Ploche ONE: Zvýšená expresia autofagie spojené Gene-5 (ATG-5) je spojená s chemorezistence v žalúdku človeka Cancer

abstraktné

Autofagie súvisiace gén-5 (ATG-5), je jedným z kľúčových regulátory autophagic bunkovej smrti. To bolo široko považovaná za ochranný molekulárnej mechanizmus pre nádorové bunky v priebehu chemoterapie. V tejto štúdii sme skúmali expresné vzor ATG-5 a multidrug odporu spojeného proteínu-1 (MRP-1) v 135 karcinómov žalúdka (GC) u pacientov, ktorí boli liečení epirubicín, cisplatina a 5-FU adjuvantnej chemoterapie (ECF ) po chirurgickú resekciu a preskúmal ich možný klinický význam. Zistili sme, že obe ATG-5 (77,78%) a MRP-1 (79,26%) bol vysoko exprimovaný u pacientov s GC. ATG-5 expresie bola významne spojená s hĺbkou steny invázie, fázach TNM a vzdialené metastázy GC (P menšia ako 0,05), vzhľadom k tomu, MRP-1 expresie bola významne spojená s veľkosťou nádoru, hĺbka steny invázie, lymfatických uzlín, fázach TNM a stav diferenciácie (P menšia ako 0,05). ATG-5 Expresia v pozitívnej korelácii s MRP-1 (RP = 0,616, p 0,01). Zvýšená expresia ATG-5 a MPR-1 sa významne koreluje s chudobnými celkového prežitia (OS; P 0,01) a prežitie bez ochorenia (DFS; P 0,01) nášho GC kohorty. Ďalej sme preukázali, že ATG 5 sa podieľala na rezistentné na GC buniek, čo bolo najmä prostredníctvom regulačnej autofagie lieku. Naše údaje naznačujú, že up-regulovaná expresia ATG-5, čo je dôležité molekulárnej funkciu ochranného autofagie, je spojená s chemorezistence v GC. Expresie ATG-5 a MRP-1 môže byť nezávislé prognostické markery pre liečbu GC

Citácia :. J Ge, Chen Z, Huang J, J Chen, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) Zvýšená expresia Autofagie súvisiacich Gene-5 (ATG-5) je spojená s chemorezistence v žalúdku ľudskej rakoviny. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10,1371 /journal.pone.0110293

Editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Spojené štáty |

Received: 5. augusta 2014; Prijaté: 18.září 2014; Uverejnené: 17.října 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená Národná prírodná Science Foundation v provincii Hunan, Čína (č 2012FJ6088). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

aj napriek značné zníženie jeho miery výskytu v mnohých vyspelých krajinách, rakovina žalúdka (GC) zostáva štvrtú najčastejšie diagnostikovaný zhubný nádor, a druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete [1]. V priebehu posledných desaťročí, štandardné multimodálnych liečebných stratégií spolu s ostatnými odporúčanými možnosťami (napr D2 pitva a adjuvantnej chemoterapie) sa nepodarilo vyliečiť veľkú časť chorých s GC, najmä pre tie s pokročilými a metastatických ochorení s horšími prežitia stretávame pravdepodobne v dôsledku prítomnosti chemorezistence počas liečby [2]. Z toho dôvodu identifikácie nových molekulárnych udalostí, z ktorých vývoj tohto zhubného nádoru a jeho zlou prognózou, rovnako ako pochopenie mechanizmov GC chemorezistence sú naliehavo potrebné pre efektívnejšie klinickú intervenciu a lepšiu starostlivosť o pacientov.

Za fyziologických podmienok, autofagie je lysosom závislé self-trávenie systém primárne zodpovedný za likvidácie a recyklácie s dlhou životnosťou proteínov a poškodenie /zastarané intracellularorganelles, aby bola zachovaná bunkovej homeostázy [3]. Proteíny a organely cieľom ničenia sú zabavený v rámci "double-membránových" vacuoles (autofagozóm), nasledované fúzií s lyzozómov na výstavbu komplexov známe ako autofagozóm, kde sú obsahy degradované lysozomálnych hydroláza [4]. Bolo doložené, že autofagie by mohla byť indukovaná v závislosti na mnohých nepriaznivým podmienkam, vrátane živín deprivácia, oxidačným stresom alebo poškodenie DNA a slúžia ako adaptívne mechanizmus buniek, prípadne umožňuje bunkám prežiť a množiť, zatiaľ čo rozsiahle a perzistentné výsledky autofagie v bunkovej smrti [ ,,,0],5]. Poškodenie v fyziologickom aktivácie, montáž a funkcie autophagic dráhy čoraz viac pozorované v celej rade ľudských nádorov, aj keď presná úloha autofagie v rakoviny vzniku a progresie je stále diskusia. Niektoré údaje uprednostňujú myšlienku, že potláča autofagie tumorigenezi, zatiaľ čo iné dôkazy naznačujú, že autofagie je schopný vyvolať iniciácii nádoru a chráni nádorové bunky od apoptózu [6]. Je zaujímavé, že sa v poslednej dobe zistené, inhibícia autofagie zvýšiť protinádorovú aktivitu niekoľkými cytotoxickými látkami. Li et al uvádzajú, že autofagie bol aktivovaný ako ochranný mechanizmus proti bunkovej účinky na 5-FU liečbe a inhibíciu autofagie o 3-methyladenin rozšírené 5-FU-indukovanej apoptózy v rakovinových buniek hrubého čreva [7], [8]. Na druhej strane niektoré protinádorové látky (napr. Cetuximabu a Dasatinib), bolo preukázané, že indukujú autophagic bunkovej smrti prostredníctvom rôznych mechanizmov v niektorých nádorových buniek [9] - [13]. Molekulárna zariadenie, ktorým autofagie reguluje prežitie alebo smrť nádorových buniek zostáva z veľkej časti doteraz nejasná. Autofagie dráha je vysoko modulovaný dynamický proces prevažne vykonaný (ATG) rodina autofagie súvisiacich génov, ktoré sa riadi niekoľkými kľúčových kináz vrátane mTOR PI3K /Akt, AMPK a MAPK [14], [15]. ATG-5 je centrálny regulátor potrebné pre autofagie pokiaľ ide o jeho zapojenie do autofagozóm pretiahnutie [16]. Presadzovaná expresie ATG-5 senzibilizovaných nádorových buniek, aby protinádorová liečba drogovej obaja in vitro stroje a in vivo
; v kontraste siRNA-sprostredkovanú inhibíciu ATG-5 viedlo k čiastočnému rezistencie k chemoterapii [17]

Pooperačné adjuvantnej chemoterapie je v súčasnej dobe hlavným liečba GC .; Avšak, celková účinnosť chemoterapie je stále nedostatočná možno ako dôsledok prítomnosti rezistencie voči viacerým liečivám (MDR) fenotypu. Na rozdiel od iných nádorových subjektov, expresie klasických MDR-sprostredkujúcich molekúl, ako je napríklad glutatión-S-transferázy a mnohopočetné liekové rezistencie génu 1 nie je príliš prevláda v GC tkanivách, čo naznačuje, že by mohol byť zložitý mechanizmus pre rozvoj MDR v tomto malígneho ochorenia [ ,,,0],18]. Ako jeden z klasických mechanizmov odolných voči liečive, bolo zistené, multidrug rezistencia súvisiace s proteín 1 (MRP1 /ABCC1), ktoré sa silne exprimovaný v GC, a preto môže pôsobiť kľúčovú úlohu v sprostredkovaní MDR v GC [19], [20]. Je však známe, či MRP-1 expresie je spojená s ATG-5 expresie. A tiež to, či autofagie sa podieľa na chemoresistence u pacientov GC je nejasný.

V tejto štúdii sme najprv použitá imunohistochémia vyšetrovať expresného profilu ATG-5 a MRP1 v súčte 135 pacientov, ktorí dostávali GC ECF (epirubicín, cisplatina a 5-FU), adjuvantnej chemoterapie po chirurgickej resekcii. Korelácia medzi ATG-5 a MRP-1 expresiu, rovnako ako ich expresie s rôznymi vlastnosťami klinicko-GC a klinické výsledky boli hodnotené.

Materiály a metódy

Pacienti a vzorky tkaniva

celkom 135 pacientov GC pozostávajúce z 91 mužov a 44 žien, ktorí podstúpili operáciu na oddelenie gastrointestinálne chirurgia, nemocnice Xiangyu, stredné Južnej University (CSU), Číne, v období od 1. januára 2007 do 31. decembra 2008 boli zaradení do táto štúdia. Priemerný vek kohorty bolo 53.62 ± 9,73 rokov, s rozsahom 26 až 72. Theprimary GC nádoru tissuesand prispôsobené non-rakovinové tkanivá (NC) sa nachádza najmenej 5 cm od jadra nádoru boli získané po chirurgickej resekcii a okamžite spracované a uložené až do ďalšieho použitia. Žiadny z prijatých pacientov malo chemoterapiu alebo rádioterapiu pred chirurgickým zákrokom. Histopatologické Diagnóza bola vykonaná pred operáciou a potvrdené operáciu. Všetci účastníci sa stupeň IB IV nádorov prijaté ECF chemoterapiu po chirurgickom zákroku (Dávka: epirubicín 50 mg /m ^{2 v deň 1, cisplatina 60 mg /m 2 v deň 1 a kontinuálne intravenóznou infúziou 5-FU 500 mg /m 2 /d počas 4 dní, každé 3 týždne až 24 týždňov). Klinické charakteristiky týchto pacientov sú uvedené v tabuľke 1.}

Všetky prípady v tejto štúdii boli preskúmané a všetky vzorky boli histopatologicky preskúmaná v októbri 2012. Hĺbka steny invázie, regionálnych lymfatických uzlín, a histologického stupňa boli potvrdené rovnakej skupiny dvoch skúsených vedúcich patológov. Pacienti boli rozdelení na základe stavu diferenciácie rakovinových buniek do troch histologických stupne: dobre, mierniť a chudobnými. na kombináciu zapojenie loco-regionálnej nádoru a prítomnosť metastáz základe všetkých prípadoch bol predstavený v závislosti na TNM klasifikácie zhubných nádorov (TNM) Fáza zoskupenie [21]. Pre analýzu prežitie, dátum operácie bol používaný reprezentovať počiatočný bod pre následnú návštevou. Pacienti, ktorí zomreli iných chorôb skôr ako GC alebo iných neočakávaných udalostí boli z kolekcie prípadu vylúčená. Príčinou smrti prijatého v tejto štúdii bolo zhoršenie GC. Celkové prežívanie (OS) bola vypočítaná ako obdobie, ktoré sa začína odo dňa, keď počiatočného chirurgického zákroku do dňa úmrtia alebo odo dňa posledného nadväzujúcich ako koncový bod. Choroba prežitia bez (DFS) bol definovaný ako časový interval od operácie, až do okamihu lokálneho relapsu alebo prvý vzdialenej orgánových metastáz. Informovaný písomný súhlas bol získaný od každého pacienta pred operáciou a táto štúdia bola schválená etickou komisiou pre výskum strednej južnej univerzity, Čína. Všetky vzorky boli spracované a na anonymné v súlade s etickými a právnymi predpismi.

Imunohistochémia

Čerstvé vzorky boli fixované v 10% neutrálnom pufrovanom formalínu a následne vložený s parafínom. Tieto parafínových tkanivá boli narezané pri 4 um a potom zbavené parafínu a rehydratované xylénom pre ďalšie H &E, alebo peroxidáza imunohistochémia farbenie pomocou DAKO Envision systém. Stručne povedané, po proteolytické štiepenie a blokovanie endogénnej peroxidáza, tkanivá boli rezy inkubované s primárnymi protilátkami (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; abca Inc., Cambridge, UK), proti príslušných cieľových proteínov v riedení 1: 500 cez noc pri 4 ° C. Po premytí PBS, peroxidázou značené polymér a substrát-chromogén potom boli použité pre vizualizáciu na immnohistochemical farbenie. Nakoniec sa rezy boli kontrastne hematoxylínom, krycie skĺzol s montážnym médiom, a skúmané svetelnou mikroskopie. Všetky postupy boli vykonané na oddelenie patológie, Xiangyu nemocnice, C.S.U. Sklíčka bola interpretovaná nezávisle dvoma skúsenými patológov, ktorí boli slepí k informáciám pacientov. kvantifikované sme farbenie intenzitu a percento zafarbených buniek pomocou predtým popísaného prístupu [22], [23]: percento pozitívne zafarbených buniek (0% -100%), sa vynásobil intenzity vzoru dominantné farbenie, so zreteľom na 1 ako negatívne alebo vysledovať, 2 tak slabá, tri ako mierne a 4 tak silný. Preto celkové skóre pohyboval v rozmedzí od 0 do 400. Pacienti boli následne rozdelené do štyroch rôznych podskupín: skóre 0-99, skóre 100-199, 200-299 skóre a skóre 300-400

Western blot analýza <. br>

celej bunkovej extrakty boli pripravené s použitím 0,14 M Náci, 0,2 M trietanolamín, 0,2% deoxycholát sodný, 0,5% Nonidet P-40 a doplnenú s inhibítorom proteázy (všetky produkty boli od firmy Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Potom sa vzorka proteín bol prevádzkovaný až 12% dodecylsulfát sodný gélová elektroforéza sulfát-polyakrylamid (SDS-PAGE), gélu a prenesené na membránu. Prevedené Membrány boli potom inkubované cez noc pri 4 ° C s primárnou protilátkou. Po premytí bola membrána inkubovaná s chrenovou peroxidázou (HRP) viazanou sekundárnej protilátky po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Primárne protilátky boli anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (abca, Cambridge, UK) a anti-β-aktínu (Santa Cruz, CA, USA). Všetky uvedené výsledky sú priemerné hodnoty z troch rôznych nezávislých experimentov.

testu proliferácie buniek

Bunky boli vrúbľovať do 96-jamkových doštičiek (10000 buniek /jamku) po dobu 24 hodín pred ošetrením. MTT skúšky boli použité pre hodnotenie bunkovej proliferácie v inom časovom okamihu po ošetrení. MTT test bol vykonaný nasledujúcim spôsobom: MTT bolo pridané do každej jamky a doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C počas 4 hodín. MTT médium Zmes sa potom odstráni a 150 ul dimetylsulfoxidu (DMSO) bolo pridané do každej jamky. Absorbancia bola meraná pri 570 nm za použitia spektrofotometra viacvrstvové

RNA interferencie

duplexy siRNA cielené na ATG-5 boli syntetizované nasledujúcim spôsobom: siRNA-ATG5-486 :. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT a siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. duplexy siRNA obsahujúce non-špecifické sekvencie boli použité ako negatívna kontrola (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Rôzne siRNA boli transfekovány samostatne do buniek za použitia Lipofectamine 2000 činidlo, a medium bolo nahradené 6 hodín po transfekciu.

Real-time RT-PCR

Celková RNA z bunkovej línie a tkanivá boli extrahovaná TRIzolu činidlo (Invitrogen, Carlsbad, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Koncentrácia RNA sa merala pomocou spektrofotometra. CDNA bazén sa syntetizuje za použitia 1 ug celkovej RNA a TaqMan reverznej transkripcie činidiel (Applied Biosystems, Foster City, USA), ako je popísané výrobcom. Expresia cieľového génu bola hodnotená pomocou relatívnej kvantifikácie prístup (2 ^{-ΔΔCt metóda) s beta-aktínu ako vnútorná referencia.}

Imunofluorescenčný test

Bunky boli permeabilizovány 0,3 % Triton X-100 po dobu 10 minút s následnou fixáciou s 2 až 4% formaldehydu po dobu 15 minút a blokované 3% ovčieho séra pri teplote miestnosti po dobu 60 minút. Potom, sondovania s primárnymi protilátkami anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) cez noc pri teplote miestnosti, a bunky boli premyté trikrát s PBS. Farbené Alexa Fluór 488 488 konjugovanej králičie anti-kozí IgG po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a potom boli bunky trikrát premyté PBS. Jadrá bola vizualizované farbením DAPI (Sigma, USA) po dobu 2 minút. Zafarbený Bunky boli pozorované v tvare obráteného fluorescenčným mikroskopom.

Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvérového balíčka SPSS 15.0 pre Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitatívne údaje boli prezentované ako priemer ± SD. Pearsonov χ ^{2 test bol použitý pre porovnanie rozdielu medzi zoradených dát, zatiaľ čo jednocestné ANOVA test bol vykonaný pre porovnanie rozdielu medzi kvantitatívnych dát. Prežitie analýzy boli vykonané pomocou metódy Kaplan-Meier a porovnané pomocou log-rank testu. Cox-regresný model bol vykonaný pre vyhodnotenie nezávislú pomer rizika každej premennej v viacrozmerné analýzy. Korelácia medzi ATG5 a MRP1 prejavu bola skúmaná pomocou Bivariate korelačný test (Pearson). Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri P
hodnoty boli menšie ako 0,05.}

Výsledky

Vyjadrenie ATG-5 a MRP-1 v GC

výraz vzor a umiestnenie ATG-5 a MRP-1 u našich pacientov GC, ktorí boli liečení epirubicínom, cisplatinou a 5-FU adjuvantnej chemoterapie (ECF) po chirurgickej resekcii, boli skúmané pomocou imunohistochemické analýzy. Medzi GC vzoriek 135, 105 (77,78%) bolo pozitívnych na ATG-5 imunoreaktivity, a 107 (79,26%) bolo MRP-1 pozitívne. Ako je znázornené na obrázku 1, sme zistili, že ATG5 bol exprimovaný prevažne v cytoplazme. Okrem toho, nadmerné expresie ATG-5 v pozitívnej korelácii s tým MRP-1 v GC. (R = 0,616, P Hotel &0,001), ako sa zistilo pomocou testu bivariate korelácia. Pozitívne expresie v priľahlých non-rakovinové tkanivá boli 113 (83,70%) za ATG-5 a 89 (65,93%) pre MRP-1. Dáta ukazujú, že ako ATG-5 a MRP-1 pozitívne exprimovaný v rakovinových a non-rakovinové tkanivá, ktoré naznačujú, že ATG-5 a MRP-1 môže byť vyvolaná chemoterapiou ako v nádorových a nenádorových tkanív. Ako všetky naše vzorky od pacientov bolo liečených ECF chemoterapiu, a zistili sme, že obe ATG-5 a MRP-1 bol vysoko exprimovaný a pozitívne koreluje v týchto vzorkách. Medzitým, predchádzajúce štúdie ukazuje, že MRP-1 možná spojené s mnohopočetné liekovej rezistencie v GC. Spolu s predchádzajúcim zistením, naše výsledky naznačujú, že ATG-5 a MRP-1 môžu byť zapojené do chemorezistence u pacientov s GC.

asociácie medzi expresiou ATG-5 alebo MRP-1 a klinicko-charakteristiky GC

združenia ATG-5 a MRP1 expresie rôznych klinicko parametre GC sú uvedené v tabuľke 1 a tabuľke 2, v danom poradí. Expresie ATG-5 bola významne spojená s hĺbkou steny invázie, vzdialených metastáz a fáz TNM GC ( P Hotel < 0.001, P
= 0,018, P
a 0,001 v tomto poradí). MRP-1 expresie bola významne spojené so zvýšeným veľkosti nádoru, hĺbka steny invázie, regionálnych lymfatických uzlín metastáz TNM štádia ( P
= 0,032, P Hotel < 0,001, P = 0,016, P < stav diferenciácie 0.001 v tomto poradí) a ( P
= 0,005). Ak chcete ďalej určiť zapojenie Ø f ATG-5 a MRP-1 pri vývoji GC sme vykonali analýzu prežitie v našich vzoriek od pacientov. Naše prežitie analýzy preukázali, že celková celkové prežívanie (OS) miera našej GC súboru bola 43,70% s priemerným prežitím 39.849 mesiacov (95% CI, 35.636-44.061 mesiacov); vzhľadom k tomu, prežitie bez ochorenia (DFS) predstavovala 34.07% s priemerným prežitím 35.802 mesiacov (95% CI, 31.618-39.986 mesiacov). Ďalej sme klasifikovali pacientov do štyroch rôznych podskupín na základe výsledkov imunohistochémia farbenie. Analýza prežitie Kaplan-Meier odhalila vyššiu ATG-5 expresie bola významne spojená s horšou OS ( P Hotel < 0,001) a DFS ( P
= 0,003). Párové porovnanie je uvedené, že pacienti nesúci najvyššej ATG-5 expresiu (body 300-400) mal najchudobnejšie prežitie v porovnaní s tým iných podskupín (obrázok 2A a 2B). Dôsledne sa zistilo, že up-regulovaná MRP-1 výraz, ktorý má byť významne spojené so zlou OS ( P
= 0,001) a DFS ( P
= 0,018) našich pacientov GC. Podskupina s najvyšším skóre MRP1 expresie (0-99) sa zdá majú najhoršiu prognózu (obrázok 2C a 2D), v porovnaní s inými podskupinami. Naše dáta tiež ukazujú, že existuje významná korelácia medzi TNM etáp a prežitia pacientov s GC. Pacienti s štádia III a IV nádory zobrazená horšiu prognózu v porovnaní s tými, prechovávanie stage IB a nádory II ( P < 0,01
) (obr 2E a 2F). Zaujímavejšie viac premennými nebezpečenstvo regresný model Cox je preukázané, že ATG-5 a MRP-1 expresné hladiny a štádia TNM boli všetky nezávislé a významné prognostické ukazovatele pre predpovedanie OS ( P
= 0,037, P
= 0,005, P Hotel < 0,001 v uvedenom poradí) a DFS ( P
= 0,004, P
= 0,008, P Hotel < 0,001 v tomto poradí) GC (tabuľka 3). Naše dáta ukázali na ATG-5 a MRP-1 boli úzko súvisí s rozvojom GC a môžu slúžiť ako markery zlou prognózou pri liečbe GC.

ATG-5 bola významne up-regulovaná v chemorezistent- bunkách

ďalej preskúmať úlohu ATG-5 vo vzniku nádorov a odolný lieku. Zistili sme expresiu proteínu v niekoľkých žalúdočných rakovinových bunkových línií (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP a MKN45) a imortalizované ľudské žalúdočnej sliznice epitelové bunkové línie (GES). Zaujímavé je, že sme zistili, že ATG-5 bol výrazne nadmerne exprimovaný u DPP rezistentné bunkové línie, SGC7901 /DPP buniek, v porovnaní so všetkými ostatnými bunkových línií, ktoré obsahujú citlivé DPP SGC7901 buniek (obrázok 3a). Ďalej bolo potvrdené, že SGC7901 /DPP bunky sú rezistentné na liečbu DPP. IC 25, IC 50 a IC75 boli 15,4 uM, 38,7 uM a 93,53 uM v SGC7901 bunkách. Na rozdiel od toho IC 25, IC 50 a IC75 boli 120.03 uM, 271,9 uM a 423.7 um SGC7901 /DPP (obrázok 3B). Je to o 5 až 9 krát vyššia ako v bunkách rezistentných non-drog. Naše zistenia naznačujú, že ATG-5 prispieva k odolným z GC buniek lieku.

Inhibícia ATG-5 senzibilizovaných chemorezistent- buniek na liečbu drogovej závislosti

Ak chcete ďalej dokazujú, že ATG-5 prispieva k odolný z GC buniek liek, sme použili malé interferujúce RNA (siRNA) sa porazený expresiu ATG-5. Tri siRNA boli navrhnuté. Náš PCR v reálnom čase a výsledky Western blot ukázala, že všetky tri siRNA inhibovala expresiu ATG-5 tak na úrovni mRNA a proteínové úrovni (obrázok 4A a 4B). Vybrali sme jeden, siRNA-ATG5-695, s najvyššou účinnosťou smiešne nízke vykonať nasledujúci experiment. porazený sme ATG-5 výraz a potom sa spracuje buniek s DPP. Proliferácia buniek bola skúmaná schopnosť v 0, 48 a 72 hodín po ošetrení. Náš výsledok ukázal, že knockdowning ATG-5 neovplyvnila bunkovú proliferáciu v SGC7901 /DPP buniek v porovnaní s kontrolnou siRNA (siRNA NC). Liečba DPP sám mierne inhibuje proliferáciu buniek. Je zaujímavé, že keď porazený expresiu ATG-5 a spracuje buniek s DPP súčasne sa proliferácie buniek schopnosť sa ďalej potlačená v porovnaní s bunkami ošetrenými DPP sám 48 a 72 hodín po ošetrení (obrázok 4 ° C). Naše dáta ďalej potvrdzujú, že ATG-5 prispieva k lieku rezistentné na GC buniek.

Autofagie bol zapojený v droge odolného DC bunky

Ako ATG-5 je centrálny regulátor autofagie, sme špekulovalo, že autofagie môžu byť zapojené do rezistentné na GC buniek. Takže sme použili 3 mA, inhibítor autofagie na liečbu rezistentných buniek drog. Ako sa dalo očakávať, sme zistili, že 3mA spolu s liečbou DPP mal podobný efekt s ATG-5 kncokdown spoločne s liečbou DPP (obrázok 4C a 4D). Tieto údaje ukazujú, že autofagie prispieva k rezistentné. Potom sme skúmali, či autofagie bola zmenená v priebehu liečby. Použili sme Imunofluorescenčný testu na detekciu hladiny LC3B expresie, čo je autofagie markeru v bunkách. Naše dáta ukázali, že autofagie bol potlačený po umlčanie ATG-5 alebo spracovaním buniek s 3 mA (Obrázok 5A). A western blot výsledok ďalej potvrdzuje, že expresia proteínu LC3A /B bola ovplyvnená iba v bunkách ošetrených siRNA-ATG5 alebo 3 mA. V súlade s tým, bunková proliferácia bola inhibovaná ďalej len vtedy, keď sa autofagie inhibovaná (na obrázku 4 a obrázok 5). Preto naše dáta ukázali, že ATG-5 bol zapojený do rezistentné DC buniek, ktorá bola hlavne cez vplyv na autofagie nádorových buniek.

Diskusia

GC zostáva jedným z najviac časté zhubné nádory v celosvetovom meradle aj napriek jeho klesajúcej incidencie a celkového počtu predpokladá sa neustále stúpať v dôsledku rastu počtu obyvateľov. U mužov, GC zaujíma druhé miesto v mierou úmrtnosti; u žien, to je štvrtý úmrtnosti [24], [25]. Surový Úmrtnosť GC v Číne bola 25,2 na 100 000 [26]. V našej štúdii sme skúmali expresiu ATG-5 a MRP-1 v kohorte GC chorého po chemoterapii. Potom sme preukázali, že ATG-5 bola up-regulovaná v cisplatinou (DDP) rezistentné bunkové línie. Okrem toho, po tom, čo bola inhibovaná ATG-5 expresie alebo aotophogy, rakovinové bunky boli citlivejšie na liečbu DPP. Naše výsledky poskytujú nový pohľad na mechanizme chemorezistentního progresie GC.

Hodnotili sme profil exression ATG-5 a MRP-1 u 135 pacientov čínskych GC. V súlade s predchádzajúcej správe [22] Naše výsledky ukazujú, že vysoké percento GC tkanív vyjadrená ATG-5, a ATG-5 expresie bola štatisticky spojená s hĺbkou steny invázie, vzdialených metastáz a TNM fáz GC. Tieto nálezy podporujú predstavu, že vysoká hladina expresie ATG5 môže prispieť k určitej miery, agresívnejší a malígneho fenotypu v GC. Toto hľadisko je ďalej podporená naším zistením súvislosti medzi vyšším ATG5 prejavu v GC a horšie prognózou pacientov (viac pozri opis nižšie). Ešte dôležitejšie je, sme zistili pozitívnu koreláciu medzi ATG-5 a MRP1 expresiu v našej GC kohorty. Vzhľadom na to, že MRP1 je ABC transmembránový transport proteínu dobre známe, že podporujú fenotyp MDR v GC, je rozumné navrhnúť, aby ATG-5 môžu byť tiež zapojené do udelenia GC chemorezistenci určitými neznámych molekulárnych mechanizmov.

je všeobecne uznáva, že recidíva a metastázy sú dve hlavné prekážky v našom úsilí o zlepšenie nízkou OS a DFS miery prežitia GC. Chemorezistence zostáva jedným z najdôležitejších dôvodov vedúcich k nádoru opätovnému zaplneniu /recidívy po liečbe. Príslušnú možnosť individuálneho prístupu bude nepochybne prínosom k zlepšeniu klinického výsledku; Avšak, aktuálne rozhodnutie liečba je väčšinou závislá na stupňoch TNM [27], [28]. Naše prežitie analýzy u pacientov GC 135 s stage IB IV nádory odhalila, že obaja ATG-5 a MRP-1 expresie boli schopní samostatne predpovedať OS a DFS po liečbe adjuvant ECF chemoterapia, čo naznačuje, že monitorovanie ich hladiny expresie v kombinácii konvenčné prognostické markery nám môžu poskytnúť dodatočné cenné informácie pre lepšie zhodnotenie účinku chemoterapie u pacientov s GC. Zaujímavé je, že sme zistili, ATG-5 bol nadmerne vystavený u rezistentné GC bunkových línií. A umlčanie ATG-5 môže znovu citlivé na rezistentné bunky droga chemoterapie. Naše údaje naznačujú, že ATG-5 môže byť terčom chemorezistent- paitents.

Hromadí sa dôkazy navrhol, že autofagie je schopný vyvolať aj prežívanie buniek a bunkovú smrť v rámci rôznych kontextoch. Liu et al uvádzajú, že prostredníctvom inhibície PI3K /Akt /mTOR, β-elemen by mohlo vyvolať ochrannú autofagie pomáhať GC buniek lepšie prispôsobiť stresovým podmienkam a chrániť ich pred podstupujú apoptózu smrť [29]. Navyše nedávne štúdie ukázali, že PI3K /Akt /mTOR signálne dráhy je často aktivovaný v ľudských gastrointestinálnych malignít [30]. Signalizácia PI3K /Akt tiež moduluje MDR v GC bunke prostredníctvom regulácie p-glykoproteínu, bcl2 a Bax [31]. Podobne niektoré protirakovinové látky boli hlásené inhibovať mTOR signalizáciu a indukovať autofagie v rakovinových bunkách degradáciou mnoho významných zložiek v mTOR osi [14], [32]. Celkovo tieto údaje ukazujú, že autofagie by mohla byť indukovaná počas chemoterapie, a potláčanie autophagic dráh s použitím inhibítora autofagie majú potenciál pre zlepšenie chemoterapeutickej účinnosti u pacientov s GC ATG-5 vysokú expresiu. Na podporu, sme zistili, že keď sa autofagie inhibovaná, bunky odolné liekov boli tiež citlivé na liečbu drogovej závislosti opäť umlčanie ATG-5 expresiu. Tak, naša podpora výsledok, ktorý prispieva k autofagie chemorezistentním v pacientovi.

V súhrne, zvýšená expresia ATG-5, čo je kľúčový molekulárnej hráčom autophagic dráhy, je spojená s chemorezistence v GC. Expresie ATG-5 a MRP-1 by mohli byť považované za nezávislé prognostických markerov pre predikciu OS a DFS pacientov GC na základe aktuálne získaných dát. Na základe TNM fáz, detekcia ich expresných hladín môže byť klinicky významný pre lepšiu predikciu chemoterapeutických liečebných výsledkov pacientov trpiacich týmto malígnych ochorení. Budúce štúdie zahŕňajúce posúdenie väčšieho počtu prípadov, v ideálnom prípade z iného etnického pôvodu, sú určite oprávnené potvrdiť naše zistenia v tejto štúdii.

• Ploche ONE: Porovnanie operatívne výstupov a zaučenie medzi laparoskopickej a robotickej gastrektómia pre rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: Predikcia žalúdočné vzniku rakoviny sérom pepsinogénu Test a Helicobacter pylori séropozitivity vo východných Ázijcov: systematická kontrola a Meta-Analysis