Ploche ONE: histondeacetylasy HDAC4 podporuje karcinóm žalúdka SGC-7901 bunky progresie cez p21 represie

abstraktné

Karcinóm žalúdka (GC) je jednou z hlavných príčin úmrtí na rakovinu vo svete. Bolo zistené role histondeacetylázy 4 (HDAC4) vo špecifických buniek a tkanivových typov. Avšak, jeho biologická úloha v rozvoji rakoviny žalúdka zostáva z veľkej časti nepreskúmané. Kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR) a western blot sa použili na analýzu expresie HDAC4 v klinických vzorkách. siRNA a nadmerná expresia HDAC4 a siRNA p21 boli použité na štúdium funkčné účinky na množenie, formácie kolónie, je adenozín 5'-trifosfátu (ATP) a test reaktívne formy kyslíka (ROS) generácie, bunkový cyklus, apoptózu ceny a autofagie testy. HDAC4 bola up-regulované v žalúdočných rakovinových tkanivách a niektorých nádorových bunkových línií žalúdka. Šírenie, kolónie útvar schopnosti a hladina ATP bola vylepšená v HDAC4 nadmerná expresia buniek SGC-7901, ale inhibuje v HDAC4 Knockdown SGC-7901 bunky. HDAC4 porazený viedlo k zatknutiu bunkovej G0 /G1 fázy a spôsobila apoptózu a nárast ROS. Okrem toho sa zistilo, HDAC4 k potlačeniu expresie p21 v nádorových bunkách žalúdku SGC-7901. p21 porazený výrazne oslabený inhibíciu bunkovej proliferácie, bunkového cyklu, podporu bunkovej apoptózy a autofagie up-regulácia v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek. Preukázali sme, že HDAC4 podporuje progresiu žalúdočné rakovinové bunky sprostredkované skrze represiu p21. Naše výsledky poskytujú experimentálny základ pre pochopenie mechanizmu pre-tumoru HDAC4 ako liečba rakoviny žalúdka

Citácia :. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histondeacetylasy HDAC4 podporuje rakovina žalúdka SGC-7901 Cells Priebeh cez p21 represie. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10,1371 /journal.pone.0098894

Editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Čína

Prijaté: 12. februára 2014; Prijaté: 08.05.2014; Uverejnené: 04.06.2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený grantom od ministerstva zdravotníctva provincii Jilin (č 2012z119). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou zhubné bujnenie a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete [1]. Ázijské a juhoamerickej krajiny majú vyššiu mieru výskytu GC než Spojené štáty a západnej Európy [2]. Väčšina cielenej liečby sa zameriavajú na vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) a receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR) súvisiacich s indikáciou v pokročilom GC. Zlúčeniny proti nových cieľov, ako je mTOR [3], c-Met (rastový faktor hepatocytov receptor) [4], a HDAC, sú tiež predmetom výskumu.

histondeacetylázy 4 (HDAC4), čo je trieda IIa HDAC, je známe, že existujú v odlišných transkripčných corepressor komplexov. HDAC4 je rozhodujúci zložkou dráhy odpovede na poškodenie DNA, ktorá pôsobí prostredníctvom 53BP1 [5]. HDAC4 potláča expresiu inhibítora kinázy p21 cyklin-dependentnej (tiež známy ako p21WAF1 /Cip1) v ľudských nádorových bunkách pomocou SP1 závislé, p53-nezávislé na mechanizme [6]. HDAC4 podporuje rast rakovinových buniek hrubého čreva cez represiu p21 [7]. Inaktivácia HDAC4 o malé interferujúce RNA alebo inhibítory HDAC potláča neurónové bunkovej smrti [8].

Úloha HDAC4 v konkrétnych bunkách (Hela (rakovina krčka maternice), U373 (glióm), OVCAR (vaječníkov), T98G ( glióm), HCT116 (kolorektálny), NHA (astrocyt) a SKBR3 (prsníka)) a tkanivá (kôra mozgová, semenníkov, prostaty, a epidermálnej vrstvy kože), je stále viac zrejmé, [9]. Avšak presný mechanizmus HDAC4 u karcinómu žalúdka nebola stanovená. Z tohto dôvodu je cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť prvú expresných hladín HDAC4 v rakovina žalúdka u tkanív a bunkových línií. Po druhé, účinok na žalúdočné HDAC4 nádorových bunkových línií bola skúmaná pomocou nadmernej expresie a vyraďujúce. Nakoniec sme skúmali, či HDAC4 mal vzťah s p21 do buniek karcinómu žalúdka. Spoločne Naším cieľom bolo zistiť, či HDAC4 má biologickú úlohu vo vývoji GC a objasniť základný mechanizmus.

materiáloch a metódach

Tkanivové vzorky

Dvadsať deväť spárované primárny karcinóm žalúdka tkaniva a vzdialených normálne žalúdočné tkaniva boli získané od pacientov (vek: 58,46 ± 9,17 rokov), počas rutinného liečebného zákroku v oddelení gastrointestinálne operácií, prvá nemocnica Jilin univerzity. Všetky vzorky boli získané s informovaným súhlasom podľa Helsinskej deklarácie a schválená etickou komisiou Human prvého nemocnice Jilin University a University Jilin, PR Čína. Písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov.

Bunkové línie a kultúra

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC-7901, AGS, a BGC-823 a normálne žalúdočnej epitel bunková línia GES boli získané z American Type Culture Collection (Manassas, VA) a kultivujú sa v médiu RPMI 1640 s 10% fetálneho hovädzieho séra vo vlhkej atmosfére 5% CO _{2 pri teplote 37 ° C.}

stabilný transfekované bunkové línie a prechodná transfekcia

HDAC4 fragment plnej dĺžky bola amplifikovaná pomocou reverzný transkripčný PCR z GES buniek s použitím špecifických primerov, ako bolo opísané skôr [10], a vloží sa do miest BamH i a Hind III, pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, UK). PCDNA3.1 (+) - HDAC4 plazmidu bola overená sekvenčnou analýzou pre potvrdenie absencie mutácií. SGC-7901 bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek a transfekovány s pcDNA3.1 (+) - HDAC4 a pcDNA3.1 (+) - vektory, v danom poradí, s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), podľa návodu za predpokladu, výrobcom po dobu 24 hodín bez antibiotík výberu. Potom boli bunky kultivované v médiu obsahujúcom 400 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO), kým všetky bunky v kontrolnej kultúre netransfekovanými boli zabité.

bunky SGC-7901 boli vrúbľovať na 6-jamkové doštičky a potom transfekovány non-zacielenie siRNA alebo siRNA namierenou proti ľudskému HDAC4 alebo p21 (Santa Cruz) s použitím Lipofectamine 2000 podľa pokynov poskytnutých výrobcom. Strečové experimenty boli vykonávané na bunkách 48 alebo 72 hodín po transfekciu.

Izolácia RNA a kvantitatívnej PCR v reálnom čase (QRT-PCR)

Celková RNA bola izolovaná z tkanív alebo buniek TRIzolu činidlá ( Invitrogen), a reverzné transkripcie boli vykonané za použitia Takara RNA PCR kitu (Takara, Dalian, Čína) podľa návodu výrobcu. Kvantitatívne PCR bola vykonaná za použitia SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japonsko), v reálnom čase, PCR systému (Eppendorf, Nemecko). Relatívny pomer expresie v každej párové nádorové a nenádorové tkaniva bola vypočítaná 2 ^{-ΔΔCT spôsobom.}

Spočítanie buniek kit-8 (CCK-8) Test

proliferácie z SGC-7901 buniek bola hodnotená pomocou CCK-8 testu (Beyotime, Jiangsu, Čína), podľa protokolu odporúčaného výrobcom. V stručnosti, bunky boli kultivované v 96-jamkové doštičky v koncentrácii 2000 buniek na jamku. Pri 0 ° C, 1, 2 a 3 dni po transfekciu, test proliferácie buniek bola vykonaná pridaním 10 ul CCK8 roztoku do každej jamky, s následnou inkubáciou pri 37 ° C po dobu 2 hodín. Absorbancia bola meraná pomocou ELISA readeru pri vlnovej dĺžke 450 nm.

Colony testu tvorenie

Stručne, HDAC4-zvýšenou expresiou a -knockdown SGC-7901 bunky boli schovať trojmo (1000 buniek na 60 mm kultivačné misky) a inkubované pri 37 ° C po dobu dvoch týždňov za vzniku klonov. Bunky boli premyté PBS, fixované 4% paraformaldehydom po dobu 15 minút, a zafarbené kryštálovou violeťou (0,5% kryštalickej fialovej, 1% paraformaldehydu a 20% metanolom v PBS) po dobu 30 minút. Kolónie na každej doske boli spočítané a prežívanie buniek sa vyjadril ako percento počtu prežívajúcich kolónií na kontrolných dosiek.

bunkového cyklu analýza

Bunky boli zozbierané a resuspendované do opatrne jednobunkové suspenzie vo fluorescencie Activated Cell triedenia (FACS) pufra (PBS obsahujúce 2% FBS). Bunky boli premyté dvakrát PBS a fixované v chladnom 70% cez noc etanolu. Bunky sa potom dvakrát premyjú studeným PBS, resuspendované v RNázou a roztok bol inkubuje sa s ním počas 30 minút pri 4 ° C. Suspenzia bola pridaná k 0,05 mg /ml propidium jodidu (Beyotime), s následnou inkubáciou pri teplote 4 ° C počas 30 minút a analýzu s použitím FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

apoptózu test

Propidiumiodide (PI, 1 ug /ml) a annexin v-FITC (1 ug /ml) boli použité pre stanovenie bunkovej apoptózy. V stručnosti, bunky boli trypsinizovány a inkubované s PI a annexin V-FITC počas 15 minút pri teplote 37 ° C. Vzorky boli detekované s použitím prietokového cytometra FACS Calibur. Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach.

Intracelulárne adenozín-5'-trifosfát (ATP) v krvi test

hladiny intracelulárneho ATP boli testované za použitia Bioluminiscencia [11]. V stručnosti, bunky boli lyžovanie a centrifugovány pri asi 15000 g počas 10 minút pri teplote 4 ° C. Supernatanty sa potom zmieša s pracovného roztoku ATP testovanej zmesi (Sigma), a množstvo svetla emitovaného bola okamžite meraná pomocou luminometra (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). Údaje boli normalizované luminiscencie vzorkou proteínové množstvo (merané pomocou testu BCA).

Reaktívne formy kyslíka (ROS) meranie

Generácia intracelulárneho ROS bola skúmaná za použitia 6-karboxy-2 ' , 7'-dichlór-diacetát (H _{2DCFDA). V stručnosti, 5 x 10 ^{4 bunky boli nanesené na 60-mm misky a ponechané prichytiť sa cez noc. Bunky boli zafarbené s 5 uM H 2DCFDA počas 30 minút pri teplote 37 ° C a potom sa oddelí, a fluorescencie bola analyzovaná fluorescenčným spektrometrom (Flex StationII 384, Molecular Devices) pri 485 nm (excitácia) a 538 nm ( emisie). Bunkovej úrovni okysličovadlá boli vyjadrené ako relatívna fluorescencie za DCF proteínových množstvo vzoriek (metóda BCA). V niektorých experimentoch boli bunky vopred s 10 mM N
-acetylcysteine ​​(NAC) pred analýzou ROS generácie.}}

Western blot analýza

Bunky sa lyžovali v OV lyzačný pufer (Beyotime), denaturujú počas 10 minút pri 95 ° C, strihaný s inzulínu injekčnou striekačkou, a rozdelené na SDS /PAGE géloch. Po-chémiou boli membrány blokované a inkubované s primárnymi protilátkami v PBS /0,1% Tween-20 s 5% netučného sušeného mlieka. Protilátky namierené proti HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, ATG 7, kaspázy 3, 9, Bcl-2, Bax a anti-p-aktínu boli všetky zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Chemoluminiscenčný detekcia bola testovaná s použitím detekčnej súpravy ECL (Pierce, Rockford, IL, USA). Výsledky boli analyzované za použitia množstvo, One softvér pre získanie pomeru optickej hustoty cieľového proteínu na beta-aktínu.

Imunofluorescenčný

Bunky boli nanesené na krycie sklíčka, fixované 4% paraformaldehydom (Sigma Aldrich) po dobu 10 minút a permeabilizovány 0,1% Triton X-100 /PBS. Bunky boli blokované 1% BSA po dobu 1 hodiny, nasledovala inkubácia po dobu cez noc pri teplote 4 ° C s anti-LC3 protilátkou, a potom boli bunky inkubované s FITC-konjugovanou sekundárnou protilátkou (Beyotime) po dobu 1 hodiny. Jadrá bola farbená 4,6-diamidínov-2-fenylindolem (DAPI; Sigma). Fluorescencia imaging bol vizualizovaný s použitím konfokálního laserového skenovacieho mikroskopu (značky Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko).

Štatistická analýza

Všetky dáta sú reprezentatívne najmenej z troch nezávislých experimentov. Dáta sú prezentované ako priemer ± S.E.M. Štatistická významnosť bola vypočítaná pomocou jednocestnej analýzy variance (ANOVA), alebo pomocou Studentovho t-testu medzi dvoma skupinami s použitím GraphPad Prism 5 štatistického softvéru. P
hodnoty. ≪ 0,05 boli považované za významné

Výsledky

HDAC4 vyjadrenia boli up-regulovaná v žalúdočných rakovinových tkanív a bunkových línií

Po prvé, analyzoval HDAC4 expresie v dvadsiatich deviatich spárovaný rakovinou žalúdka a okolitom normálnom tkanív pomocou QRT-PCR analýzu a westernovým prenosom. Zistili sme, že HDAC4 bola významne up-regulovaný v žalúdočnej tkanive karcinómu (obrázkoch 1A, B a C, ** P
< 0,01, *** P Hotel &0,001). Navyše boli tiež analyzované niekoľko žalúdočné nádorových bunkových línií. Pozorovali sme vyššiu expresiu HDAC4 v troch žalúdočných rakovinových bunkových línií (AGS, BGC-823 a SGC-7901), v porovnaní s normálnou žalúdočnej epitel bunkové línie (GES) (obr 1D a E, * P Hotel <0,05, ** P Hotel &0,01). Preto sú naše výsledky preukázali, že HDAC4 expresie boli up-regulovaná v oboch žalúdočnej rakovinových tkanív a bunkových línií.

Výraz HDAC4 bola úspešne stiahnuté alebo up-regulované v SGC-7901 bunky

pcDNA3.1 (+) expresné vektor bol použitý pre nadmernú expresiu HDAC4 v SGC-7901 buniek s cieľom posúdiť jeho účinnosť ako regulátor rastu. Po stabilný transfekciu, výraz úrovňou HDAC4 mRNA bol hojnejší v pcDNA3.1 (+) - HDAC4 bunkách ako v non-transfekovány bunky alebo negatívne kontrolou (NC) SGC-7901 bunkách (obrázok 2A, ** * P
. < 0,001), čo bolo v súlade s výsledkom analýzy western blot (obrázok 2B)

Pre vyhodnotenie gén-tlmenie hluku účinnosť ľudského HDAC4-siRNA, rozsah expresie proteínu bola HDAC4 merané po HDAC4-siRNA transfekcia a inkubačnej dobe 48 h do ľudského karcinómu žalúdka bunkové línie SGC-7901. Real-time PCR analýza ukázala, že HDAC4 siRNA infekcia viedla k 36,3% Knockdown úrovňou HDAC4 mRNA (2c, *** P Hotel &0,001). Western blot analýza ukázala, že proteín HDAC4 bola významne znížená (obrázok 2D), v súlade s jeho zníženia mRNA. Dohromady tieto údaje naznačujú, že HDAC4 siRNA môže významne potlačiť endogénnej HDAC4 výraz.

HDAC4 podporoval proliferáciu buniek a tvorbu kolónií

Ďalej sme skúmali vplyv HDAC4 na rast buniek. Proliferácia buniek bola skúmaná pomocou Cell Counting Kit-8 (CCK-8) v časových bodoch 24, 48 a 72 hodín. Krivky rastu ukázali, že keď HDAC4 bola zvýšená expresia v SGC-7901 buniek, rast buniek bola zvýšená o 1,5 násobne v porovnaní s kontrolnou skupinou v deň 3 (obrázok 3A, * P
menšie ako 0,05, ∧∧P Hotel < 0,01). Okrem toho, test je tvorba kolónií vykazovali dramatické zvýšenie o 2 násobne v počte kolónií, keď boli SGC-7901 bunky transfekovány s pcDNA3.1 (+) - HDAC4 vzhľadom k NC skupiny (obr 3B a C, ** P Hotel < 0,01)

tiež sme skúmali účinky HDAC4 down-regulácia v SGC-7901 buniek .. Test a test tvorby kolónií CCK-8 ukázali, že HDAC4 down-regulácia proliferácia potlačil schopnosť (obrázok 3D, ∧P
menšie ako 0,05) počet tvorby kolónií z SGC-7901 bunky (obr 3E a a F, ** P Hotel < 0,01). V súhrne, tieto údaje naznačujú, že môže byť HDAC4 stimulátor rastu v SGC-7901 bunky.

HDAC4 zvýšené hladiny ATP a zníženie ROS generáciu

zvýšenie hladín ATP vo HDAC4 s nadmernou expresiou buniek pozorovaný v porovnaní s NC SGC-7901 bunkách (obrázok 3G, * P Hotel < 0,05). Okrem toho sa úroveň ATP bola znížená v HDAC4 porazený bunkách (obrázok 3H, * P
menšie ako 0,05).

Vzhľadom k tomu, intracelulárne generácia ROS môže súvisieť s mitochondriálnu dysfunkciu, sme ďalej skúmalo, či HDAC4 môžu stimulovať ROS generáciu SGC-7901 buniek. Výsledky ukazujú, že významné zníženie ROS generácia bola pozorovaná v pcDNA3.1 (+) - HDAC4 SGC-7901 bunky v porovnaní s NC SGC-7901 buniek (Obr 3G, ∧P
menšie ako 0,05). Medzitým umlčanie HDAC4 robustne aktivovaný ROS generáciu SGC-7901 bunkách (obrázok 3H, ** P Hotel < 0,01). Blokuje produkciu ROS pomocou antioxidantov NAC významne inhibujú generácie ROS (obr 3H, ∧P Hotel < 0,05). Toto blokovanie ROS generáciu predpríprave buniek s NAC tiež výrazne bráni ATP stratu HDAC4-siRNA SGC-7901 bunkách (obrázok 3H, ∧P Hotel < 0,05).

Downovým -regulated HDAC4 výraz zadržaný buniek v G0 /G1 fáze

down-regulácia HDAC4 vykazovala jasný nárast podielu buniek v G0 /G1 fáze (78,74% v porovnaní s 49,92% v NC-siRNA skupina). Došlo tiež zodpovedajúce zníženie počtu buniek v S fáze (12,94% v porovnaní s 34.61% v skupine s NC-siRNA) (obrázok 4A). Výsledky distribúcie bunkového cyklu kvantifikáciu bolo preukázané, že HDAC4 Knockdown významne vyvolané SGC-7901 buniek G0 /G1 zatknutie a FAG inhibičné S (Obrázok 4B, * P Hotel < 0,05, ** P
< 0,01). Preto, tieto výsledky naznačujú, že hladina HDAC4 mohla regulovať progresiu bunkového cyklu.

The down-regulované HDAC4 expresiu indukovanú apoptózu a autofagie

Pre štúdium, či inhibícia rastu buniek down-regulované HDAC4 vyvolané sa v súvislosti s apoptóza, je účinok down-regulované HDAC4 na apoptózu buniek bola hodnotená prietokovou cytometriou pomocou annexin v-FITC /PI dvojité farbenie. Bolo pozorované, že apoptóza výrazne zvýšená u HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek v porovnaní so skupinou NC-siRNA (obr 4C). Ďalej sme potvrdili indukciu apoptózy prostredníctvom aktivácie kaspázy-3 a 9 pomocou Western Blot. Analýza ukázala, že down-regulované HDAC4 k zvýšenému štiepeniu kaspázy-3 a 9 v porovnaní so skupinou NC-siRNA. Expresia anti-apoptotický proteín Bcl-2 a proapoptotický proteín Bax boli kvantifikované. Pomer Bax /Bcl-2 bola významne zvýšená v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek v porovnaní so skupinou NC-siRNA (Obr 5D).

Pre zistenie, či HDAC4 indukované autofagie down-regulované v SGC-7901 bunky, najprv skúmal intracelulárnu lokalizáciu LC3 v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek fluorescenčnou analýzy pomocou fluorescenčných protilátok proti LC3. Špecifická distribúcia interpunkcie endogénneho LC3 boli pozorované ako bodkovaná bodky zelené fluorescencie vo HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek v porovnaní s NC-siRNA skupine (obrázok 4E), čo naznačuje, že bola vyvolaná autofagie ako prostriedok na prežitie. Subcelulárnu distribúcia LC3 bola významne inhibovaná autofagie-špecifický inhibítor 3-MA v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek (obr 4E). Potom sa spojené autofagie proteíny Atg7, Beclin 1 a pomer LC3-II LC3-I boli analyzované westernovým prenosom. Pozorovali sme, že hladiny expresie Atg7, Beclin 1 a LC3-II boli všetky výrazne zvýšil v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek v porovnaní so skupinou NC-siRNA (Obr 4F). Atg7, Beclin 1 a pomer LC3-II na LC3-I v HDAC4-siRNA SGC-7901 bunky, ktoré boli liečené 3-MA v porovnaní so skupinou NC-siRNA (Obr 4F) výrazne znížil.

The HDAC4 výraz down-regulovaná inhibuje rast buniek prostredníctvom p21 up-regulácia

Vzhľadom k tomu, liečenie ľudských nádorových buniek s inhibítormi HDAC trvalo vedie k up-reguláciu expresie p21, inhibítora cyklin-dependentnej kinázy, ktorý je dobre zavedené cieľ HDAC inhibítory [6], [7], [12], sme sa snažili určiť, či zvýšená expresia alebo Vyradenie HDAC4 by mohli ovplyvniť reguláciu p21 a špekulovať mechanizmus pre podporu rastu HDAC4 sprostredkované v nádorových bunkách žalúdka.

Ako je ukázané na obrázku 5A, up-regulácia HDAC4 výrazne viedlo k zníženiu expresie p21 proteínu. Na rozdiel od toho HDAC4 down-regulácia viedla k zvýšeniu expresie p21 (Obrázok 5A). Potom sme sa skúmalo, či p21 porazený by mohli ovplyvniť rast buniek a apoptózu v SGC-7901 buniek, v ktorých bol HDAC4 odstránené. SGC-7901 bunky boli ko-transfekovány s siRNA HDAC4 a siRNA P21. Hladina p21 mRNA bola významne znížená HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek po p21 smiešne nízke (obrázok 5B, ** P
< 0,01, *** P Hotel &0,001). p21 porazený výrazne oslabená bunková proliferácia inhibícia HDAC4-siRNA SGC-7901 bunkách (obrázok 5C, * P Hotel < 0,05, ∧∧ P Hotel < 0,01). Hladina ATP bola zvýšená, ale intracelulárnu generácia ROS v siRNA-p21 HDAC4 skupiny v porovnaní so skupinou siRNA HDAC4 (obrázok 5D, * P Hotel <znížil 0,05, ** P Hotel <0,01). p21 down-regulácia významne oslabené G0 /G1 zatknutie a fága inhibícia S v HDAC4-siRNA SGC-7901 bunky (obr 5E a F, * P Hotel < 0,05). Imunoblotování ukázalo, že sa množstvo Bcl-2 bola významne vyššia, ale Bax bola nižšia v siRNA-p21 HDAC4 bunkách (Obrázok 5 g). Bunková apoptóza v siRNA-p21 HDAC4 SGC-7901 buniek výrazne znížili v porovnaní so skupinou siRNA HDAC4 (obrázok 5H). Bolo tiež zistené, že p21 porazený mohol zachrániť zvýšenej autofagie prerušovaný fluoreskujúcich škvŕn (obr 5i) a ATG 7, Beclin 1 a LC3II proteíny výraz v SGC-7901 buniek indukovaných siRNA HDAC4 (obr 5J). Súhrnne, tieto údaje naznačujú, že down-regulácia p21 by mohla napodobniť účinok HDAC4 nadmerné expresie a môže byť dôležitým mediátorom v SGC-7901 podpore rastu buniek HDAC4 sprostredkovanú.

Diskusia

Početné HDAC inhibítory, ktoré inhibujú proliferáciu a indukovať diferenciáciu alebo apoptózu nádorových buniek, sú v klinických štúdiách a to buď ako protirakovinové činidlá, alebo v kombinácii s inou liečbou [13]. Vysoká expresia HDAC1 /2 bol nájdený v tkanivách karcinómu žalúdka [14]. V našej štúdii sme ukázali, že HDAC4 expresie boli up-regulovaná v žalúdočné rakovinové tkanivá a bunkových línií in vitro
. HDAC4 down-regulácia v SGC-7901 buniek potlačená proliferáciu buniek a čísla kolóniu formácie, zatknutý bunkový cyklus a indukovanú apoptózu závislú na aktiváciu kaspázy 3 a 9, čo je v súlade s anti-proliferatívna a proapoptotických účinkov inhibítorov HDAC v ľudských nádorových bunkových líniách [15] a so skôr publikovaného zistenie, že HDAC4 down-regulácia znižuje klonogenní prežitie a indukuje apoptózu v bunkách Hela [5]. Proproliferative účinok HDAC4 do buniek karcinómu žalúdka je v súlade s tým bolo uvedené skôr pre I HDAC triedy, HDAC1, -2, -3 a [16]. Tak, zameraná na inhibíciu HDAC4 činnosti môže byť potenciálny terapeutický prístup k liečbe rakoviny žalúdka.

Autofagie je v podstate degradácie proteínov systém vlastných lyzozómov bunky. Rôzne stresových signálov, ako je napríklad živné hladovanie alebo ošetrenie rôznych protirakovinových látok stimulovať proces autofagie [17]. Autofagie je všeobecne charakterizovaný prítomnosťou autofagozóm a zvýšenie štiepenie LC3 [18]. Úloha autofagie v procese bunkovej smrti je kontroverzný, ale to bolo potvrdené, že presluchy medzi apoptózy a autofagie je zásadný pre programované bunkovej smrti [19]. V našej štúdii indukcie autofagie v HDAC4-siRNA SGC-7901 buniek bolo svedčí aj prerušovaný vzor LC3 imunobarvením a akumulácie biochemických punc proteínov autofagie (Atg7, Beclin 1 a LC3) Western blot analýzou. inhibícia Autofagie inhibítorom 3-MA oslabené indukcii autofagie v HDAC4-siRNA SGC-7901 bunky. Preto sme sa špekuluje autofagie došlo môžu chrániť SGC-7901 rakovinové bunky apoptózu vyvolaná HDAC4 príklepu.

p21 proteín, tiež známy ako cyklin-dependentnej kinázy (CKD) inhibítor 1, reguluje progresiu v G1 fáze bunkového cyklu , p21 je často zle regulované v ľudských nádorov, a to môže pôsobiť ako nádorový supresor alebo ako onkogén [20]. Tí, ktorí majú p21-pozitívne a negatívne p53 rakovín majú výrazne vyššiu krivky prežitia v karcinómu žalúdka [21], zatiaľ čo strata expresie p21 spolu so zvýšeným detekciou p53 je spojená so zlou prognózou a zníženou celkové prežívanie u karcinómu žalúdka [22]. V súlade s tým výsledkom, že p21 proteín bol down-regulovaný v rakovinových tkanivách žalúdku [23], sme pozorovali, že HDAC4 podporuje žalúdočnú proliferáciu rakovinových buniek a rastu, sprostredkované represie p21 v nádorových bunkách žalúdku a je sprevádzané zvýšením ATP úrovne a represie ROS generácie. Preto sme skúmali, či p21 bol dôležitým prostredníkom pre SGC-7901 podpore rastu buniek HDAC4 sprostredkované. V tejto štúdii, HDAC4 knockdown významne indukuje zvýšenú expresiu p21 proteínu, zatiaľ čo HDAC4 nadmerná expresia významne znížili expresiu p21 proteínu v SGC-7901 bunky. Tieto údaje naznačil, že p21 môže byť následný terčom HDAC4. Funkčné analýzy ukázali, down-reguláciu p21 by mohli napodobňovať účinok nadmernej expresie HDAC4 na SGC-7901 podpore rastu buniek. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že HDAC4 down-regulácia by mohla podporovať SGC-7901 buniek apoptózu up-reguláciu expresie p21. p21 môže byť nádorový supresor v rozvoji a progresii rakoviny žalúdka, ktorého expresia môže pomôcť pri kontrole rôznych malígnych správanie rakoviny žalúdka. Avšak prípadný význam regulácie HDAC4 expresie p21 je tiež potrebné vnímať v kontexte, že existuje niekoľko kľúčových faktorov a cesty, ktoré potenciálne modulujú expresiu p21 v rakoviny žalúdka.

Celkom vzaté, naše zistenia majú odhalilo dôležitú úlohu v kontrole HDAC4 rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie SGC-7901 rozvoj prostredníctvom regulácie p21, čo naznačuje, že zmena HDAC4 expresiou a /alebo aktivitou môže byť dôležitou udalosťou v priebehu rakoviny žalúdka. Na záver, tieto nálezy identifikovať HDAC4 ako dôležitý regulátor proliferácie rakoviny žalúdka potlačovaním p21 in vitro
.

• PLoS ONE: cirkulujúce nádorové bunky (CTCs) detekované pomocou RT-PCR a jej prognostický úloha v rakoviny žalúdka: Meta-Analysis of Uverejnené Literature
• Ploche ONE: MUC5AC Upstream Komplexné repetitívne Kraj dĺžka polymorfizmy sú spojené s citlivosťou a klinickou fáze rakoviny žalúdka