(6%), APC
(6%), CTNNB1
(5%), CDKN2A
(5%), FBXW7
(5%), SMO
(4%), ErbB2
(2%) a STK11
(2%). Nedávne štúdie celá exome sekvencie v adenokarcinóme žalúdka ukázal niečo vyššie frekvencie TP53
(36% a 73%) a PIK3CA
(14% a 20%), mutácie v porovnaní s našimi výsledkami. [24], [25] Aj keď sú naše mutácie frekvencie boli nižšie v porovnaní s exome výsledkov sekvencovania, došlo k významnému nárastu v porovnaní s našimi predchádzajúcimi údajmi o hmotnostnú spektrometriu na báze OncoMap v4. [26] Obaja AmpliSeq a OncoMap detekciu mutácií v hotspot regiónoch, ktoré vysvetľujú zistenie menej častých mutácií v niektorých onkogénov a tumor supresorových génov. Obrázok S1 porovnáva AmpliSeq v2 a v4 OncoMap v zistiteľných mutačných profilov. Predchádzajúci OncoMap skúšky v 237 žalúdočnými adenokarcinómy bolo zistené, že PIK3CA
mutácie boli časté v pokročilých štádiách choroby (5,1% v prvej etape IV; 6,4% vo fáze II /III; 2,4% v štádiu IB). [26] V tejto štúdii sme zaznamenali tri PIK3CA
mutácie u pacientov s štádiu III a dvaja v chorobe v štádiu II, podporujúce ich biologickú úlohu v progresii nádoru. Tiež sme pozorovali HER2
( ErbB2
) c.2524G > A (V842I) mutácie v prípade rakoviny žalúdka. V predklinických štúdiách bunkovej línie nesúce mutáciu V842I boli rezistentné na trastuzumab, ale bol citlivý na ireverzibilné inhibítor HER2, neratinib [27].

polovodič na báze sekvenčnej má zásadné rozdiely v snímaní a prenose signálov v porovnaní s hmotnostnej spektrometrie založené sekvenovania. Namiesto použitia optických metód zisťovania zmien nukleotidov, technika polovodič na báze sníma zmeny pH od uvoľnenia protónov (H +), pokiaľ nukleotidy integrovať do rastúceho reťazca DNA. [8] Z tohto dôvodu dochádza k výraznému zníženiu nákladov a čas potrebný pre spracovanie dát v porovnaní s inými platformy NGS. Poskytuje rýchle a presné informácie o mutácie v nízkych nákladoch, je veľmi dôležité pre pacientov s vysoko agresívne rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka.

V tejto štúdii sme Ručná kontrola automatizované volania v dobre známych mutácií po aplikácii cutoff hodnoty frekvencie a pokrytie, následne pridanie dvoch volania s nízkym varianty pokrytia. Hoci ich hodnoty pokrytie nedosiahlo naše vstupné kritériá, ich frekvencia prekročila naše prvé nastavenie (6%) a kvalita dát bola dobrá. To zdôrazňuje význam manuálne kontroly po automatizované screening. Nedávno publikované výsledky s použitím AmpliSeq ako analyzujúceho platforma tiež zdôrazňujú kompenzáciu skríningových dát s manuálnou kontroly [9], [10].

Personalizované cielená liečba pre pokročilých rakoviny spolieha predovšetkým na koncepcii "onkogénu závislosti," v vďaka ktorým mnohonásobné a genetické abnormality sú závislí na jednom alebo niekoľkých málo génov pre údržbu a prežitie nádorových buniek. [28] Otvorená, skúšobné medzinárodné fáza 3, randomizovanej kontrolovanej Toga (Trastuzumab u rakoviny žalúdka) ukázala, že trastuzumab v kombinácii s chemoterapiou je nový štandard možnosť pre pacientov s pokročilým žalúdka alebo gastroezofageálneho rakoviny spojovacie HER2 pozitívne. [29] predklinické štúdia ukázala, že podmnožina karcinómov žalúdka s EGFR
alebo sa stretol
zosilnenie a nadmerná expresia reaguje na Cetuximab alebo splnil receptorové tyrozín liečbou inhibítorom kinázy. [30] Okrem toho amplifikácia prostredník bunkového cyklu CCNE1
naznačujú potenciálnu terapeutickú inhibíciu cyklin-dependentných kináz v karcinómov žalúdku. [31] Screening amplifikovanej gény pre cielenú terapiu s vysokou priepustnosťou technológie je veľmi dôležité. Tradičné metódy, ako sú ryby a polia komparatívna genomická hybridizácia trpia nízkym rozlíšením genomových oblastí, vysoké náklady a sú labor- a časovo náročné. [32] V prvej štúdii na NCounter CNV analýzy sme zistili, že táto technika je použiteľná v klinických vzorkách FFPE a my potvrdené výsledky podľa IHC, FISH a PCR v reálnom čase. Aj keď sme nemali overiť všetky gény použité v užívateľských priméry, výsledky validácie v niekoľkých vybraných génov boli pozoruhodné.

Stručne povedané, sme úspešne vykonal polovodič na báze sekvenčné spracovanie a NCounter CNV analýzy v tkanivových vzoriek FFPE od 89 žalúdočných adenokarcinómov. High-priepustnosť sekvenčné spracovanie a triedenie CNV v archívnych klinických vzoriek umožňuje rýchlejšie a presnejšie a nákladovo efektívnu detekciu hotspot mutácií a CNV v génoch. V ére personalizované genomickej medicíny, máme v úmysle používať tieto nástroje pre skríning pre pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí môžu mať prospech z cielených terapií.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Porovnanie pokrytie Ion AmpliSeq v2 panelu rakoviny v porovnaní s Oncomap v4
doi :. 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF)
Obrázok S2.
Pozemky korelácia medzi sa stretol
CNVs zistené úrovne NCounter a mRNA sa stretol
gén podľa real-time PCR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0111693.s002
(TIF)
tabuľke S1.
Gene Zoznam pre Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel
doi :. 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
tabuľke S2.
Koncentrácia DNA, ich koncentrácia fold, priemerné pokrytie vzoriek, celkový počet báz, > Q20 základní, číta, znamená čítať dĺžku, mapované číta, on-cieľ sadzba (%), priemerná hĺbka a jednotnosť.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
Tabuľka S3.
somatické mutácie v TP53
erbB4 stroje a CTNNB1
doi :. 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
Tabuľka S4.
CNVs detekovaný NCounter dobre korelovala s počtom kópií zistené real-time PCR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)

Other Languages