Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: Román Funkčné TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 usporiadateľa je spojená s náchylnosťou k rakovine žalúdka moduláciou Promoter Activity

abstraktné

DNA metyltransferázy (DNMT) 3a, ktorý obsahuje DNMT3A1
a DNMT3A2
izoformy boli navrhnuté hrať kľúčovú úlohu v karcinogenéze a ukázal aberantne expresiu u väčšiny druhov rakoviny. Nahromadené dôkazy tiež uviedol, že jednonukleotidových polymorfizmy (SNP) v DNMT gény boli spojené s náchylnosťou k rôznym nádorom. Predpokladali sme, že genetické varianty v DNMT3A1
promotorová oblasť je spojená s rizikom rakoviny žalúdka. Vybrali sme tagSNPs z databázy HapMap pre Číňanov a genotyp v case-control štúdia na vyhodnotenie súvislosť s rakovinou žalúdka (GC) v čínskej populácie. Zistili sme, že funkčné tagSNP rs7560488 T > C spojené s výrazne zvýšeným rizikom GC. In vitro
Funkčná analýza pomocou luciferázového reporterového testu a EMSA uviedla, že tagSNP rs7560488 T > C zmenené z transkripčný aktivitu DNMT3A1
génu prostredníctvom ovplyvňovania väzby niektorých transkripčných faktorov, aj keď určité transkripčný faktor je potrebné ešte stanovená. V porovnaní s TT homozygotov, jedincov, ktorí boli TC heterozygot a homozygoti CC vykazuje zníženú expresiu DNMT3A1
. Okrem toho vrstevnatý analýza ukázala, že jedinci, ktorí prístav TC alebo CC genotypy menej ako 60 rokov boli náchylnejšie na GC. Naše výsledky naznačujú, že genetické zmeny v DNMT3A1
promótor prispievajú k citlivosti na GC, a tiež pohľad, ktorý tagSNP rs7560488 T > C môže byť sľubnú biomarker pre predpovedanie GC genetickej náchylnosti a cenné informácie v GC patogenézy

Citácia :. Wu H, Zhang K, P Gong, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) Román Funkčné TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 usporiadateľa je spojená s náchylnosťou k rakovine žalúdka moduláciou promotorovou aktivitu. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10,1371 /journal.pone.0092911

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Čína

prijatá: 22. decembra 2013; Prijaté: 27. februára 2014; Uverejnené: 25.března 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (Grant No. 81171915 a No. 91229107) a vedeckého výskumu a inovácií plánu na vysokoškolákov v provincii Jiangsu, Čína (Grant č CXZZ13_0082). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najbežnejších zhubných nádorov v Číne, a to najmä v provincii Jiangsu s vysokým výskytom a úmrtnosť [1], [2]. Sa môže šíriť po celom žalúdka a do ďalších orgánov, vrátane pažeráka, pľúc, lymfatických uzlín a pečene. Z tohto dôvodu, rakovina žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na svete, [3]. S ohľadom na terapeutickú účinnosť, chirurgický postup môže byť primárna následná liečba u pacientov s skoršej fáze GC [4]. Bohužiaľ, väčšina pacientov s rakovinou žalúdka, sú zistené v pokročilej fáze, počas tejto doby sa nádor sú neresekovateľného ešte. Navyše relaps po operácii je ďalší hrozná udalosť pre chudobné 5-ročné prežitie. Vzhľadom k tomu, pacientov s pokročilým alebo opakujúce sa rakoviny žalúdka, nie je pochýb o tom, že objav biomarkerov a ich aplikácie v sprievode s tradičným diagnózou môže byť cenným indikácie a rozsiahlu pomoc formulovať stratégiu prevencie a liečby. Doteraz však neboli identifikované niekoľko merateľných biomarkery k predikciu GC opakovaniu.

nádorového ochorenia je známe, že je viacstupňový proces, ktorý je výsledkom nielen genetických zmien, ale aj epigenetické zmeny [5]. DNA metylácie je hlavnou forma epigenetické zmeny a hrá zásadnú úlohu vo vývoji, diferenciácii, stability genómu, X-inaktivácie, a potlač špecifickú reguláciu génovej expresie. Najčastejšie sa študoval epigenetické jav je metylácie DNA, nevyhnutnú regulátor transkripcie a štruktúry chromatínu. Aberantne metylácie DNA vzory v geneticky náchylné pozadí môže byť spojené so zvýšeným rizikom radu ľudských chorôb [6], [7], vrátane GC [8]. DNMT3A
ktorý obsahuje DNMT3A1 stroje a DNMT3A2
sú dva de novo
DNA metyltransferáza hrá kľúčovú úlohu v embryonálnom vývoji a aberantne metylácie DNA v karcinogenéze. Niektoré polymorfizmy v DNMT3A
génu môže regulovať génovú expresiu, ovplyvňovať jeho enzymatickú aktivitu a môžu prispieť k náchylnosti k rakovine. Nazhromaždené dôkazy v molekulárnej genetike ukazujú, že SNP v DNMT
génov sú spojené s náchylnosťou k rakovine [9], [10]. Nedávne pokroky v štúdii celogenomové združenia (GWAS) tiež boli identifikované nové vnímavosti SNP pre GC, ktorý je užitočný pre pochopenie základný mechanizmus genetických variácií v rozvoji GC [11] - [14]. Naše predchádzajúce štúdie zistila, funkčné SNP rs1550117 v DNMT3A
promótor, ktorý môže zvýšiť jeho transkripčný aktivitu a prispieva ku genetickej náchylnosti k rakovine žalúdka v čínskej populácie [15], [16].

GWAS prinieslo rad SNP spojené s mnohých druhov rakoviny. V niektorých prípadoch, desiatky SNP, tzv tagSNPs, ktoré predstavujú SNP v oblasti genómu s vysokým väzbové nerovnováhe môže identifikovať genetické variácie, bez genotypizácia každý SNP v chromozomálne oblasti, takže tagSNPs sú užitočné v celogenomové štúdiách SNP asociačné, ako je napríklad prostaty, prsníka, vaječníkov, hrubého čreva a rakoviny mozgu [17] - [19]. V tejto štúdii sme vybrali tagSNP rs7560488 z databázy HapMap pre čínske subjekty posúdiť asociácie medzi genetickými variantmi v DNMT3A1
promotér a žalúdka riziko rakoviny v čínskej populácie. Identifikovali sme na riziku spojené rs7560488 T >. C polymorfizmus v DNMT3A1
promotér a naše ďalšie práce naznačujú, že tento variant by mohla ovplyvniť aktivitu promótorom a zničiť schopnosť väzby transkripčných faktorov

materiály a metódy

Študijné Predmety

celkom 405 pacientov s histologicky potvrdené žalúdočné rakovinu a 408 s rakovinou bez kontrol bolo prijaté v tomto case-control štúdie a charakteristiky prípadov a kontrol sú podrobne uvedené v tabuľke 1. Prípady a kontroly boli vyrovnané podľa veku, pohlavia a boli vybrané z pričlenené nemocnice Nanjing lekárskej univerzity. Všetky vzorky boli získané s výslovným súhlasom a analyzované anonymne. Táto štúdia bola vykonaná so súhlasom etickou komisiou Lekárskej lekárskej fakulty Univerzity juhovýchodnej.

TagSNP Selection a TF Binding Site predikcie

Hlavné hypotéza, z ktorého tento experiment bolo, že existuje jedna alebo viac SNP v DNMT3A1
promotorových oblastí, ktoré sú spojené s rizikom vzniku rakoviny žalúdka. V závislosti na väzobné nerovnováhe (LD) štruktúry v určitom lokuse, môžu byť tagSNPs náhrady pre mnoho tisíc iných SNP. Sme predpokladajú, že takéto tagSNPs sú tiež pravdepodobné, že označiť všetky doteraz zistených SNP v DNMT3A1
promótor. Preto sme vybrali SNP v DNMT3A1
promotorové oblasti s menšou frekvenciou alely (MAF) z > 5% z oboch databáz HapMap a dbSNPs. Ak chcete implementovať potenciálne funkčné výber tagSNP, využívame dáta z medzinárodného HapMap a voľne webových nástrojov pre výber tagSNP vybrať tagSNPs a použiť algoritmus TF-vyhľadávanie (http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH~~HEAD=dobj .html) predpovedať rs7560488 transkripčný faktor (TF) väzobné miesto.

DNA Extrakcia a HRM genotypu

Ak chcete študovať DNMT3A1
promótor tagSNP rs7560488, genomická DNA bola izolovaná z 1 ml periférnej krvi od pacientov a zdravých jedincov a bola extrahovaná z bielych krviniek počas jedného týždňa po odbere vzoriek pomocou proteinázy k štiepením ako bolo opísané skôr [20]. TagSNP rs7560488 bol genotyp pomocou dsDNA farbiva LC zelená v kombinácii s High Resolution Melting (HRM) analýzy. V detaile, PCR priméry boli navrhnuté podľa LightScanner primer dizajn softvér (Idaho Technology) (dopredný primer: 5'-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 ', reverzné primer: 5'-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3'), ktorá produkt fragment jeden 208 bp. Každá reakcia PCR bola pôvodne vykonaná v konečnom reakčnom objeme 10 ul, za použitia 25 ng genómovej DNA, 0,2 pmol každého primeru, 0,8 ul 2,5 mM dNTP, 1 ul 25 mM MgCI 2, 1 ul 10 x Taq pufer s (NH4) 2SO 4, 0,4 u Taq DNA Polymerase (Fermentas), 1 ul 1X LC Green PLUS (Idaho Technology) a 0,4 ul dimetylsulfoxidu (DMSO). Reakčná zmes bola inkubovaná pri teplote 95 ° C počas 5 minút a potom sa podrobia 40 cyklom 95 ° C počas 30 s, 57 ° C počas 30 sekúnd, a 72 ° C počas 30 sekúnd, nasleduje 72 ° C počas 7 minút za použitia termocykléra PTC-200 (Bio-Rad). PCR reakcie boli prenesené do 96-jamkových doštičiek (Bio-Rad) a analyzované na Light Scanner (Idaho Technology). Fluorescenčné dáta boli zbierané po teplotnom rozmedzí 70-97 ° C, a analýza krivky topenia bola vykonaná v súlade s softvér výrobcu. HRM Dalo by sa priamo rozlíšiť heterozygotné (TC) a homozygotov (CC alebo TT) genotypov tagSNP rs7560488 T > C cez skenovanie taveniny. Po zmiešaní homozygotná DNA s rovnakým množstvom známych PCR produktov (napr CC), sa ďalej rozlišuje medzi CC a TT genotypov. Pre ďalšie potvrdenie, 5% vzoriek z každej skupiny detekovaného HRM bolo náhodne vybraných a podrobené sekvenovania DNA pre zaistenie spoľahlivosti a reprodukovateľnosť.

Konštrukcia plazmidu Luciferase Reporter

konštruovať DNMT3A1 tagSNP rs7560488 reportér plazmid sme zosilnený fragment o 948 bp z 25422345 na 25422345 zo DNMT3A1
promotorový úsek, ktorý obsahuje T a C alely SNP pomocou PCR z genómovej DNA. Priméry použité pre amplifikáciu PCR boli: (Forward: 5'-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 ', reverzné: 5'-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3'). PCR produkty boli subklonovány do reštrikčných miest Nhel a HindIII v pGL3-Basic vektora (Promega, Madison, WI). Overili sme všetky rekombinantných klonov sekvenovaním DNA.

Prechodné transfekcia a duálnym luciferázovým reporterovým testu

rakovina žalúdka AGS a BGC-823 bunky (ATCC) boli kultivované v médiu RPMI-1640 doplnenom 10 % fetálne hovädzie sérum (FBS) a 1% roztok penicilín /streptomycín (10 000 U /ml a 10 mg /ml, v danom poradí). AGS a BGC-823 bunky (1 x 10 5) boli schovať v 24-jamkových kultivačných doštičiek. Po 24 hodinách kultivácie, AGS, BGC-823 bunky boli transfekovány pomocou Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) s 0,8 mg každej postavenej vektora, a to buď s T alelou alebo C alely. Súčasne, 10 ng PRL-TK plazmidy (Promega) na jamku bol tiež transfekovány ako vnútorná kontrola pre korekciu účinnosť transfekcia. Pred tým, bunky boli schovať na 24-jamkových doštičkách cez noc s cieľom zabezpečiť 90% -95% zhlukovania v dobe transfekcia. Dvadsaťštyri hodín po transfekciu, aktivita luciferázy bola meraná v Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) a bola vyjadrená ako pomer luciferázy svetlušiek do Renilla luciferázové aktivity. Všetky bunky boli vykonané v troch opakovaniach sa za rovnakých podmienok. Tri nezávislé transfekcia boli vykonané pokusy, a každý luciferázového testu bol vykonaný v troch opakovaniach.

Shift Elektroforetická mobilita Assay (EMSA)

5'-biotinylizované oligonukleotidy 25 bp boli získané z Beijing Genomics Institute (BGI). Oligo sekvencie boli rs7560488 [T] Forward: 5'-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [T] reverznej: 5'-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3'. rs7560488 [C] Forward: 5'-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 ', rs7560488 [C] reverznej: 5'-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3'. Pre žíhanie, koncentruje komplementárne oligonukleotidy boli zmiešané v 1:01 molárnom pomerom a inkubuje sa pri teplote 95 ° C počas 5 minút a potom sa postupne znižuje v priebehu niekoľkých hodín, kým oligonukleotidy izbovú teplotu. Žíhané oligonukleotidy sa zriedia na konečnú koncentráciu 10 fmol. Jadrové proteíny boli získané z buniek BGC-823 s využitím NE-Perte jadrových a cytoplazmatických Odsávacie činidiel (Pierce, skalné brod, IL, USA) podľa inštrukcií výrobcu. LightShift Chemoluminiscenčný EMSA kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) boli použité podľa inštrukcií výrobcu. Stručne povedané, väzbové reakcie boli vykonané nasledujúcim spôsobom: jadrových extraktov (8 ug proteínu) a 1 x väzbovom pufri s 2,5% glycerolu, 5 mM MgCl2, 50 ng /ul poly (dl-dC), 0,05% NP-40, a 60 fmol biotínom značené rs7560488 T /C rs7560488 sondy boli inkubované na ľade počas 30 minút v objeme 20 ul. Pre kompetiční štúdia bola nukleárna extrakty boli inkubované s neznačeného oligonukleotid počas 30 minút pred pridaním značeného oligonukleotidy. Pre supershift, AP-1 protilátka bola pridaná (BOSTER, Čína). Komplexy boli rozdelené elektroforézou na 6% natívneho PAGE na 0,5 x TBE pufri pri 110 V. Gély boli prevedené na Biodyne B narezaný modifikovaných nylonové membrány (Pierce /Thermo Fisher Scientific) za použitia Trans-Blot SD polosuchého prenosu buniek ( bio-Rad Laboratories). Membrány boli zosietené (UVC-508 UV síťovadla, Ultra LUM) a bol detekovaný signál s chemiluminiscenčná detekčný systém (Pierce /Thermo Fisher Scientific) podľa inštrukcií výrobcu.

Detekčná DNMT3A1 prepisy kvantitatívnej RT-PCR (Q-PCR)

pre ďalšie zistenie korelácie medzi DNMT3A1 mRNA úrovniach a rs7560488 polymorfizmus, že 44 žalúdočné rakovinové tkanivá, s rôznymi genotypmi boli podrobené extrakcii z celkovej RNA za použitia TRIzolu činidlo ( Invitrogen, Inc.). Hladina DNMT3A1 mRNA bola meraná pomocou kvantitatívnej real-time PCR po reverznej transkripcii na Prism 7900 real-time PCR zariadení (Applied Biosystems, Foster City, CA). β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola pre kvantitatívne každú vzorku. Priméry použité pre amplifikáciu boli DNMT3A1 F: 5'-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 'a R: 5'-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3'; Primery pre beta-aktínu boli F: 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 'a R: 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. Relatívna kvantifikácia DNMT3A1 mRNA bola vypočítaná za použitia metódy 2-ΔΔCT, a každý test bol vykonaný v troch opakovaniach.

Štatistické analýzy

Všetky dáta boli analyzované s SPSS verzia
13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Pacienti a kontroly boli porovnané za použitia Študent je t
-test pre spojité premenné a testom (X2) chi-kvadrát pre kategorické premenné. Alely a genotypovej frekvencie medzi riadiacimi a GC subjektov boli získané pomocou testu chí-kvadrát, a štandardné dobrota-of-fit test bol použitý na testovanie Hardy-Weinberg rovnováha. A P
hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významné.

Výsledky

Charakteristika študijných predmetov

Frekvenčné distribúcia prípadov a kontrol sú uvedené v tabuľke 1, neexistuje žiadny významný rozdiel vo frekvenčných distribúciou medzi prípadov a kontrol (p = 0,243 pre vek a P = 0,355 pre pohlavie). Priemerná pacientov a kontrol bol 59,8 rokov (rozmedzie 20 ~ 93 rokov) a 60,6 rokov (rozmedzie 25 ~ 90 rokov), v danom poradí. Žiadny významný rozdiel bol nájdený v priemernom veku a pohlavia, čo naznačuje, že prispôsobovanie založený na týchto dvoch veličín je dostačujúce.

Candidate tagSNP Selection a genotypizácia

Medzi kandidátskymi SNP v DNMT3A1
, sme sa zamerali na tagSNPs v promotérom DNMT3A1 stroje a predpovedal ich potenciálne funkcie na väzobných transkripčných faktorov, ktoré majú vplyv na kvalitatívne a kvantitatívne vyjadrenie DNMT3A1
. Použili sme algoritmus pre výber tagSNP LD-based (r 2≥0.80, MAF≥5%), ktorý identifikoval dva tagSNPs reprezentovať spoločný genetickú variabilitu v CHB populácie, vrátane kandidáta tagSNPsrs7560488 a rs1550117, ktorý je funkčný polymorfizmus, ktorý upravuje citlivosť u karcinómu žalúdka sme potvrdili pred [15] [16]. TFSEARCH algoritmus predpovedá, že rs7560488 T vytvára väzobné miesto pre AP-1 (obrázok 1). Vzorky na stanovenie genotypu podľa HRM a sekvencovania ABI 3730 automatizovaný sekvencer, respektíve (obrázok 2)

TagSNP rs7560488 Variant T >. C v DNMT3A1 Promoter významne zvyšuje riziko GC

genotypom rozvodov a alel frekvencia rs7560488 sú uvedené v tabuľke 2. genotypu kmitočty v kontrolách boli v zhode s modelom Hardy-Weinberg (p = 0,274). Ako je uvedené v tabuľke 2, genotypu frekvencia rs7560488 boli 68,9%, 27,4% a 3,7% pre TT, TC, a CC genotypy medzi prípadmi, a 79,9%, 18,4% a 1,7% u kontrol, v danom poradí, rozdiel medzi prípadmi a kontrolami bol štatisticky významný (P menšia ako 0,05). Okrem toho je frekvencia alely T bol významne nižší u prípadov než kontroly (82,6% oproti 89,2%, p = 0,000). Okrem toho, kombinované TC /CC genotyp frekvencia bola vyššia u prípadov než kontroly (31,1% oproti 20,1%, p = 0,002). Ak sa vezme TT genotyp a T alelu ako referencie, sme zistili, že varianty genotypy (TC a CC), boli spojené so zvýšeným rizikom GC (OR = 1.653, 95% CI = 1.194-2.287; P = 0,002). Rovnako tak tiež pozorované, že C allele frekvencia bola štatisticky významne vyššia ako kontrolná skupina (OR = 1,744, 95% CI = 1.310-2.321; P = 0,000). Dohromady tieto údaje naznačujú, že TC a CC genotypy boli spojené s genetickou citlivosťou na GC; DNMT3A
1 rs7560488 T alela môže byť domnelý ochranný alela. Neboli zistené žiadne významné rozdielne frekvencie rs7560488 v GC na vekovom rozmedzí > 60 rokov oproti ≤60 rokov (p = 0,756) a samec oproti samicu (P = 0,459) (tabuľka 3)

jedinca mladší. 60 rokov boli náchylnejší k rakoviny žalúdka s tagSNP rs7560488 Variant T > C

Vek a pohlavie boli dôležitými faktormi nádorové karcinogenéze vrátane rakoviny žalúdka. Keď boli analýzy rozdelenia podľa veku a pohlavia pacientov sme zistili, že významná súvislosť bola pozorovaná, jedinci nesúce TC /CC genotypy boli spojené s genetickou predispozíciou k GC a to ako v mužskej a ženskej skupiny. Z tohto dôvodu, rs7560488 C alela bola výrazne zvýšil rizikový faktor v porovnaní s T alelou (tabuľka 4). Ďalšie rozvrstvenie hodnotila združenia rs7560488 T > C s rakovinou žalúdka v rôznych vekových kategórií. TC /CC genotypy boli spojené s genetickou predispozíciou k GC na veku od ≤60 rokov (OR = 1,794, 95% CI = 1,118 až 2,877; P = 0,015) než staršie ako 60 rokov, podobne tiež zistené, že C allele frekvencia bola štatisticky významne vyššia ako kontrolná skupina (OR = 1.720, 95% CI = 1.127-2.622; P = 0,011). Tieto výsledky naznačujú, že TC a CC genotypy boli spojené s genetickou citlivosťou na GC, a to najmä u jedincov, nie viac ako 60 rokov (tabuľka 4)

The rs7560488 T >. C Variant ovplyvňuje DNMT3A1 transkripčný aktivitu

Ak chcete zhodnotiť biologický funkčný efekt rs7560488 polymorfizmus na DNMT3A1 transkripcie, sme vybudovali luciferázové reportéri vektorov (pGL3), klenúca sa cez 4.389.823 do 4.390.770 základ, z DNMT3A1
promótor, buď divokého typu (T alely), alebo mutant typu (C alela) a transfekována do ich BGC-823, AGS bunky (obrázok 3A). Ako je znázornené na Obr. 3B, sme zistili, že transkripčný aktivita T alely bola vyššia ako C alele s približne 2-krát vo vyššie dvoch bunkových línií, čo naznačuje, že rs7560488 T alela pracoval ako obranca pre rakovinu žalúdka tým, že zvyšuje transkripciu DNMT3A1

The rs7560488 T >. C Variant zoslabuje transkripčný faktor Affinity

Vzhľadom k tagSNP rs7560488 je umiestnený v DNMT3A1
promotorové oblasti; my sme predpokladali, že by to mohlo zmeniť nadviazanie transkripčného faktora (TF). V skutočnosti, pomocou algoritmu TF-vyhľadávanie (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html~~HEAD=dobj), sme predpokladali, že rs7560488 T vytvára väzobné miesto TF pre AP-1. Na určenie, či tento polymorfizmus má vplyv na schopnosť viazať transkripčného faktoru, sme vykonali elektroforetické mobility shift testu (EMSA) pre analýzu väzby oligo sond, ktoré obsahujú buď T alebo C alely s jadrovými proteínmi extrahované z AGS bunky. Ako je znázornené na Obr. 4A, konkrétne posunul DNA /jadrový proteínový komplex, pás bol vytvorený oboma C a T alelově sond (obr. 4 A dráhy 2, 5). Avšak, T alela ešte neboli plne kompetitívne inhibovaná (obr. 4A dráha 4), aj keď sa posunula skupina bola zrušená 50-násobnom neoznačených C sondy (Obr. 4A pruh 1), čo naznačuje, že väzobná aktivita na sekvencie obsahujúce rs7560488 T alela je silnejší v porovnaní s alelou C a transkripčný faktor môže prednostne viazať sa na alely T skôr ako C alely. Okrem toho, super-EMSA za použitia AP-1 protilátka nespôsobili supershift na biotínom značenú sondou /jadrového proteínu (obr. 4 B dráhy 2, 5), čo ukazuje, že AP-1 nesmie transkripčný faktor, ktorý sa viaže k oblasti promotora obsahujúce T alebo C alelu. Tieto výsledky ukazujú, že rs7560488 C alela by mohla znížiť väzbovú aktivitu jadrového proteínu, aj keď dopad nie je ovplyvnený transkripčného faktora AP-1.

Súvislosť medzi DNMT3A1rs7560488 polymorfizmus a expresie Úrovne DNMT3A1
mRNA

Štyridsať štyri žalúdočné rakovinové tkanivá, s rôznymi genotypmi DNMT3A1 rs7560488 boli k dispozícii v našej súčasnej štúdii. Vzhľadom k nízkej frekvencii genotypu CC, sme ho pridané do vzoriek s genotypom TC pre analýzu. Ako je znázornené na Obr. 5, hladiny expresie mRNA DNMT3A1 bola nižšia u jedincov s genotypom CC alebo TC ako u pacientov s genotypom TT (P menšia ako 0,05)

Diskusia

Genome-Wide hypomethylace a promótor hypermetylace sú. charakteristickými znakmi najrôznejších druhov rakoviny, ktoré prispievajú k tvorbe nádorov a metylácie DNA hrá kľúčovú úlohu v regulácii génovej expresie a udržanie stability genómu [21], [22]. Metylácie DNA sa vykonáva pomocou DNA metyltransferáza (DNMTs) DNMT1
DNMT3B stroje a DNMT3A
[23], [24]. de novo
metyltransferáza DNMT3A
sú veľmi vyjadrený v priebehu skorého embryonálneho vývoja a down-regulované vo väčšine diferencovaných somatických buniek [25]. Úloha DNMT3A
u nádorových ochorení bola zdôraznená správami o DNMT3A
mutácií u približne 20% pacientov s akútnou myeloidnou leukémiou [26], [27]. Výskyt týchto mutácií korelovala so zníženou enzymatickou aktivitou a genómovej regióny so zníženou metylácii. DNMT3A
mutácie boli tiež identifikované u 8% pacientov s myelodysplastickým syndrómom [28]. DNMT3A
tiež hrá dôležitú úlohu v epigenetické umlčanie krvotvorných kmeňových buniek (HSC) regulačných génov a umožňujú efektívnu diferenciáciu [29].

DNMT3A
genomické locus produkuje dva transkripty, ktoré viedli k dvom proteíny, tým dlhšie DNMT3A1 stroje a kratšie DNMT3A2
, ktoré sa líšia v tom, že 219-amino-kyseliny, amino (N), je k dispozícii len v terminálny tail DNMT3A1
[30], [31]. N-koncová doména DNMT3A1
sa nazýva "regulačné" domény, pretože nemá enzymatickú DNA metyltransferáza aktivitu. Táto doména nezdieľa významnú homológie so žiadnym iným známym proteínom. DNMT3A1
sa koncentruje vo heterochromatin, ktorý je považovaný za Transkripční tiché, a funguje primárne ako transkripčný represie [30]. Ale ďalší výskum ukázal, že DNMT3A1
bol účinne prijatí do tlmičom OCT3 /4 a aktívnym vitronektinu (VTN) promótory génov prostredníctvom svojej jedinečnej N-terminálny domény. [32]

Bolo zistené, že genetická variácia DNMT3A
génu prispieť ku karcinogenéze, najmä spojené s GC [15], [33] - [36]. Potom, sa navrhuje ďalšie skúmanie vzťahu medzi SNP a translačný regulácia na jeho cieľových génov. Ale, zistenie biologické funkcie pre každý SNP často vyžaduje časovo náročné experimenty, molekulárnej biológie. Tak analýzu veľký počet SNP viazané na konkrétne miesto, na prax vyžaduje systematickú bioinformatiky vyhodnotenie a stanovenie priorít pre zúženie súboru pravdepodobných funkčných kandidátnych variantov. Vzhľadom k tomu, väčšina z SNP sú v LD, štúdie asociačné haplotypu báze sú považované za silnejšie ako jednej analýzy SNP určiť príčinnej genetické varianty, na ktorých je etiológie komplexných ochorení, ako je rakovina [37], okrem toho, použitie tagSNPs, ktoré zachytávajú väčšina haplotypic rozmanitosti v asociačné štúdie bolo navrhnuté [38]. Keď GWAS prinieslo početné SNP alebo tagSNPs významne spojené s rakovinou, väčšina z tagSNPs sa nachádzajú v oblastiach non-kódujúci proteín (intergenová a intronové oblasti), určovanie ich funkčných a /alebo kauzálny varianty má dôležitú obmedzenia interpretácia dát GWAS napriek priradenie putativní funkcie pre mnoho ďalších GWAS tagSNPs bol úspešný len vtedy, ak jemné mapovanie okolo známej oblasti rizík bolo vykonané [39] - [41].

V tejto štúdii, Vybrali sme predpokladané funkčné tagSNP rs7560488, ktorý môže predstavujú SNP na DNMT3A1
promotér s vysokým väzobné nerovnováhe, je možné identifikovať genetické variácie, bez toho, aby každý genotypizácia SNP v DNMT3A1
promotorové oblasti a zlepšiť účinnosť združovania. Pozorovali sme, že subjekty vykonávajúce tagSNP rs7560488 TT genotyp vykazovali významne znižuje riziko rakoviny žalúdka v porovnaní s jedincami s TC alebo genotypom CC, čo naznačuje, že alela T je ochranný účinok potenciálne vystavoval týmto tagSNP. Okrem toho testy sme vykonali poskytol ďalší dôkaz o tom, že TC a CC genotyp spojené so znížením hladín expresie DNMT3A1
mRNA v žalúdočných rakovinových tkanív, výsledky naznačujú, že DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T >C polymorfizmus môže regulovať expresiu DNMT3A1 stroje a tým prispieť k GC citlivosti. Tieto dáta tiež ukázala, že DNMT3A1 môže hrať úlohu v progresii rakoviny žalúdka, ale potrebuje toto zistenie byť potvrdená väčšia populačnej štúdie. Pokiaľ je nám známe, je toto prvá správa a ukazuje, že DNMT3A1
transkripcie je priamo ovplyvnená funkčná tagSNP rs7560488 o DNMT3A1
promotorovou oblasť a tagSNP rs7560488T > C bolo spojené s výrazne vzrástol riziko GC. Ďalej sme vykonali experiment EMSA pre analýzu biologických následkov tagSNP rs7560488 polymorfizmu v BGC-823 buniek. Ako T alela a alely sondy C ukázala dva gél posuvu pásma, ale experimenty ukázali, súťaže väzbové afinity k jadrových proteínov variante alely sondy T vyššie ako pozorované s náprotivkom C alely sondy. Takže zvýšenú schopnosť viazať T alely DNA-proteín môže byť zodpovedný za zvýšenú DNMT3A1
aktivitou promótorom, ktorý sme pozorovali v našich testoch promótorom. Super-EMSA experiment použitý AP-1 protilátky nedostal posun super-gél je uvedené, že transkripčné faktory AP-1 sa nemôže vzťahovať k tvorbe transkripčných komplexov v rs7560488 mieste tagSNP. Ďalšie román výsledok pochádza z asociácie medzi vekom a rs7560488 T > C polymorfizmus vrstevnatého analýzy vyplynulo, že menej ako 60 rokov boli náchylnejší k rakovine žalúdka s tagSNP rs7560488 T > C. Je pravdepodobné, že DNMT3A1
ovplyvňuje transkripciu špecifických génov, najmä a zmeny v istých génov zvyšuje riziko GC. Tieto výsledky tiež ukazujú, že čím silnejší rizikový faktor pre GC je tagSNP rs7560488 T > C, zvlášť v mladom veku

Celkovo vzaté, táto štúdia poskytuje prvý mechanický vhľad do toho, ako bude tento nový funkčný tagSNP rs7560488 T >. C varianty je významne spojená s rizikom rakoviny žalúdka v čínskej populácie. Zistili sme, že T k zmene C zmenené z transkripčný aktivitu DNMT3A1
gén prostredníctvom ovplyvňovania väzby niektorých transkripčných faktorov, a tak meniť DNMT3A1 hladinu expresie, hoci určitý transkripčné faktory je potrebné ešte stanovená. Naše zistenia poskytnúť vhľad, že DNMT3A1
promotér rs7560488 T >. C variácie je sľubným biomarkerov zhodnotiť populáciu náchylné ku GC a poskytnúť cenné informácie k budúcemu výskumu v žalúdku rakoviny patogenézy

Poďakovanie

ďakujeme profesora Yaping Wang, Dr. Zhenming Cai, Cao Lili (univerzita v Nanjing, Nanjing, Čína) a Zhenghao Zhang (juhovýchodnej univerzita, Nanjing, Čína) pre riadenie ľudských zdrojov genotypu.

Other Languages