Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: klinicko Význam mikroRNA-214 v rakoviny žalúdka a jej vplyv na bunkovej biologickej správanie

Abstract

Hromadí sa dôkazy naznačujú, že početné microRNA sa podieľajú na vzniku nádorov a progresii karcinómu žalúdka, zatiaľ čo klinický význam mikroRNA-214 u karcinómu žalúdka je zle pochopený a presná úloha microRNA-214 v rakovina žalúdka zostáva nejasný. V tejto štúdii, expresné hladiny mikroRNA-214 v 80 rakovina žalúdka tkanív, 18 nontumourous žalúdočné tkaniva a 4 typov žalúdočné rakovinové bunkové línie boli kvantifikované pomocou reverznej transkripcie a následne v reálnom čase kvantitatívne polymerázovej reťazovej reakcie (RT-qPCR), a vzťah medzi mikroRNA-214 prejavu a cliniopathological charakteristík vrátane prognózy bol preskúmaný. Vyšetrovať možnú úlohu mikroRNA-214 v žalúdku rakovinových buniek biologické správanie, vykonali sme bunkovej proliferácie, apoptóza, migrácia a invázia testy v štyroch žalúdočných rakovinových bunkových línií a zvečnenie žalúdka bunkové línie in vitro
. Naše výsledky ukazujú, že microRNA-214 bol dramaticky downregulated v žalúdočných rakovinových tkanivách a bunkových línií karcinómu žalúdka v porovnaní s nontumourous žalúdočné tkaniva. Postupné zníženie expresie of microRNA-214 expresie bola pozorovaná u nontumourous žalúdočnej sliznice, nonmetastasis žalúdočné rakovinové tkanivá, a metastázovaniu rakovinových tkanív žalúdka. Expresie mikroRNA-214 bola výrazne negatívne koreluje s lymfatických uzlín a veľkosť nádoru, ale nemal žiadnu koreláciu s prognózou pacienta. Ektopická expresia mikroRNA-214 môže inhibovať migráciu buniek a invázie schopnosti v SGC7901 a MKN45 rakovina žalúdka buniek. A Vyradenie mikroRNA-214 podstatne uľahčené bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu buniek spôsobom, ktorý je špecifický v MKN28, BGC823 a bunky GES-1. Kolónie stimulujúce faktor 1 (CSF1) bol identifikovaný ako cieľový gén z mikroRNA-214. Stručne povedané, naše dáta ukázali, že microRNA-214 je sľubný nový biomarker pre lymfatických uzlín u pacientov s karcinómom žalúdka. A sme zistili, že znižujúce množstvo mikroRNA-214 môže regulovať proliferáciu, inváziu a migráciu buniek karcinómu žalúdka priamo cielenie CSF1

Citácia :. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) klinicko Význam mikroRNA-214 v rakoviny žalúdka a jej vplyv na mobilné biologické správanie. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong

prijatá: 25.dubna 2013; Prijaté: 11.02.2014; Uverejnené: 10.03.2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (č 81172351 a 81372856). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou rakovinou a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete [1]. Cez značné štúdií o tumorogenézy a progresii GC, patogenéza tejto zložitej ochorenia je zle pochopený. Preto je nanajvýš klinickú hodnotu na zisťovanie a charakteristiku presný molekulárnej mechanizmus podieľa na rozvoji a progresiu karcinómu žalúdka.

Na rozdiel od konvenčných genetické a epigenetické zmeny onkogénov kódujúcich proteíny a tumor-supresorových génov karcinogenity GC, neproteínová-kódovanie RNA, najmä microRNA (miRNA), sa objavili ako nový hráč vrhnúť svetlo na mechanizmus vývoja GC [2]. Mierny sú endogénne 19-25 nt nekódovacích RNA, ktoré negatívne regulujú expresiu proteínu tým, že podporuje degradácii mRNA alebo potláčať transláciu proteínov, a to prostredníctvom interakcie s 3'-UTR cieľovej mRNA. Rastúci počet miRNA boli hlásené k účasti v karcinogenéze a rozvoj ľudských nádorov, vrátane GC [2] - [4]. Tieto miRNA sú obvykle ich poškodenia a funkcie buď ako nádorové supresormi alebo onkogénov v iniciácii a progresii ľudských karcinómov. Napríklad, Tsukamoto et al. ukázali, že mier-375 sa downregulated v karcinómu žalúdka a uplatňuje svoj účinok prostredníctvom proapoptotických downregulating PDK1, kinázy, ktorá fosforyluje Akt, a tým potláča PI3K /Akt dráhy [5]. Kým MIR-21 bolo zistené, že podporujú proliferáciu nádoru a invázii v GC tým, že negatívne reguluje dôležité nádorové supresormi, ako sú Ptení, PDCD4 a Reck, a potom sa zveriť GC buniek so zvýšenou invazívnosti a schopnosti vyhnúť sa anoikis [6] - [8 ]. Už skôr sme zistili, že mier-145 sa downregulated v rozličných ľudských nádorových buniek a potlačil inváziu metastáz kaskádu v GC inhibíciou N-cadherin transláciu proteínov [9], [10].

V súčasnej dobe klinický význam mikroRNA-214 (MIR-214) v prognóze pacientov s GC je zle pochopený, a presná úloha Mir-214 v GC zostáva nejasný. Tu sme skúmali súvislosť medzi MIR-214 expresie a cliniopathological parametrov, ako aj hodnotia vplyv Mir-214 na biologické správanie, vrátane bunkovej proliferácie, apoptózy, migrácia a invázia buniek GC.

Materiály a metódy

vzorky tkaniva

vzorky tkaniva boli pripravené podobným spôsobom, ako bolo opísané skôr [9]. V stručnosti, 80 vzoriek (z 65 mužov, 15 žien; 58,3 ± 17,49 a 61,5 ± 9,162 rokov starý, v uvedenom poradí) GC tkanivá boli získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgickú resekciu u Qi Lu nemocnici Shandong University od roku 2004 do roku 2006. Nontumourous žalúdočnej sliznice viac ako 3 cm od nádorov bol náhodne vybraný zo 18 týchto pacientov, a použité ako kontroly. Žiadny z pacientov bola predoperačnej liečbu, ako je rádioterapia alebo chemoterapia. Vzorky boli zadané histologicky podľa Lauren je a Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO) 's klasifikáciou (IARC Press, Lyon, 2000), a kategorizované podľa UICC TNM 2002 klasifikácie.

tvrdenie etika

štúdia bola schválená etickou komisiou zo School of Medicine, Shandong University, Shandong, Čína (kód schválenia: 201101015). Získali sme písomný informovaný súhlas od všetkých účastníkov zapojených v našej štúdii.

Bunková kultúra

štyri typy ľudských bunkových línií GC boli získané z American Type Culture Collection (MKN28 a MKN45, Manassas, VA , USA) a Shanghai Cancer Institute (BGC823 a SGC7901, Shanghai, Čína). Imortalizovaná žalúdočnej sliznice epitelové bunkové línie GES-1 bol získaný z Pekingu ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, Čína). Bunky boli udržiavané v médiu RPMI 1640 kultivačné médium doplnené sérom 10% fetálne bovinné (FBS) vlhké s inkubátora s atmosférou 5% CO 2 pri teplote 37 ° C.

miRNA extrakcie

Pomocou miRNeasy FFPE Kit (Biotek, Peking, Čína), my izolovaný Mirny z parafínových tkaniva v súlade s pokynmi výrobcu. Celková RNA z bunkových línií bola extrahovaná TRIzolu činidlo (Takara, Dalian, Čína) podľa návodu výrobcu. Kvalita a kvantita vzoriek RNA bola hodnotená štandardnými metódami spektrofotometrickým (BioPhotometer PLUS; Eppendorf, Hamburg, Nemecko) a riedi na 2 ng /ul pre RT-qPCR analýzy

reverznej transkripcii nasleduje reálnom čase. kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-qPCR)

Mirna expresné hladiny boli kvantifikované za použitia SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (Takara, Dalian, Čína) podľa inštrukcií výrobcu s Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 v reálnom -time systém. V stručnosti, vzorky RNA boli premenené na cDNA pomocou One-step Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Čína), nasledovaný real-time qPCR a normalizované pomocou U6 malé jadrové RNA (RNU6B) od 2 -ΔCT metóda. Primery pre mier-214 a U6 boli od GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Všetky reakcie boli vykonávané v duplikátoch.

transfekciu buniek

Exponenciálne rastúce bunky (1,5 x 10 5) boli schovať v 12-jamkových doštičkách 12 hodín pred transfekciu a boli prenesené s 30 nM MIR-214 prekurzor (MIR-214), anti-MIR-214 inhibítor (MIR-214 inhibítor), alebo negatívna kontrola (Ambion, Austin, TX, USA) s použitím transfekčního činidla X-tremeGENE (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Účinnosť transfekcia bola sledovaná pomocou RT-qPCR 24, 48, a 72 hodín po transfekciu.

Pre stabilné expresiu MIR-214, SGC7901 a MKN45 bunky boli transfekovány lentivirus MIR-214 exprimujúce vektor LV3-HSA -miR-214 alebo negatívna kontrola LV3NC, ktorý má GFP ako marker proteínu, podľa protokolu výrobcu (GenePharma, Shanghai, Čína). Tri dni po transfekciu sa expresia GFP proteínu bola sledovaná pod fluorescenčným mikroskopom. Transfekované bunky boli podrobené skríningu s puromycinem (1,5 ug /ml) pre tých, stabilne exprimujúcich MIR-214.

testu proliferácie buniek

Po transfekciu boli bunky trypsinizovány, spočítané a vrúbľovať do 96 no dosky pri hustote 5 x 10 3 buniek /jamku. A potom proliferácie buniek bola meraná s použitím testu proliferácie edu, ako bolo oznámené predtým [11]. V stručnosti, 24 hodín po transfekciu boli bunky kultivované v trojitom prevedení pri 5 x 10 3 buniek na jamku v 96-jamkových doštičkách v deň pred edu inkubácie (Ribobio, Guangzhou, Čína). Po značenie edu, bunky boli ošetrené s 100 ul 1 x Apollo reakcie koktail, farebné s 100 ul Hoechst 33342 (5 ug /ml) a vizualizované pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus, Japan). Percento edu pozitívnych buniek bola definovaná ako rýchlosť proliferácie. Údaje boli získané z troch nezávislých experimentov a prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD).

apoptózu buniek Test

Tri dni po transfekciu MIR-214 prekurzora alebo inhibítora, boli bunky pozbierané a farbené s použitím annexinu v-FITC /PI apoptózu Detection Kit (BestBio, Shanghai, Čína), ako bolo opísané skôr [12]. V stručnosti, bunky boli trypsinizovány, zhromaždené a potom zafarbené pomocou annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit podľa pokynov výrobcu. Po inkubácii s annexinu V-FITC a PI, že apoptotické bunky boli okamžite analyzované prietokovou cytometriou. Zavčas apoptotické bunky boli definované ako populácia, ktorá bola PI negatívne a annexin V-FITC pozitívne, zatiaľ čo neskoré apoptotické bunky boli PI pozitívne a annexin V-FITC pozitívne. Celková proapoptotický sadzba bola vypočítaná ako na počiatku apoptotické miery zvýšenej o neskoro apoptotické sadzby. Annexin V-PE /7-AAD Apoptóza Detection Kit (Keygen, Nanjing, Čína) bol použitý pre stanovenie obsahu apoptózy lentivirus vektorových transfekciou buniek, podobne ako vyššie uvedené protokoly. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach a údaje boli uvedené ako priemer ± SD.

Migrácia buniek a invázie testy

migrácie a invázie buniek test bol vykonaný ako bolo predtým popísané [13]. Migračný test bol vykonaný s transjamkových vložky s 8,0 mm veľkosti pórov membrány (vo formáte 24-jamkové, Corning, New York, USA). Pre meranie invázne schopnosti GC buniek, predtým zmienené vložky boli vopred potiahnuté Matrigel matice (BD Science, Sparks, MD, USA). Bunky (1 x 10 5) boli resuspendované v médiu bez séra a nasadené do hornej komory. Spodná komory boli naplnené kompletné kultivačné médium, obsahujúce 10% FBS. Po inkubácii pri teplote 37 ° C počas 24 hodín, sa migrované bunky prítomné na spodnej strane membrány boli fixované, zafarbené a počítané. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.

boli vykonané Luciferase Assay

Dual-luciferázy test, ako bolo opísané skôr [9]. 3'-UTR fragmenty CSF1 génu, ktorý obsahuje väzobné miesto pre mier-214 bola amplifikovaná pomocou PCR z MKN45 bunkovej RNA s použitím primérov v tabuľke S1, a vložený do miesta Xba1 pmirGLO miRNA cieľového expresného vektora (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Výsledný vektor bol pomenovaný pmirGLO-CSF1. Pre luciferázové reportéri testu, MKN45 a BGC823 bunky boli schovať na 12-jamkové doštičke deň pred transfekcia. Bunky boli kotransfekovány s 30 nM Mir-214 prekurzoru alebo MIR-214 inhibítor, negatívna kontrola a 30 ng pmirGLO-CSF1 za použitia X-tremeGENE transfekčního činidla (Roche Applied Science). Po 48 hodinách transfekcia, aktivita luciferázy bola meraná s použitím testovacieho systému dvojitej pre luciferázy (Promega) a normalizuje na aktivitu luciferázy Renilla. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach.

Western blot

za 48 hodín po transfekciu s Mir-214 prekurzora alebo inhibítora, boli bunky podrobené analýzy western blot, ako bolo opísané skôr [19]. Stručne, proteín bol extrahovaný z buniek alebo tkanív. Lyzáty boli rozdelené elektroforézou, prenesené na nitrocelulózové membrány a blotovány s protilátkami proti CSF1 (1: 1000, Epitomics) alebo p-aktínu (1: 1000, Santa). Údaje boli získané z troch nezávislých experimentov.

Štatistická analýza

Analýzy boli vykonané pomocou štatistického balíka Prism 5 softvér (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Rozdiely boli analyzované študenta t
-test medzi dvoma skupinami alebo s jednocestným ANOVA medzi troma skupinami. Korelácia medzi MIR-214 expresie a veľkosti nádorov v primárnom GC bola vypočítaná korelácia Spearmanův. Krivky prežitia, dáta boli analyzované pomocou log-rank testu. Ak chcete zistiť, do akej miery expresie MIR-214 by mohla účinne oddeliť rôzne klinické subsettings, receiver operating analýza charakteristika (ROC) krivka bola skonštruovaná a plochu pod krivkou (AUC) bola vypočítaná pre posúdenie schopnosti MIR-214 prejavu diferencovať medzi prípadov rakoviny a nontumourous prípadoch, a rozlišovať metastáz tkaniva a nemetastázujúce tkaniva. P
-hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné.

Výsledky

MIR-214 je downregulated v karcinómu žalúdka tkanivách a štyroch bunkových línií GC v porovnaní s nontumourous žalúdočnej sliznice

v porovnaní s 18 nontumourous vzoriek žalúdočnej sliznice, MIR-214 bola výrazne downregulated (približne šesťnásobne) v 80 primárnych vzoriek žalúdočnej tkaniva (obrázok 1A P
= 0,0001). Prijímač prevádzková charakteristika (ROC) krivky MIR-214 sa odráža silnú oddelenie GC tkanív a tkanív, nontumourous s plocha pod krivkou (AUC) 0.7764 (obr S1A, 95% interval spoľahlivosti (CI), 0,6466-0,9062). Dôsledne, zníženie expresie MIR-214 bola overená v štyroch žalúdočných bunkových línií. Ako je znázornené na obrázku 1C je MIR-214 hladina expresie v bunkových líniách GC MKN28, BGC823, MKN45 a SGC7901 sa výrazne oslabených v porovnaní s 18 nontumourous vzoriek žalúdočnej tkaniva ( P Hotel &0,05).

Avšak sme zistili, ešte nižšie expresie Mir-214 v GES-1, imortalizované žalúdočné epiteliálne bunkové línie, ako v štyroch GC bunkových línií (Obrázok 1C, P Hotel &0,05). Domnievame sa, nesúlad môže byť spôsobený aspoň čiastočne na rozdiele medzi klinických vzoriek a bunkových línií, pretože bunková línia, izolovaný od jedného pacienta s určitým ochorením, predstavuje miRNA výraz podpis iba jedného klinickej vzorky a môže zmeny počas bunky kultúra in vitro
; inými slovami, vzorky tkaniva sú oveľa ako ľudské kontextu než bunkových línií. Preto sme vyjadriť, že mier-214 expresie v ľudských tkanivách GC bol reprezentatívnejší a dôveryhodné, ako je nájdený v bunkových líniách.

Znížená MIR-214 expresie v GC je spojená s lymfatických uzlín a veľkosť nádoru, ale nemá korelácia s prognózou pacienta

Ak chcete zistiť potenciálny klinicko dôsledky pozmenenej expresie MIR-214, sme kombinovali výsledky qPCR a klinické parametre. Korelácia medzi mierou expresie Mir-214 a klinicko-charakteristiky GC sú zhrnuté v tabuľke 1. Mir-214 expresia bola nepriamo úmerná veľkosti nádoru (tabuľka 1, t
-test, P
= 0,0265; Obr 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) a lymfatických uzlín (tabuľka 1, Figure1A, t
-test, P
= 0,0164). Avšak, tam nebol žiadny významný rozdiel v iných klinicko-funkcií, ako je pohlavie, distálny metastázy, ktorý histologické klasifikácie a histologický typ Lauren medzi týmito dvoma skupinami.

Je zaujímavé, že sme zistili, postupnú znižujúce množstvo MIR-214 medzi nontumourous žalúdočných sliznice, nonmetastasis tkaniva a metastázy tkaniva (1A, jednosmerná ANOVA, P
= 0,0006). Pre vyhodnotenie MIR-214 expresie v GC ako nový biomarker lymfatických uzlín, boli založené ROC krivky. Pozorovali sme jasné separáciu medzi pacientmi s lymfatických uzlín a tie bez lymfatických uzlín, s AUC 0.5880 (obr S1B, 95% interval spoľahlivosti, 0,4526 do 0,7166). Primárne žalúdočné tkaniva boli ďalej rozdelené do nízkej metastáz skupinu a vysoko metastáz skupiny v závislosti od počtu lymfatických uzlín (LNM): nízky metastáza bola definovaná ako prípadoch s menej ako šiestimi LNM, a prípady s viac ako šesť LNM boli považované za vysoko metastáz. Ako sa dalo očakávať, MIR-214 expresie bola v skupine s vysokým metastáz dramaticky poklesol v porovnaní s nízkou tvorbu metastáz skupiny (obrázok 1B, P
= 0,045).

V súlade s vzorky tkaniva údaje označujúce korelácia medzi MIR-214 expresie a LNM, sme zistili, že v porovnaní s mierne dobre diferencovaného bunkové línie MKN28, MIR-214 expresia bola výrazne nižšia u zle diferencovaných bunkových línií MKN45 a BGC823, a najmä metastatický bunková línia SGC7901 [14] ( P Hotel &0,05)

Avšak, naše dáta ukázali, žiadny významný rozdiel MIR-214 expresie v 18 vzorkách primárnych žalúdočné tkaniva a ich sekundárne metastázy loci (obrázok 1B. P
= 0,2676). Tieto výsledky naznačujú, že zníženie expresie MIR-214 expresiu došlo v rannom štádiu vývoja LNM a zostal stabilný bez ďalšieho útlmu v neskorom štádiu metastáz.

Ak chcete ďalej skúmať účinok Mir-214 na prognózu pacienti, sme analyzovali hladiny expresie Mir-214 v prípadoch s rôznymi stavu relaps a prežitie podmienok. Avšak, naše dáta ukázali, že neexistuje žiadny výrazný rozdiel medzi relapsu skupinou a nonrelapse skupinou, alebo medzi skupinou prežitie a skupinou smrti (Obrázok 2A-B, t-test
, P
&0,05). Dôležité je, že sme rozdelili pacientov do vysokej expresie a nízku expresiu skupín založených na úrovni mediánu Mir-214 expresie, a Kaplan-Meierove krivky prežitia nevykazovali žiadnu významnú koreláciu medzi MIR-214 expresie a prežívania bez relapsu (obrázok 2C , pomer rizika (HR) 1,23, 95% interval spoľahlivosti (CI) 0,6596 až 2,285; P
= 0,5781), alebo celkové prežívanie (obrázok 2D, HR 1,20, 95% CI 0,6667 až 2,151; P
= 0,5832) u pacientov s GC.

Vplyv Mir-214 na proliferáciu buniek GC buniek

Ak chcete sledovať účinnosť transfekcia sme zistili, MIR-214 expresie RT-qPCR u 24, 48, a 72 hodín po transfekciu v Mir-214 prekurzora alebo inhibítor transfekované bunky a priebežne detekované Mir-214 expresie lentivirus vektorov buniek ošetrených počas 4 týždňov. Ako sa dalo očakávať, transfekcia MIR-214 prekurzora účinnej k významnému nadmernú expresiu MIR-214 (obr S2A-B, P Hotel &0,05) a mier-214 inhibítor výrazne znížená MIR-214 expresiu v spätných 214 bunky inhibítor prenesené než negatívnych skupín (obr S3E-F, obr S4 a, P Hotel &0,05). Tiež sme zistili, že bunky transfekované vektorom lentivirus LV3-HSA-MIR-214 by mohla viesť k 7 až 96-násobné zmeny MIR-214 expresie v SGC7901 a MKN45 buniek (obr S3A-D, P
menšia ako 0,05), s 80% až 90% buniek exprimujúcich GFP markerovou proteín (obr S3A, B)

na určenie, či MIR-214 by mohla mať vplyv na proliferáciu GC buniek, proliferácia test bol použitý k edu. odhaliť schopnosti rastu buniek. Naše dáta ukazujú, že zvýšená expresia MIR-214 s lentiviurs vektorov alebo MIR-214 predchodcu neovplyvnilo rast buniek SGC7901 (3A-B, obr S2C-D, p 0,05) a bunkových línií MKN45 (obr S2E-F, Obrázok S5A-B, P 0,05). Zistili sme však, že downregualtion MIR-214 by mohol podporiť proliferáciu BGC823 (obrázok 3C-D, P
= 0,0010) a GES-1 (obr S4B-C, P =
0,0474), ale nie MKN28 bunkové línie (obr S5C-D, P
= 0,0938), a to spôsobom bunkovo ​​špecifické.

Role Mir-214 v bunkovej migrácie a invázie GC bunky

Ako MIR-214 expresia bola nepriamo spojená s lymfatických uzlín, máme záujem predovšetkým o schopnosti MIR-214 ovplyvniť migráciu a inváziu buniek. Naše výsledky ukazujú, že SGC7901 a MKN45 bunky transfekovány LV3-HSA-MIR-214 vykazovali významne znížila schopnosť migrácie a invázie, v porovnaní s LV3NC ošetrených buniek (obrázok 4A-B, obr S6A-B, P
< 0,05). A sme pozorovali, že downregualtion Mir-214 by mohlo uľahčiť migráciu a inváziu MKN28 (obrázok 4C-D, P
= 0,0491 a P
= 0,0127, v uvedenom poradí). Aj keď porazený z MIR-214 neovplyvnilo migráciu GES-1 buniek (Obr S4D-E, P
= 0,0879), umlčanie MIR-214 viedlo k nárastu o viac ako 40% vo vlastnostiach inváznych týchto buniek ( P
= 0,0046). Avšak, naše dáta ukazujú, že transfekcia MIR-214 predchodca nemal robustný vplyv na migráciu a inváziu buniek v SGC7901 (obr S2G-H, P Hotel &0,05) a MKN45 (obr S2I-J, P Hotel >. 0.05) bunky, v porovnaní s príslušnými negatívnymi kontrolami

vplyv Mir-214 na bunkovej apoptózy GC buniek

Ak chcete skúmať účinok spätných 214 na apoptózu buniek, sme vykonali testy apoptózy pomocou metódy farbenia /PI annexinu v-FITC. Naše výsledky ukazujú, že nadmerná expresia (MIR-214 prekurzor a lentivirus vektor) a Vyradenie MIR-214 by mohla mať vplyv apoptózu buniek zrejme v porovnaní s negatívnymi kontrolami v bunkových líniách štyri GC (na obrázku 5, Obrázok S2K-N, P
&0,05) a imortalizované bunkové línie žalúdka GES-1 (dáta nie sú uvedené). V skutočnosti sme zistili tendenciu pre-apoptózy schopnosť MIR-214 prekurzora v bunkovej línii MKN45 (obr S2M-N, P
= 0,0606), ale rozdiel nebol štatisticky významný.

MIR-214 priamo zameriava a down-reguluje CSF1 v žalúdočných rakovinových bunkách

na identifikáciu cieľov MIR-214, ktoré sme použili TargetScan algoritmus predpovedať MIR-214 ciele v ľudskej rakovine žalúdka. Medzi mnohých možných kandidátov, Vybrali sme sa na tie, je nadmerne exprimovaný v nádorových ochorení a pre rozmnožovanie a metastáz asociovaných génov, vrátane NOTCH2, FGFR1, CSF1 (obrázok 6A), AGAP2, CREB1, pre ďalšiu analýzu. Naše výsledky ukazujú, že mier-214 prekurzor transfekcia významne znižuje aktivitu Luciferase reportérovým génom fúzovania k CSF1 3'-UTR, s 29.60% a 30,61% zníženie v porovnaní s negatívnymi kontrolnými skupinami (obrázok 6B, P
= 0,0227 a 0,0093, v tomto poradí, pre bunkové línie a MKN45 BGC823). Vzhľadom k tomu, keď sa MIR-214 inhibítor transfekovány, v porovnaní s kontrolami (obr 6C, P
= 0,0115 a 0,0085, respektíve) aktivita luciferázy sa zvýšila o 34,49% a 42,25% v MKN45 a BGC823 buniek.

ďalej sme stanovili expresiu proteínu CSF1 westernovým prenosom v GC buniek transfekciou MIR-214 predchodca alebo inhibítora. V súlade s výsledkami luciferázové expresie CSF1 proteínu v SGC7901 a MKN45 buniek významne znížila (obrázok 6D-E, P
= 0,0037 a 0,0066, v tomto poradí) transfekované MIR-214 prekurzora a zvýšenie v MKN28 a BGC823 bunky (obr S7A-B, P
= 0,0049 a 0,0416, v tomto poradí) transfekované MIR-214 inhibítorom v porovnaní s príslušnými ovládacími prvkami. Tieto údaje naznačujú, že mier-214 inhibuje CSF1 transláciu v nádorových bunkách žalúdka.

Diskusia

Emerging dôkazy zdôraznila zásadný vplyv miRNA dysregulácia na tumorogenézy ľudských karcinómov [3], [4] , Mierny dysregulácia podporuje bunkovú proliferáciu, prepožičiava rezistenciu k apoptóze a zvyšuje invazívnosti a metastáz, a to prostredníctvom potláčaní následné nádorové supresormi alebo indukovať akumuláciu cieľovej onkogény, a tým sa podieľa na začatie, progresie a metastáz ľudských nádorov.
bolo zistené

Medzi nepreberné množstvo miRNA, porucha regulácie MIR-214 vo veľkom množstve ľudských nádorov [15] - [22]. Zníženie expresie MIR-214 pri liečbe rakoviny krčka maternice bolo hlásené niekoľko skupín, a mier-214 bolo preukázané, že inhibujú rast, migráciu a inváziu nádorových buniek krčka maternice zacielením onkogény MEK3, JNK1, Plexin-B1 a GALNT7 [15 ] - [17]. MIR-214 bolo tiež zistené, že sa znížila u karcinómu prsníka a prispievajú k prsníku tumorogenézy tým nenormálne zvýšené onkogénu Ezh2 akumuláciu a následnú proliferáciu buniek a nekontrolovanou invázii [18]. Avšak, Penna a kol. preukázali, že mier-214 je vysoko exprimovaný v ľudských melanómov a prispieva k progresii nádoru melanómu prostredníctvom potlačenie TFAP2C, homolog dobre zavedené melanómu nádorový supresor [19]. Tieto výsledky ukazujú, že úloha MIR-214 pri liečbe rakoviny, je tkanivovo alebo bunka-špecifické.

Nedávna štúdia Ueda et al. ukázal, že regulačné poruchy MIR-214 bola v korelácii s klinickým štádiom, peritoneálnej šírenie a prežívanie pacientov [20]. Avšak, presné role Mir-214 v progresii karcinómu žalúdka a jeho základné molekulárnej mechanizmus zostáva nejasná. Tu ukazujeme, že mier-214 bola podstatne znížená v GC, a to najmä v metastatických tkanív, čo ukazuje na možnú úlohu Mir-214 v predikciu lymfatických uzlín, ktorý bol ďalej podporovaný našej analýze ROC krivky. Okrem toho sme zistili, že nízka expresia MIR-214 mal sklon k väčšej veľkosti nádoru. Ak chcete na otázku, či porucha regulácie MIR-214 nesie biologický význam, sme použili nadväzujúce štúdium a funkčnú analýzu Mir-214 in vitro
. Avšak, naše údaje naznačujú, že mier-214 nemá žiadny vplyv na výsledky liečby, vrátane stavu relapsu a prežitie. Naše dáta ukázali, že zvýšená expresia MIR-214 sa lentivirus MIR-214-exprimujúcim vektorom výrazne znížiť migráciu a inváziu GC bunkových línií a Vyradenie Mir-214 by mohla uľahčiť bunkovej proliferácie, apoptózy, migrácie a invázie a to spôsobom, bunkovo ​​špecifické, s žiadny vplyv na apoptózu buniek.

CSF1 (faktor stimulujúci kolónie 1 (makrofágov)) je kritickým hematopoetický rastový faktor, zahrňujúci v makrofágov diferenciácie buniek, proliferácie a aktivácie, a to je tiež prítomný v non-krvotvorných buniek [21] , CSF-1 ovplyvňuje bunkové prežitie a proliferáciu väzbou na jeho receptor kódovaný c-FMS génu [22]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že CSF1 vyvíjaný dôležitú úlohu v podpore nádorové angiogenézy v leiomyosarcoma [23] a Lewis pľúcneho karcinómu buniek pomocou VEGF indukciu [24]. ALIGA S et al. navrhol, že CSF1 má pozitívny vplyv na pripojenie k pohrudničnej mezotelových buniek, invázia a proliferácia endometria buniek epitelu [25]. A zvýšené sérové ​​koncentrácie boli v korelácii s štádiu ochorenia, lymfatických uzlín a zlou prognózou u pacientov s nádorovým ochorením hrubého čreva a [26]. Tu sme identifikovali CSF1 bol priamym cieľom Mir-214 v karcinómu žalúdka prostredníctvom luciferázové testy a ďalej potvrdená analýzou Western blot. Naše údaje naznačujú, že zníženie expresie MIR-214 môžu uľahčiť množenia sa, migrácie a invázie kapacitu žalúdka nádorové bunky cez signálne dráhy CSF1 sprostredkované.

V predchádzajúcej štúdii, Ueda et al. ukázala, že relatívne vyššia expresie Mir-214 v GC bola spojená s nepriaznivým celkového prežitia u 101 pacientov (získané z University of Tokyo a Hiroshima University) [20], však, naše údaje naznačujú, že mier-214 nebola významne koreluje s pacientom výsledok. Domnievame sa, že tento rozpor môže byť kvôli rôznym metódam miRNA expresie detekcie, veľkosti vzorky, a následná doba medzi ich výskumu a naše. Ueda et al. rozdelil vzoriek do dvoch tried (vysoká a nízka expresia) s použitím priemernej hladiny miRNA expresie, merané na mikroRNA mikročipu ako prah, zatiaľ čo naše rozdelenie vysokej a nízkej expresie skupín bolo založené na strednú úroveň expresie získaných výsledkov qPCR , Je zaujímavé, že v predchádzajúcich štúdiách, MIR-214 expresie bolo preukázané, že up-regulovaná u karcinómu vaječníkov v porovnaní s normálnymi bunkami vaječníkov Yang et al. [27], zatiaľ čo opačné výsledky uvádza Nam et al. [28]. Obe tieto dve skupiny používajú miRNA microarrays skúmať výraz miRNA. Preto nemôžeme vylúčiť možnosť, že analýza microarray nemusí byť tak citlivá a presná pri analýze profilov expresie konkrétneho miRNA. Čo sa týka vplyvu Mir-214 na prognózu chorých s GC, čiastočne v súlade s výsledkami Ueda et al., Sme tiež našli tendenciu, že vysoká expresia MIR-214 bolo nepriaznivé pre prežitie, keď je doba sledovania bola dlhšia ako 40 mesiacov (pomer rizika (HR) = 1,19 pre celkové prežitie, HR = 1,23 pre bez relapsu prežitie), ako je znázornené na obrázku 2, aj keď tento trend nebol štatisticky významný. V každom prípade je potrebné vykonať ďalšie vyšetrovanie s väčším kohorta a rôznych experimentálnych nastavení, aby tento problém vyriešiť.

Pokiaľ ide o nesúlad MIR-214 lentivirus vektorov a transfekcia testoch prekurzorov sme domnievajú, že je špecifický dôsledok biologickej aktivity MIR-214. Mierny a stabilné expresie skôr než desiatky tisíc non-physiopathological overexpresion môže pomôcť MIR-214 fungujú dobre.

Celkovo vzaté sme ukázali, že mier-214 bola výrazne znížená v GC, a to najmä v metastatických tkanív, čo naznačuje, potenciálny úloha Mir-214 v predpovedanie lymfatických uzlín. Naša analýza ROC krivka ukázala, že relatívne vysoké špecificity a senzitivity Mier-214 pre rozlíšenie prípadov GC z nontumourous kontrol, a oddelenie pacientov s a bez metastáz do lymfatických uzlín, čo podnecuje jeho potenciálne využitie ako nového biomarkeru pre GC a lymfatických uzlín, čo bude užitočné pre uľahčenie klinické riadenie GC. Avšak, naše údaje naznačujú, že mier-214 nemá žiadny vplyv na prognózu pacienta, čo ukazuje, že mier-214 sama o sebe nestačí, aby vplyv na prežitie pacienta.

Other Languages