Ploche ONE: Normálny fibroblasty Induce E-cadherinu Loss a zvýšiť metastáz do lymfatických uzlín v rakoviny žalúdka

Abstract

Pozadie

Nádor je považovaný za heterogénne komplex v trojrozmernom prostredí, ktoré je v jednej rovine s patofyziologickými a biomechanických signálov. Cell-stróma interakcie smerovanie vývoja a tvorby nádorov. Tu sme vyhodnotiť prínosy normálnych fibroblastov k rakovine žalúdka.

metodiky /hlavných zistení

Podľa coculturing normálne fibroblasty v monovrstev BGC-823 buniek karcinómu žalúdka, nádorové bunky sporadicky vyvinutý krátka, vreteno -ako morfologické vlastnosti a demonštroval zvýšenú proliferáciu a invazívne potenciál. Okrem toho, transformovanej nádorové bunky vykazovali znížil tvorbu nádorov a zvyšuje lymphomatic a črevné metastatické potenciál. Netransformované BGC-823 bunky, na rozdiel od, preukázal primárnej tvorbu nádorov a oneskorený uzlín črevné a lymfy. Pozorovali sme tiež stratu E-cadherinu a upregulaci vimentin expresie v transformovaných nádorových buniek, ktorý navrhol, že nárast metastáz bola vyvolaná epiteliálne-to-mesenchymálního prechodu.

Záver

Spoločne naše dáta naznačujú, že normálne fibroblasty dostatočne vyvolať epitelu-to-mezenchýme prechod v nádorových bunkách, čo vedie k metastázy

Citácia :. Xu W, X Hu, Chen Z, X Zheng Zhang C, Wang G, et al. (2014) Normálna fibroblasty Vyvolať E-cadherinu Loss a zvýšiť metastáz do lymfatických uzlín v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Veľká Británia

Prijaté: 10. decembra 2013; Prijaté: 16.apríla 2014; Uverejnené: 20. mája 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento výskum bol podporený dotácií z Národného osobitného fondu pre zdravie Key (http://program.most.gov.cn; No.200802112), výboru pre National Science fondu (http://www.nsfc.gov.cn, všeobecné projekt č .81372302 No.81272120), je ministerstvo zdravotníctva fond (http://program.most.gov.cn, No.2007A093), kľúčovým projektom provincia Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). The Natural Science fond provincia Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 a Z2080514), a Medicine predsedníctva fondu Tradičné čínske (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Metastázy sú zodpovedné za až 90% úmrtnosti na rakovinu-súvisiace. Veľa pacientov, ktorí ukazujú žiadny dôkaz metastáz v počiatočnej diagnóze nakoniec vyvíjať metastáz. Hoci metastázy spôsobujú väčšinu úmrtí na rakovinu, tento proces zostáva jedným z najzáhadnejších aspektov tejto choroby.

Metastatická nádorové bunky vstúpiť do tkaniva cez žilu. Tkanivo sa však podlieha nejasné postupy, ktorými sú bunky zapustených do tkanivovej matrice a prichádzajú do priameho styku s stromálne bunky, z ktorých väčšina sú normálne fibroblasty. Nádorové bunky majú neobmedzenú možnosť prísť do styku s stromálne bunky, vrátane nádorových a metastatických buniek [1]. To vedie k vzájomnej presluchu s normálnymi fibroblasty v tkanive.

Fibroblasty sú najhojnejšia bunky strómy a stimulujú mikroprostredie a slúžiť ako bohatý zdroj pre parakrinný dráhy pri vzniku nádorov a progresii. Účinky normálnych fibroblastov na nádorové bunky sú sporné. Bolo oznámené, že normálne fibroblasty potlačiť malígne konverziu imortalizované epitelu prostaty [2], zatiaľ čo v nádoroch prsníka, fibroblasty transformácia duktálny karcinóm do invazívneho karcinómu [3].

Táto nezhoda znamená, že vplyv fibroblastov na nádorové bunky je iný ako pre CAFS (s rakovinou spojené fibroblasty). V tejto štúdii sme cocultured nádorové bunky s normálnymi fibroblasty v Petriho miskách na napodobenie ako nádorové bunky kontaktovať fibroblasty. Zamerali sme sa na príspevku normálnych fibroblastov k rakovine žalúdka. kultivované sme normálne fibroblasty za vzniku hustej monovrstev, ktoré potom boli šírené s nádorovými bunkami k napodobenie metastatické nádorové bunky. Predpokladali sme, že vysoký pomer fibroblastov na nádorové bunky by mohli napodobňovať tkaniva, kde lokálne metastázy nádorové bunky umiestnené. Tak, dermálnej fibroblasty od zdravých jedincov boli použité na výrobu bunkovej prostredia. Žalúdočné bunkové línie rakoviny, BGC-823, bol tu používaný, pretože to je morfologicky odlišné od fibroblastov.

boli získané materiály a metódy

etické oznámení

primárnych kožných tkanív ľudského od detí, ktorí podstúpili obriezku po získaní písomného informovaného súhlasu zo svojich správcov, ktorá bola zahrnutá do svojej zdravotnej dokumentácie. Tento experiment bol preskúmaný a schválený inštitucionálne etickou komisiou Second Affiliated nemocnice Zhejiang University School of Medicine (etické skúmanie kód: Výskumný 2013-047). Pacienti zaradení do tejto štúdie boli poskytnuté s kópiou písomného informovaného súhlasu a dal povolenie na uverejnenie.

Všetky pokusy boli vykonávané v súlade s pokynmi pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Rady pre vedu a technológie z Číny. Protokol štúdie bol schválený Výborom pre zvierat starostlivosť a používanie Zhejiang University.

Činidlá a protilátky

penicilín G /streptomycín, fosfáty pufrovaný fyziologický roztok (PBS), Triton X-100, bovinná sérum albumín, typ kolagenáza i a trypsín boli zakúpené od jinu (Čína). DMEM s vysokým glukózy bola získaná od Gibco (Čína), a fetálne hovädzie sérum (FBS) bol zakúpený od firmy Gibco (SA). Cisplatina, 5-fluóruracilu sú, puromycin, a kolagén typu I boli zakúpené od firmy Sigma (USA). Cisplatina sa rozpustí v dimetylformamide (DMF), 5-fluorouracil v DMSO, a puromycin v PBS tak, aby zásobné roztoky, ktoré potom boli uložené pri teplote -20 ° C. kolagén typu I (5 mg /ml) bol zriedený na 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidínov-2-fenylindolu HCl) v PBS bol získaný od Roche, a kozie anti-myšou IgG a králičie sekundárne protilátka-TIRTC, a sekundárne protilátky boli získané od ZSGB-Bio (Čína). Antihumánní-E-cadherin králik (ab40772), antihumánní-vimentin králik (ab92547) a králičie protilátky antihumánní-β-katenin (ab9274) boli získané od abca (UK). Antihumánní-pan-CK myší protilátky (C11) a N-cadherin králičie protilátka (C4061) boli získané od firmy Cell Signaling Technology (Čína), a anti ľudský-β-aktínu a sekundárne kozie anti-králičie protilátky boli získané od Boster (Čína) , Protilátky boli zriedené 5% FBS do pracovnej koncentrácie, pokiaľ nie je uvedené inak.

Cell Culture

stanovená bunková línia, ľudskej rakoviny žalúdka BGC-823 bunky použité v experimente boli zakúpené z bunkovej banky Guangzhou ústavu biomedicíny a zdravia. Bunky boli rozmrazené a pasážovania 4-5 krát, a potom boli použité v pokusoch spoločnej kultúre. Primárne fibroblasty kožné boli získané z chirurgických vzoriek detí, ktorí podstúpili obriezku, a za predpokladu informovaný súhlas. Fibroblasty boli použité po treťom prechode (do 50 pasáží), kultivované v DMEM high-glukózy, obsahujúceho 10% FBS, a udržujú vo vlhkom inkubátore (5% CO _{2) pri teplote 37 ° C. Bunky bolo médium nahradené každý druhý deň.}

Pre generáciu TBGCs, fibroblasty (FBS) a BGC-823 bunky boli cocultured v pomere 10: 1 po dobu ďalších 10 dní po kultivovaných buniek dosiahli zhlukovania. Tvorba dome bol pozorovaný v ko-kultivačnom systéme. Bunková zmes bola potom pasážovania trypsinizací čerstvých fibroblasty (1 x 10 ^{6 buniek /ml). Počas druhého a nasledujúcich pasážach, zakladanie zjavné skazy a suspendovaných guľovitých buniek sa objavili v ktorej sa prejavovali rôzne morfologické rysy a predĺžený nadstavec po prechode. Po piatom prechode zmiešaných suspendovaných buniek a husté normálnych fibroblastov, dresy, krátky, vretená bunkách podobných nazval "TBGCs" boli vyrobené a nepreukázala morfologické návrat k BGC-823 buniek, kým >. 10-15 pasáží}

Test proliferácie

Exponenciálne rastúce bunky boli schovať v 96-jamkových doštičkách počas ďalších 6 dňoch inkubácie pri 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére. Proliferácia buniek bola meraná v quintuplicate každý deň pomocou pipety 20 ul CellTiter 96 vodná Solution Reagent (Promega, USA) do každej jamky, ktorá obsahovala 100 ul vysoko glukózy DMEM, potom boli bunky inkubované počas ďalších 2 hodín pred stanovením relatívnej absorbancie pri 490 nm použitím čítačky mikrotitračných doštičky.}

Drug Stanovenie inhibícia

päť zdvojovanie exponenciálne rastúce bunky boli nasadené na 96-jamkové doštičky a inkubované po dobu 24 hodín. Po 24 hodinách bolo médium nahradené rôznymi koncentráciami liekov (0-80 uM) a kultivované po dobu ďalších 24 hodín. toxicita drog bola hodnotená meraním počtu živých buniek pomocou testu proliferácie popísaného vyššie.

Škrabanie Assay

Bunky boli schovať na 24-jamkové doštičky (5 x 10 ^{4 buniek /jamka) a kultivujú sa k sútoku. Špičky boli použité pre vytvorenie škrabancov. PBS bol použitý na odstránenie zvyškov buniek, a potom nahradený FBS médiu bez. Snímky boli získané počas 3 po sebe nasledujúcich dní. Šírka vrypu sa merala pomocou 1,47 ImageJ softvér pre Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) a vynesú ako škrabnutia vzdialenosti za deň.}

migrácie a invázie test

pohyblivosť buniek stanovením sa vykonáva za použitia vložky Transwell (8 um veľkosť pórov) (Corning, USA). Bunky-GFP (zelený fluorescenčný proteín) (1 x 10 ^{5/500 ul) boli suspendované v médiu bez FBS a umiestnené nad vložkami v troch vyhotoveniach, s 800 ul kultivačného média vloženého pod ním. Po inkubácii cez noc sa doštičky premyjú 3 × PBS a utrie navlhčené tampónom nad miestom, kde fixované 4% PFA nižšie a pozorovali pomocou fluorescenčného mikroskopu (Olympus, Japan). Rovnaký postup bol použitý na vykonanie testu invázie, ale boli použité doštičky, ktoré boli vopred potiahnuté Matrigelem (BD, USA). Oba testy boli kvantifikované ako počet buniek počítaných 5 náhodných polí (200 x zväčšenie).}

Apoptóza Assay

apoptotické bunky boli merané za použitia annexinu V-FITC sadu pre detekciu apoptózy (keygen, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Bunky boli buď neošetrené alebo ošetrené s liekmi po dobu 24 hodín, a potom sa zožne, dvakrát sa premyjú PBS, resuspendované vo väzobnom pufri obsahujúcom 5 ul FITC-annexin V a 5 ul PE, a inkubované pri izbovej teplote po dobu 30 minút. Analýza bola vykonaná pomocou prietokovej cytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

Kvantitatívne PCR v reálnom čase

Jadrové extrakty boli pripravené s použitím súpravy RNeasy mini-kit podľa inštrukcií výrobcu. Vzorky RNA purifikovaná (1 ug) v DEPC vody sa reverznej transkripcii s použitím PrimeScript II 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Čína). RT-PCR a amplifikácia bola vykonaná s použitím súpravy SYBR Premix Ex Taq (Takara II).

A 20 ul reakčný systém, ktorý obsahuje 1 ul zriedeného cDNA vzorky, 10 ul SYBR Premix Ex Taq II (2 x), 0.4 ul ROX Referenčná Dye (50 ×), 7 ul sterilnej dvakrát destilovaná H _{2O a 1 ul vpred a vzad primery (pozri materiály a metódy S1) boli pripravené a vyhodnotené pomocou analýzy krivky topenia a porovnávacej prah cyklu (CT) metóda. Boli použité nasledujúce podmienky cyklistické: 95 ° C počas 10 minút, nasledovalo 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 58 ° C po dobu 1 minúty. GAPDH bola použitá ako kontrolného génu.}

Analýza Western Blot

Proteíny boli extrahované z exponenciálne rastúcich buniek a primárnych tkanív. Extrakty sa varí v nanášacím pufri, rozdelené na 10% Tris-HCl SDS-polyakrylamidových géloch a prenesené na nitrocelulózové membrány (Millipore, USA) za použitia štandardných metód. Membrány boli blokované za použitia 5% mliekom bez tuku v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku s Tween-20 (TBST) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Membrány boli premyté TBST a inkubované cez noc pri 4 ° C s primárnymi protilátkami proti E-cadherinu (1: 5000), vimentin (1: 5000), β-katenin (1: 5000), N-cadherinu (1: 1000), a β-aktínu (1: 1000). Po umytí sa pridá 3 x TBST sekundárne kozie anti-králičie (1: 1000) a inkubovať po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Napokon, imunitný komplexy boli vizualizované chemiluminiscenčnej metódy pomocou ECL (Electro chemiluminiscencie) (Millipore). Koncentrácia proteínu bola normalizovaná na beta-aktínu.

Histologické a imunohistochemické analýzy

Vzorky boli rýchlo zmrazený v kvapalnom dusíku, skladované pri teplote -80 ° C, fixované v 4% PFA, a narezané na hrúbke 10 um (Leica, Nemecko).

hematoxylínom a eosínu (HE) farbením, sa deparafinizovány rezy boli zafarbené hematoxylínom po dobu 15 minút, premyté 3 x PBS, kyselina alkohole po dobu 5 sekúnd a potom eozín po dobu 5 minút (Boster, Čína).

pre imunohistochemické farbenie, bola sklíčka rehydratované a tepelne indukovaná vyhľadávanie epitopu bola vykonaná v citrátovom pufri s použitím tlakového hrnca (20 minút pri 80 pKa), blokovaný s 3 % H _{2O 2 po dobu 15 minút a potom sa použilo normálne kozie sérum (30 minút pri izbovej teplote). Sklíčka sa vyliahli v týchto primárnych protilátok: anti-E-cadherin (1: 250), anti-vimentin (1: 250), anti-β-katenin (1: 250) a anti-pan-CK (1: 250 ). Vzorky boli inkubované cez noc pri 4 ° C, dvakrát premyté s PBS a inkubované so sekundárnou protilátkou po dobu 2 hodín pri teplote 37 ° C. DAB chromogén Plus kit (Boster) bol použitý na detekciu všetkých antigénov. Sklíčka bola kontrastne hematoxylínom, dehydrované, a nasadol s krycie sklíčko s použitím neutrálnej Balata. Obe analýzy boli vykonané oddelene patológov a lekári, ktorí boli slepí k vzorových skupín. Spory urovnávali na základe konsenzu.}

Imunofluorescenčný a konfokálna mikroskopia

Bunky boli nanesené na komorných snímok a mrazené rezy boli fixované 4% PFA a permeabilizovány 0,5% Triton X-100. Sklíčka bola blokovaná s normálnym kozím sérom po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C, opláchnuté a inkubované cez noc s primárnymi protilátkami pri 4 ° C, potom prenesené a inkubované s kozie anti-myšou a anti-králičie-TIRTC protilátkami po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C v tme. Sklíčka sa premyjú za použitia glycerínu a montovať krycie sklíčka. Jadrá bola kontrastne zafarbený s DAPI. Fluorescencie bola detekovaná s použitím konfokálního laserového skenovacieho mikroskopu (Olympus). Sú zbavené parafínu zmrazených rezoch boli zafarbené DAPI a analyzované fluorescenčnou mikroskopu.

Animal Model

osemdesiatich štyroch týždňov staré samice Balb /c boli zakúpené od Animal Research Center Shanghai a udržiavaná na pokusné zvieratá stredu Zhejiang akadémie lekárskej vedy. Podľa pokynov pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Rady pre vedu a technológie v Číne, všetky zvieratá boli držané v aseptických sterilných podmienok a podávať autoklávovať potravín a vody v súlade so zásadami laboratórnych zvierat starostlivosť Zhejiang University. Štyridsať štyri myši boli použité v subkutánnej modelu, a boli rozdelené rovnomerne do kontrolnej a experimentálnej skupiny. Tieto BGC-GFP bol použitý ako kontrola, kde TBGC-GFP bolo použitie ako experimentu. Nádorové bunky boli zozbierané v priebehu rastovej fázy, a suspenduje sa v FBS médiu bez (1 x 10 ^{6 buniek /ml). Bunky sa napipetuje do jednobunkových suspenzií, a každá 500 ul roztoku bolo podkožne zaočkované na oboch stranách hrudníka. Myši boli usmrtené za 2 týždne až 10 týždňov a boli vykonané patologické vyšetrenia. Všetky myši sa posúdili každé 3 dni. Všetky operácie boli vykonávané pod 1% pentobarbitalom sodným, a boli všetko úsilie, aby sa minimalizovalo utrpenie.}

Tridsaťšesť myší boli použité v žily vstrekovania skupiny pre hodnotenie distribúcie rakoviny (18 myší v BGC-GFP kontrolnej skupine a 18 myší v TBGC-GFP experimentálna skupina). 500 ul suspenzie buniek (5 x 10 ^{5 buniek) bol injikovaný do chvostovej žily u nahých myší. Myši boli usmrtené na 2 nd, 5 th, 8 th a 10 th týždne pre patologické vyšetrenie.}

Štatistická analýza

Experimentálne údaje boli zhromaždené a vstúpil do tabuliek. Normalita testy boli vykonané pred porovnaním dát. Porovnanie medzi skupinami boli vykonané pomocou t
testu Studentov. Jednosmerná analýza variance bola použitá pre porovnanie > 3 skupiny, a Tukeyho metóda bola použitá pre post hoc
porovnávanie skupín. V tejto štúdii, p
menšia než 0,05 je považovaná za štatisticky významnú. SPSS 20.0 pre Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) bol použitý vykonávať všetky štatistické analýzy. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) bol použitý pre generovanie všetkých grafických prezentácií

Výsledky
<. h3> 1. Morfologické zmeny v BGC-823 buniek napodobňovať stromálne bunky

fibroblasty (FBS) a BGC-823 bunky boli cocultured v pomere 10: 1 po dobu ďalších 10 dní po kultivovaných buniek dosiahli zhlukovania. Bunková zmes bola potom pasážovania trypsinizací s čerstvými fibroblasty (1 x 10 ^{6 buniek /ml) (obrázok 1.1). Tvorba kupola v bunkách BGC-823 bolo pozorované po prvom prechode. Počas druhého a nasledujúcich pasážach, suspenduje v tvare kolesa bunky sa objavil v kultivovaných systéme: niektorí agregovať do zhlukov alebo zhlukov a bol voľne pripojený k povrchu fibroblastov. Paralelné-kultivované BGC-823 buniek preukázala len niekoľko kruhového tvaru bunky na základni, kedy kultúra sa stala preplnené. Zmesového pozastavená bunky vykazovali rôzne morfologické rysy a predĺžila prílohu po prechode. Tieto bunky sa preukazuje buď vzhľad dláždené podobný podobný BGC-823 buniek alebo krátke vretena-ako rysy. Dresy, krátky, vretenovité ako bunky boli vyrobené priechodom zmiešaných suspendovaných buniek a husté normálnych fibroblastov. Na rozdiel od toho priechod supernatantu buniek BGC-823 až preukázaná zvyšky po 24 hodinách kultivácie, v ktorých malé množstvo buniek prežili tvoriť dláždených podobné klony podobné rodičovskej BGC-823 bunkách (Obrázok 1.3A-H).}

Následné pokusy boli vykonané za účelom určenie zdroja suspendovaných buniek v cocultured systému. BGC-823 bunky a fibroblasty boli transfekovány kazety GFP-puro a RFP-puro kazety, respektíve, a pomenoval BGC-GFP a FB-RFP, resp. Po coculturing, BGC-GFP sa vyvinulo do viacerých vrstiev a tvoril dome-ako štruktúra. Medzitým sa v tvare kolesa alebo sféroidní bunky, ktoré boli suspendované v médiách boli prenesené do kultivačných misiek a označené zelenou fluorescenciu, ktoré preukazujú, že dlhodobé coculturing fibroblasty vyvoláva BGC transformáciu. Okrúhle a sféroidní bunky, ktoré boli suspendované v médiu boli pozorované za použitia zelenej fluorescencie a môže byť pasážovania bez pridania fibroblastov (obrázok 1.2A-D). Po niekoľkých po sebe nasledujúcich kolách coculturing, transformovanej BGC-823 bunky (TBGCs) boli získané ktorý sa objavil rovnomernejšie, krátke a vretena podobne. Tieto bunky potom boli pasážovania bez prídavku fibroblastov. Je zaujímavé, že tieto bunky sú viac náchylné k vytvoreniu guľovité štruktúry, ako sú bunky, ktoré rástli do zhlukovania a nepreukázala morfologické návrat k BGC-823 bunky, kým >. 10-15 pasáží

Predchádzajúca štúdia uvádza, že fibroblasty inhibuje rast iných buniek, cocultured in vitro
mechanizmom kontaktné inhibícia [4]. V našich pokusoch sa však normálne fibroblasty ani kontaktný-inhibujú proliferáciu BGC-823 buniek. Namiesto toho, FB-RFP postupne zahynuli BGC-GFP proliferácie, kedy sa kultivuje predĺžená na 10 dní. Z tohto dôvodu, po sebe idúce FB suplementácia bol vyžadovaný priechodu a udržanie stabilnej produkcii TBGCs. Tiež pozorované, že keď sa pridá malé množstvo TBGCs na konfluentní fibroblastov listu, nádorové bunky, ktoré rástli mimo boli zatlačené preč fibroblastov. V stredu kolónie nádorové bunky boli kruhového tvaru, len s voľnými prílohami k základni (obrázok 1.3A-H).

2. Epiteliálne-mezenchýmových Prechod od BGC-823 bunky sa TBGC

Real-time PCR bola použitá pre analýzu expresie mRNA. Výsledky ukazujú, že E-cadherin expresie bola pozoruhodne downregulated spolu s vimentin up-reguláciu v TBGCs. Medzitým sa výrazy krútenie, slimák, slimák, a N-cadherinu boli všetky up-regulované (obrázok 1.5). Imunofluorescenčné farbenie a Western blot potvrdzujú straty E-cadherinu a zvýšená expresia vimentinu, N-cadherinu, a p-kateninu (obrázok 1.4), čo potvrdzuje, že dlhodobá epiteliálne-mezenchýme prechod (EMT) sa vyskytuje v TBGCs. E-cadherin je osvedčený znakom EMT a udržuje prílohu bunka-bunka v epitelu. Strata E-cadherin môže viesť k vylučovaniu viac buniek nádoru sa od nádoru.

3. Proliferácie, invázie a Mobilita TBGCs

proliferácie TBGC bola analyzovaná pomocou testu MTS. TBGCs preukázali zvýšenou rýchlosťou proliferácie ( p Hotel < 0,01) (Obrázok 2.1). Prietoková cytometria (pozri Materiály a metódy S1), ukazuje, že 13% z TBGCs bola zachovaná v S fáze, na rozdiel od iba 7% BGC-823 bunkách (obr S1.3). Škrabanie test ukazuje, že motilita TBGC zvýšil v porovnaní s otcovskej BGC-823 bunkách (obr 2.2-2.3A-H). TBGC anastomóza nutná 3 dni po začatí škrabancov, zatiaľ čo > bolo potrebné 4 dni pre BGC-823 buniek ( p Hotel < 0,05) (Obrázok 2.2)

Z výsledkov. testy Matrigelové invázie ukazujú, že TBGCs sú oveľa agresívnejší než BGC-823 buniek. Celkom, 683.67 ± 170,83 TBGCs prenikla do Matrigelu v porovnaní s 188.33 ± 58,62 BGC-823 buniek v kontrolnej skupine ( p Hotel &0,01) (obrázok 2.4, obrázok 2.5A, B). Avšak, TBGCs preukázala významné zníženie migrovaných buniek: 2-krát nižšia ako BGC-823 buniek v závislosti na teste migrácie Transwell ( p Hotel &0,01) (obrázok 2.4, Obr 2.5cm, D). Zavesený povaha TBGCs by mohli zodpovedať za toto zníženie sa miera dodržiavania bolo v TBGCs na Matrigelu iba 68,33 ± 10,41%, zatiaľ čo 99,77% ± 6,25% v BGC-823 buniek, preukázali pomaly väzbu k Matrigel povrchu v TBGCs (tabuľka S1) .

aby bolo možné lepšie napodobňujú in vivo
správanie nádoru, kolagén typu I gél bol použitý na zistenie vzťahu medzi fibroblasty a invazívnych kapacít BGC-823 buniek a TBGCs. kolagén typu I gél bol pripravený na základe transwell vložiek fibroblasty (pozri materiály a metódy S1). Fibroblastov-naložený gély boli kultivované po dobu 7 dní a potom boli rakovinové bunky GFP-značeného nanesú na gél a kultivované počas ďalších 7 dní. Kontrola zozbieraného gélov bolo zistené, že nádorové bunky prenikli do kolagénových gélov. Keď boli gély naloží s fibroblasty, TBGCs vykazovali viac invazívna zvýšenú kapacitu než BGC-823 buniek, ako je uvedené v počte buniek, ktoré sa dostali do gélov (obr S1.2).

4. TBGCs vystavoval Cisplatina Odpor

Ďalej sme hodnotili citlivosť TBGCs na štandardné rakovinou žalúdka chemoterapeutiká. Životaschopné BGC-823 bunky a TBGCs boli stanovené po 24 hodinách expozície cisplatiny (0, 20, 40, 60, 80 uM) na základe merania inkorporácie MTS. Výsledky ukazujú, že TBGCs vykazovali výbornú odolnosť pre cisplatinu, vzhľadom na nízky počet BGC-823 bunky prežili, keď bola koncentrácia cisplatiny zvýši na 40 uM ( p Hotel &0,001) (obrázok 3.1). Životaschopné TBGCs by dokonca byť detekovaný, keď bola koncentrácia cisplatiny zvýšená až 200 uM (dáta nie sú uvedené). Vykonali sme analýzu bunkovej apoptózy pomocou prietokovej cytometrie pre overenie odolnosti cisplatinou. Výsledky ukazujú, že miera prežitia bola TBGCs o 42,40% v porovnaní s 13,80% pre BGC-823 buniek po liečbe 40 uM cisplatiny po dobu 24 hodín (obrázok 03.3.-4.03.). Avšak, ak sa nechajú reagovať s 5-FU, neboli žiadne významné rozdiely v inhibícii nádorového medzi TBGCs a BGC-823 buniek podľa testu MTS (obrázok 3.2). Obe nádorové bunky preukázané chemorezistenci na 5-FU (obrázok 3.2).

5. TBGCs Výstavné In vivo
lymfatických uzlín Sklon

Ak chcete určiť in vivo
distribúciu TBGCs, 5 x 10 ^{5 BGC-823 bunky alebo TBGCs boli injekčne do chvostovej žily myší Balb /c. Dva týždne po injekcii, rozptyl v pomocnej a krčné lymfatické uzliny metastáz bolo pozorované u oboch skupín, ako je uvedené vyhodnotenie fluorescenčného indikátora (obr 4.3a-F). GFP-pozitívne bunky boli nájdené v pomocnom a ingvinální lymfatické uzliny v oboch skupinách (Obr 4.3a, B, D, E). Avšak, GFP-pozitívne bunky sa objavili iba v pľúcach myší v skupine BGC (obr 4.3cm, F).}

V týždni 5, navyše k rozsiahlej invázie do lymfatických uzlín, organ infiltrácia bol tiež dodržiavané. Viac lymfatických uzlín invázia bola pozorovaná v skupine TBGC ako kontrolná skupina BGC v každom časovom okamihu (Obrázok 4.1, Video S1). Tieto lymfatické uzliny boli stanovené ako pán-CK pozitívny (Obr S2.1). Pozorovali sme tiež rôzne TBGC a BGC distribúcie v orgánoch. TBGCs boli obmedzené na gastroenteric tkanív, zatiaľ čo BGCs usadil do pľúc a čriev (obr 4,2A-H). V týždni 5, črevné metastázy sa prvýkrát pozorovala u 3/4 myší, ktoré boli injikované TBGCs, zatiaľ čo iba 25% myší preukázali viditeľné metastázy črevnej tieto BGC injekcie (obr S2.3).

nádory vyvinuté, priemerný počet metastáz črevných TBGC zvýšil (5,6 ± 3,911 vs
3,5 ± 1,914 BGCs v týždni 8, 6,33 ± 1,52 vs
5,6 ± 1.342 v týždni 10) (obr S4.2) , Je zaujímavé, že 3 z 5 myší v skupine TBGC preukázali megascopic novotvarov v gastrum po 10 týždňoch, čo nebolo pozorované v skupine BGC. Megascopic pľúcne metastázy boli nájdené u 3 zo 4 BGC myšou v týždni 8. však žiadne viditeľné TBGC pľúcnych metastáz bola pozorovaná v týždni 10 (obr 4,2A-H). Mikroskopická kontrola odhalila infiltrácie TBGCs do krčnej a axilárnych lymfatických uzlinách už jeden týždeň po injekcii chvostovej žily, zatiaľ čo BGCs potreba viac času (3 týždne), aby do týchto lymfatických uzlín (Obrázok 4.1). Päť týždňov po injekcii buniek, infiltrácia pľúc bolo pozorované v skupine BGC. Avšak, žiadne TBGCs boli zistené v orgánoch až 10 týždňov po injekcii (obrázok 4.2b, F, obr S2.3).

Imunohistochemické farbenie je uvedené v postupnom zvyšovaní E-cadherinu v lymfatických uzlinách skupiny TBGC , vzhľadom k tomu, E-cadherin expresie v skupine BGC mierne znížila ( p Hotel &0,01) (Obrázok 4.4a-P). Rozdiely boli významné u 8 a 10 týždňov, kedy E-cadherin expresie bola oveľa vyššia v skupine TBGC v porovnaní so skupinou BGC (obrázok 4.5). Expresie beta-kateninu tiež zvyšuje s časom v TBGC skupiny, ktorý vyvrcholil na 8 týždňov a potom sa mierne znížil (obr 4.5). Výsledky ukazujú tiež zvýšená β-katenin expresie v skupine TBGC na 5, 8 a 10 týždňov ( p Hotel &0,01). (Obrázok 4.5)

6. TBGCs preukázal nízku nádoru formáciu, ale High metastáz do lymfatických uzlín kapacita v našej Podkožný vzniku nádorov Model

Vzhľadom k tomu, nádorové bunky sú s väčšou pravdepodobnosťou vzniku novotvarov, keď podkožne implantované, (GFP +) TBGCs a BGCs boli implantované vstreknutím 5 x 10 ^{5 životaschopné nádorové bunky do podkožia na oboch stranách hrudníka. Rodiacej nádorov v skupine BGC bola zistená už v 3 dní po implantácii, a všetky myši v skupine BGC vyvinuté nádory v miestach implantácie po 1. týždni inkubácie (obrázok 5.1a). Je zarážajúce, že implantované TBGCs neprinieslo žiadne nezistiteľné nádory až 8 týždňov (obrázok 5.1, Video S2). Stupňovať TBGC dávku 5-10 × 10 6 implantované bunky iba viedli k vzniku malých nádorových zhlukov a stagnujúci zväčšovanie objemu nádoru spolu s inkubačnú dobu. Okrem toho myši v skupine BGC stala umierajúcej, zrejme preto, že zvýšené nádorové záťaže (dáta nie sú uvedené).}

celotelové pitvy v každom časovom intervale ukazujú, že TBGCs miesto viditeľných primárnych nádorov, infiltrovaný priľahlý a distálnej lymfatické uzliny, zatiaľ čo BGC generovaných nádorových ložísk boli obmedzené na neporušených fibrotických kapslí v mieste vpichu (Video S2). Regionálne globálne lymfatické uzliny metastázy v skupine TBGC boli nájdené už za 2 týždne po implantácii, zatiaľ čo regionálne lymfatické uzliny metastázy boli detekované po 4 týždňoch v skupine BGC (obr 5.2). Kaplan-Meierovej analýzy vyplýva, že TBGCs preukázala vyššie riziko rozvoja do lymfatických uzlín než BGCs (obr 5.2).

Rozsiahle črevné metastázy boli zrejmé aj vo všetkých myší v skupine TBGC po 8 týždňoch a potom (pozri obr S4.1 Obrázok S4.4). Priemerný počet črevných uzliny bola 5,50 ± 1,73 v týždni 8 a 7,33 ± 1,79 v týždni 10. Na rozdiel od toho iba 1 myší v skupine BGC preukázané, 3 črevnej infiltrácie v týždni 9 (obr S4.1).

GFP tracing indikuje lokálnu tvorbu nádorov v skupine BGC v mieste vpichu, bez toho aby regionálne lymfatické uzliny infiltrácie. Na rozdiel od toho TBGCs objavil v axilárnych lymfatických uzlinách, ale zelená fluorescencie bola v tkanivách v mieste vpichu (pozri obr 5.3) nebola detekovaná. V týždni 6, TBGCs-GFP akumuluje v rektálnych a mezenterických lymfatických uzlín. Avšak iba 1 myš s kladným mezenterických lymfatických uzlín bola pozorovaná v skupine BGC. pan-CK imunohistochemické farbenie naznačuje, že TBGCs metastázovať k regionálnym (čoskoro) a distálnej lymfatických uzlín (neskoré), zatiaľ čo BGCs metastázovať iba na regionálnych lymfatických uzlín (neskorý) v čase experimentu (obr S4.5). TBGCs tiež metastázovať do čriev v týždni, kedy nebol nájdený v skupine BGC.

HE farbením preukazuje, že abnormálne bunky objavil v regionálnych lymfatických uzlín v raných fázach v skupine TBGC a neskorých štádiách v užívateľskej skupina BGC (obr S4.6). Imunohistochemické expresie proteínov analýzou po 2 týždňoch ukazuje znižujúce množstvo E-cadherinu a beta-kateninu a zvýšenú expresiu vimentin v TGBC-LNS v porovnaní s BGC-neoplázie. Tieto výsledky boli ďalej potvrdená Western blotting analýzou vzoriek tkaniva, ktoré sa nezistí E-cadherinu v TGBC-LNS; Medzitým, N-cadherin bol tiež ostro downregulated v TGBC-LNS (obr S3.3-3.4).

Imunohistochemické farbenie ukazuje postupné zvyšovanie E-cadherinu v lymfatických uzlinách skupiny TBGC ako čas postupoval, keďže, expresie E-cadherinu v skupine BGC mierne znížila ( p Hotel &0,01) (obrázok 5.4).

• Ploche ONE: Prohibitin Expression Deregulácia v rakovina žalúdka je spojený s netranslatované oblasti 3 '1630 C > T polymorfizmus a počtu kópií Variation
• Ploche ONE: Aktivácia mezenchymálnych kmeňových buniek makrofágy výzvu rakovina žalúdka u ľudí rastu prostredníctvom NF-kB Pathway