Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Gastric Cancer > žalúdočné Cancer

Ploche ONE: microRNA-10A down-regulované pomocou metylácie DNA a funguje ako nádorový supresor v žalúdku nádorových buniek

abstraktné

Pozadie

mikroRNA pôsobí ako posttranskripční regulátory génovej expresie v mnohých biologických procesoch. Ich deregulácie sa vyskytujú často u karcinómu žalúdka (GC). Hoci metylácie DNA predstavuje dôležitý mechanizmus pre mikroRNA dereguláciu rakoviny, toto pole zostáva z veľkej časti nepreskúmané.

Metodika /hlavných zistení

Celková RNA bola extrahovaná z tkanív 100 pacientov s GC a štyri žalúdočných nádorových bunkových línií. Hladiny expresie MIR-10a boli stanovené pomocou PCR v reálnom čase so špecifickými sondami TaqMan. Okrem toho bola vykonaná funkčná analýza Mir-10a v regulácii bunkovej proliferácie, migrácie a invázie. Následne, kvantitatívne metylácie špecifická PCR (qMSP) bola použitá na detekciu stavu DNA metylácie v CPG ostrovov proti prúdu o MIR-10a
. V tejto štúdii sme zistili, že expresia Mir-10a v GC buniek bola nižšia ako v normálnych bunkách, čo bolo spôsobené hypermetylace z CPG ostrovov proti prúdu MIR-10a
. Tiež overená na mierne nižšej expresiu Mir-10a v GC tkanivách než ich okolitom normálnom tkanív 100 pacientov GC a potvrdil hypermetylace CPG ostrovov proti prúdu MIR-10a
u niektorých pacientov. Okrem toho, opätovné zavedenie MIR-10a do GC buniek bola schopná inhibovať bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu. Bioinformatiky a analýza imunoblotu ukázala, že tumor potlačujúce role Mir-10a v GC buniek boli prípadne prostredníctvom cielenia HOXA1.

Závery /Význam

Naše dáta naznačujú, že mier-10a funguje ako nádorový supresor v GC buniek a je čiastočne umlčaný DNA hypermetylace v GC, čo naznačuje, že mier-10a môže slúžiť ako potenciálny diagnostické alebo terapeutické ciele GC

Citácia :. Jia H, Zhang z, D Zou, Wang B, yan Y, Luo M, et al. (2014) microRNA-10a je down-regulované podľa metyláciou DNA a funguje ako nádorový supresor v žalúdočnej rakovinové bunky. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057

Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de Genomique, Francúzsko

prijatá: 26. januára 2013; Prijaté: 04.01.2014; Uverejnené: 31.januára 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotácií z Národného Natural Science Foundation Číny (2011, 91129716, až JY), v Pekingu Mestského Science & Technológia Komisie (2010B071, aby J.Y.), Ústav základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied (2009RC03, aby J.Y.; 2010PYB06, aby J.Y.; 2012G04, aby J.Y.). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete [1]. Tak ďaleko, niekoľko tumor supresorové gény a gény nádorové súvisiace boli hlásené GC. Hoci rozsiahle štúdie boli vykonané na identifikáciu genetických ciest a mechanizmy podieľajúce sa na rozvoji rakoviny, boli vykonané viaceré vylepšenia na včasné diagnóze rakoviny. MikroRNA (miRNA) sú endogénne malé nekódujúca RNA, ktoré boli identifikované ako posttranskripční regulátory génovej expresie. Predchádzajúce štúdie ukázali, že miRNA vykonávať svoju funkciu cez nedokonalé párovanie báz s 3'untranslated oblasť (3 'UTR) cieľových mRNA [2], a miRNA boli rozsiahle študované v rámci regulácie bunkového cyklu, diferenciácie, apoptózy a vývoj [3], [4]. Nahromadené dôkazy naznačujú, že miRNA sú deregulované v rôznych ochorení, najmä rakoviny. Napríklad, mier-216B je výrazne down-regulované v nazofaryngálne karcinóm [4]; Mir-340 sa deregulované u karcinómu prsníka a môže inhibovať migráciu a inváziu rakovinových buniek prsníka [5]; a mier-31 bol identifikovaný ako onkogén v pažeráku spinocelulárneho karcinómu [6]. Dohromady sa miRNA bola identifikovaná ako potenciálnych kandidátov na nové diagnostické biomarkery alebo terapeutických cieľov rakoviny.

MIR-10a bolo hlásené, že hrajú dôležitú úlohu pri vzniku a vývoji rôznych ľudských rakovín. Napríklad, mier-10a deregulované v oblasti hlavy a krku skvamóznych karcinómov a tiež v hepatocelulárneho karcinómu [7], [8]. Okrem toho, v ľudskej rakoviny krčka maternice, MIR-10a slúži ako onkogén regulovaním CHL1 [9]; down-reguláciu MIR-10a v chronickej myeloidnej leukémie podporuje CD34 + buniek proliferácia [10]. Avšak funkcie Mir-10a a mechanizmus základné žalúdočné karcinogenézy zostávajú nejasné. V tejto štúdii sme sa presne meria expresie Mir-10a v 100 pacientov s rakovinou žalúdka a skúmali úlohu Mir-10a do buniek karcinómu žalúdka. Zistili sme, že mier-10a bola down-regulované v GC tkanivách a presadzovaná expresiu Mir-10a potlačil množenia sa, migrácie a invázie GC buniek.

epigenetických modifikácií vrátane DNA hypermetylace, histónov deacetyláciou histónov a metylácie sú úzko spojený s génovou inaktiváciu. Promoter hypermetylace je považovaná za alternatívny mechanizmus k down-regulácii nádorové supresorové gény v ľudskej rakoviny [11]. Mierny, ktorých expresia je potlačená metylácie DNA boli opísané v niekoľkých ľudských nádorov [12] - [14]. Ak chcete ďalej skúmať, či je down-regulácia MIR-10a pochádza z hypermetylace v genómovej oblasti proti prúdu MIR-10a
sme analyzovali DNA metylácie CPG ostrova v oblasti promotora spätných 10a
u 55 pacientov GC a zistil, že down-regulácia MIR-10a GC tkanivách môže byť vzhľadom k hypermetylace CPG sekvencií v jeho zriaďovateľom.

materiály a metódy

Pacienti vzorky a

Humánne klinické vzorky boli odobraté z chirurgických vzoriek od 100 pacientov s GC v Cancer Institute a nemocnice, čínskej akadémie lekárskych vied, General Hospital ľudovej oslobodeneckej armády a nemocnice Shanxi rakoviny. Zodpovedajúce susedné nenádorových tkanív z makroskopického nádoru rozpätie boli izolované v rovnakom čase, a použité ako kontroly. Nádory boli predstavené v závislosti na TNM (2010) klasifikačné kritériá Európskej únie pre medzinárodný boj proti rakovine (UICC). Všetky vzorky boli rozdelené na dve časti, a bol bleskovo okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C až do extrakcie RNA. Štyri žalúdočné rakovina bunkové línie (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 a MKN-45) boli všetky zachované v našom laboratóriu a udržiavané v DMEM alebo 1640 s 10% FBS. Klinické Etická komisia Výskum Inštitútu základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied schválila výskumné protokoly a písomný informovaný súhlas bol získaný od účastníkov.

RNA extrakcia cDNA Syntéza mRNA a miRNA a v reálnom time PCR

Celková RNA bola extrahovaná z žalúdočné rakovinových tkanív a buniek za použitia reakčného činidla TRIzolu (Invitrogen, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. RNA bola kvantifikovaná meraním absorbancie pri 260 nm a cDNA bola syntetizovaná M-MLV reverznej transkriptázy (Invitrogen) od 2 ug celkovej RNA. Oligo (dT) 18 boli použité ako priméry pre RT reverzné transkripciu mRNA. Kmeňová-loop RT primer bol použitý pre reverzné transkripciu miRNA. Kvantitatívny RT-PCR bola vykonávaná v Bio-Rad CFX96 real-time PCR System (Bio-Rad, CA, USA) za použitia SYBR Premix Ex Taq kit (Takara, Dalian, Čína), alebo TaqMan sond (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) podľa inštrukcií výrobcu. Podmienky PCR boli nasledujúce: 95 ° C počas 30 s, nasleduje 40 cyklov 95 ° C počas 5 sekúnd a 60 ° C počas 34 s. Pre mRNA, boli údaje normalizovali pomocou endogénnej kontrolnej GAPDH. Pre miRNA, U6 snRNA bola použitá ako vnútorná kontrola. Relatívne množstvo MIR-10a bola meraná s 2 -ΔΔCT metódy. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke S1.

DNA extrakcie, metylácie-špecifické PCR (MSP) a kvantitatívnej metylácie špecifickej PCR (qMSP)

Vysoká molekulová hmotnosť genomickej DNA bola extrahovaná z tkaniva karcinómu žalúdka za použitia DNA Extraction Kit (Biomed, BJ, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Hydrogensiričitanovú modifikácie bola vykonaná za použitia sekvenačnej súpravy Epitect bisulfitového (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa protokolu. Až 2 ug genómovej DNA bol použitý ako východiskový materiál. Normálny lymfocyt DNA zmieša s CPG metyltransferáza (M.SssI) (VO, MA, USA) bola použitá ako pozitívna kontrola a reakčný systém bez templátu bola používaná ako slepá kontrola.

sodná bisulfate- spracuje DNA bola amplifikovaná s použitím Bio-Rad CFX96 real-time PCR systému (Bio-Rad) s použitím KAPA SYBR FAST qPCR Kit (Kapa Biosystems) za nasledujúcich podmienok: 95 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 40 cyklov 95 ° C, po dobu 30 s, 54 ° C počas 30 s a 72 ° C počas 30 s a konečná extenzia pri 72 ° C počas 10 min. GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. qMSP reakcie boli vykonané v troch opakovaniach. Úroveň metylácie vo vzorke bola odhadnutá ako Lu L et al. opísal [15]. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke S1.

5-Aza-2'-deoxyazacytidine Liečba

žalúdočné rakovinové bunky boli nasadené na 10 cm misky (1 x 10 6 buniek na misku) jeden deň pred liečbu drogovej závislosti. Bunky boli ošetrené 1 uM 5-aza-2'-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) každých 24 hodín po dobu 3 dní.

Bunková kultúra a transfekcia oligonukleotidov

ľudskej žalúdočnej bunkové línie HGC-27, SGC-7901 a MKN-45 boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) doplnené 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, a MGC-803 bola udržiavaná v médiu DMEM (Gibco, BRL , UK) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom. Tieto bunkové línie boli udržiavané pri teplote 37 ° C vo zvlhčenom vzduchu obsahujúcom 5% CO 2.

MIR-10a napodobňujú, zhon napodobňovať, siHOXA1 siRNA a ťahanice siRNA boli syntetizované GenePharma (Shanghai, Čína ) a transfekovány do buniek v konečnej koncentrácii 50 nmol /L s použitím DharmaFECT1 činidlo (Dharmacon, TX, USA).

Cell proliferation a Colony Formation Test

mimic- alebo siRNA- transfekované bunky boli vrúbľovať do 96-jamkových doštičiek (5000 buniek /jamku). Bunky boli inkubované s 10% CCK-8 (DOJINDO, Japonsko) pri 37 ° C, až došlo k vizuálnej prevod farieb. Proliferačnej rýchlosti boli stanovené pri 0, 12, 24, 48, 72, 96 hodín po transfekciu.

napodobňovať transfekované bunky boli trypsinizovány a replated na 200 buniek na jamku v 6-jamkové doštičky a udržuje sa v roku 1640 sa 10% FBS. Bunky boli kultivované počas 7 dní, fixované metanolom a farbené 0,1% kryštálovou violeťou v 20% metanole počas 15 minút.

apoptózu Assay

apoptózy testy boli vykonávané v HGC-27 a MGC-803 bunkové línie pomocou súpravy na annexin v-FITC apoptóza Detection aj (BD Biosciences) podľa protokolu výrobcu a potom sa analyzujú Calibur prietokovom cytometri (Becton Dickinson).

Cell migrácie a invázie Testy

A test hojenie rán sa vykonáva za účelom hodnotenia migráciu buniek. Umelý rana bola vytvorená na splývajúce bunkovej monovrstvě bez FBS s použitím 200 ul pipety 24 hodín po transfekciu. Pre vizualizáciu migráciu buniek a hojenie rán, Snímky boli urobené pri 0 ° C, 12, 24, 36, 48, 60 hodín.

transwell invázie testoch, HGC-27 a MGC-803 bunky, suspendované v 0,2 ml RPMI 1640 alebo DMEM bez FBS boli umiestnené na hornej komory každej doštičky (Millipore, MA, USA) potiahnuté 40 ul 1 mg /ml Matrigel. Spodná komora bola naplnená 600 ul RPMI 1640 alebo DMEM médiu s 10% FBS, ako je nutričné ​​atraktantu. O 24 hodín neskôr, invázia bunky prichytené k spodnej ploche boli fixované 20% metanolom a zafarbené May-Gruwald-Giemsa (MGG). Membrány potom boli vyrezané a vložené pod krycie sklíčka. Bunky v troch rôznych zorných polí boli spočítané a všetky testy boli vykonané v troch opakovaniach.

Western Blotting

analýza Western blot bola vykonaná v súlade so štandardnými metódami. Proteíny boli separované pomocou 10% SDS-PAGE a potom prenesené na PVDF membrány (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membrány boli blokované cez noc s 5% netučného sušeného mlieka a inkubuje sa po dobu 2 hodín s anti-HOXA1 protilátky (Bioworld, MN, USA) pri riedení 1: 500 alebo anti-GAPDH protilátky (Proteintech, Chicago, USA) pri 1: 50.000 riedenie. Po premytí TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl a 0,1% Tween 20) boli membrány inkubované po dobu 2 hodín sa sekundárnou protilátkou (zsgb-Bio, Beijing, Čína).

<Štatistika br>

Každý pokus bol opakovaný aspoň trikrát. t testovacie študenta (dvojstranný) a x 2 testy boli vykonané, a štatistická významnosť bola definovaná ako alfa = 0,05 (obojstranne). Prostriedky ± SD sú zobrazené na obrázkoch.

Výsledky

MIR-10a je down-regulované v žalúdočnej nádorových buniek

Sledovali sme expresiu zrelej MIR-10a vo štyri rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 a MKN-45) a ľudský žalúdočný epitel bunková línia (GES). Hladina expresie MIR-10a GES bola významne vyššia než hladiny v oboch žalúdočnej nádorových bunkových línií (HGC-27 a MGC-803) a bola nevýznamne, ale pozorovateľni vyššie ako hladiny v oboch ďalších žalúdočných nádorových bunkových línií (MKN-45 a SGC-7901) (obr. 1a). Tieto údaje naznačujú, že down-regulácia MIR-10a by mohlo byť dôležité pre vznik a vývoj GC.

expresiu Mir-10a v klinickej GC pacientov a ich korelácia s klinicko Charakteristika

Pre ďalšie štúdium vzťahu medzi Mir-10a a GC vzniku sme zistili expresiu Mir-10a v 100 klinických pacientom TaqMan sondy odvodené z PCR v reálnom čase, ako je popísané vyššie. 100 párov vzoriek GC, expresie MIR-10a bola down-regulované v 58 prípadoch (58/100, 58%) v porovnaní so zodpovedajúcimi okolitého tkaniva (pozri obr. 1b). Celkovo sa expresia Mir-10a bola down-regulované v GC tkanivách v porovnaní s okolité tkanivá, aj keď down-regulácia nebol štatisticky významný (p = 0,148, párový t-test, dvojstranný) (obr. 1c).

pre vyhodnotenie korelácia medzi expresiou Mir-10a a klinicko-charakteristiky, pacienti boli rozdelení do dvoch skupín v závislosti od relatívnej expresie Mir-10a v nádorových tkanivách, v súlade s predtým publikované práce [16] , Ako je uvedené v tabuľke S2, štatisticky významná súvislosť bola pozorovaná medzi oboma skupinami TNM. Existuje viac pacientov, ktorí sú v I + II etapu v skupine s nižšou expresiou Mir-10a vo svojich GC tkanivách. Tento vzťah je uvedené, že mier-10a môže byť dôležitejšie na začiatku karcinogenéze rakoviny. Avšak, naše dáta ukázali, že hladina expresie MIR-10a nemal žiadnu koreláciu s vekom, pohlavím, histologický typ nádoru, percento, žilovej inváziu, nervové invázie, polohy, Borrmann písanie, Pt fáze, PN fáze alebo popoludní fáze.

MIR-10a inhibuje bunkovej proliferácie in vitro

Ak chcete preskúmať úlohu MIR-10a žalúdočné karcinogenéze sme transfekovány MIR-10a napodobňujú do GC bunkových línií HGC-27 a MGC-803, z ktorých oba vykazovali vysokú účinnosť transfekcia (viď obr. 2a). Ako ukazuje CCK-8 môžu testov rastu 0, 1, 2, 3 a 4 dni po napodobňovať transfekciu, zvýšená expresia MIR-10a znižuje bunkovú proliferáciu v oboch bunkových líniách, zatiaľ čo zhon napodobniť nemal žiadny vplyv na proliferáciu buniek v porovnaní s neošetrenými bunkami (viď obr. 2b). Následne testy tvorby kolónií boli vykonané pre hodnotenie proliferačnú schopnosť mimických transfekované HGC-27 a MGC-803 buniek, a ukázalo sa, že nadmerná expresia Mir-10a v bunkách HGC-27 znižuje tvorbu kolónií (viď obr. 2c). Avšak, žiadny z buniek MGC-803 vytvorených kolónií, ktoré by mohli byť v dôsledku relatívne slabú priľnavosť boli bunky. Aby sa ďalej hodnotiť vplyv Mir-10a na apoptózu buniek v oboch GC bunkových línií, skoré apoptózy MGC-803 a bunky HGC-27 bola skúmaná pomocou annexin V sfarbenie po MIR-10a napodobňovať transfekciu. Ako sa dalo očakávať, niekoľko zavčas apoptotických buniek (20,8% v roku HGC-27 a 22,9% v roku MGC-803) boli zistené v zhone mimických ošetrené bunky, zatiaľ čo MIR-10a napodobňuje ošetrenie zvýšilo percento skorých apoptotických buniek (28,4% v roku HGC -27 a 27,7% v MGC-803) (obr. 2d). Kolektívne sme dospeli k záveru, že mier-10a by mohlo potlačiť prežitie buniek v GC buniek indukciou bunkovej apoptózy.

MIR-10a Inhibuje Cell migrácie a invázie in vitro

Ďalej posúdila účinky MIR-10a o migrácii a invázii buniek, ktoré boli kľúčové determinanty malígny progresie a metastáz. Migračné schopnosť bola demonštrovaná na hojenie rán /scratch teste u HGC-27 a MGC-803 buniek. Obe bunkové línie ošetrené s Mir-10a napodobniť boli výrazne nižšie ako tie, ktoré sťahovavé liečených kontrolným šifrovacím alebo neošetrených buniek na 12, 24, a 36 hodín po poškriabaniu (obr. 3a). Ďalej sme vykonali test invázie buniek Matrigelu a zafarbia sa napadnuté bunky pre meranie smerových invázie schopnosti buniek, exprimujúcich po ektopicky Mir-10a v obidvoch bunkových líniách. Invazivitě z buniek transfektovaných s Mir-10a Mimic sa dramaticky znížila v porovnaní s kontrolou šifrovacím a neošetrených buniek (obr. 3b). Tieto výsledky ukázali, že mier-10a, hrá dôležitú úlohu v regulácii migrácie buniek a invazívnosť v GC a navrhol, že down-regulácia MIR-10a by mohli prispieť k nádorových metastáz v žalúdočnej rakoviny.

MIR-10a Targets HOXA1 v GC

miRNA plniť biologické funkcie cez negatívne regulovať svoje cieľové gény. Bolo oznámené, že onkogén HOXA1 je priamym cieľom Mir-10a v megakaryocytov a ľudskej rakoviny pankreasu [17] - [19]. Ako predpovedal PicTar, tam bol komplementárne sekvencie medzi moje-MIR-10a a HOXA1 3 'UTR (obr. 4a). Je však známe, či MIR-10a reguluje bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu v GC zacielením HOXA1. Objasniť ich regulačné vzťah, sme sa prvýkrát detekovaný proteín a hladiny mRNA HOXA1 v Mir-10a mimických transfekciou HGC-27 a MGC-803 bunkách pomocou Western blot a RT-PCR. Pozorovali sme zrejmý pokles hladiny HOXA1 proteínu v prítomnosti Mir-10a napodobňuje v porovnaní s kontrolou šifrovacím v dvoch bunkách (obr. 4b). Hladina mRNA HOXA1 tiež down-regulované v bunkách HGC-27, čo naznačuje, že mier-10a inhibuje expresiu HOXA1 degradáciou mRNA v bunkách HOXA1 HGC-27. Avšak, tam bola malá zmena v úrovni mRNA HOXA1 v MGC-803 buniek, čo naznačuje, že mier-10a môže down-regulujú expresiu HOXA1 cez transláciu mRNA, ale nie štiepenie v MGC-803 buniek (obr. 4C). Ďalej sme analyzovali hladiny proteínovej HOXA1 u 24 pacientov GC. Z týchto vzoriek bolo 12 pacientov, u ktorých MIR-10a bola down-regulované v ich GC tkanivách a 12 pacientov, u ktorých MIR-10a bola up-regulované v ich GC tkanivách (obr. 4d). HOXA1 bola up-regulované u väčšiny pacientov, u ktorých MIR-10a bola down-regulované v ich GC tkanivách. Podobne, HOXA1 bola down-regulovaná u väčšiny pacientov, u ktorých MIR-10a bola up-regulované v ich GC tkanivách. Porovnanie hladín Mir-10a a hladina bielkovín z HOXA1 v GC ukázala, inverzný koreláciu medzi Mir-10a a HOXA1 (r 2 = 0,1839, P = 0,0366) (obr. 4e). Kolektívne, tieto nálezy poskytujú silný dôkaz, že HOXA1 je priamym cieľom MIR-10a do GC. Tiež zistená úroveň mRNA HOXA1 u týchto pacientov, a pozorované, že hladina mRNA HOXA1 v niekoľkých pacientov, nie je v súlade s úrovni proteínu, ktorý ukázal, že mier-10a reguluje expresiu svoj cieľ, HOXA1 prostredníctvom transláciu, ale mRNA štiepenie u týchto pacientov (viď obr. S1).

Knock-down z HOXA1 vypnutý Žalúdočné Cancer Cell Growth a migračné in vitro

Next, sme sa opýtali, či HOXA1 hral dôležitú role v rakovinových bunkách žalúdka. Preskúmať úlohu HOXA1 v GC sme zrazil endogénnej HOXA1 v HGC-27 a bunkových línií MGC-803 pre detekciu účinok na bunkovú proliferáciu a migráciu buniek. Pozorovali sme, že HOXA1 represie inhibuje bunkovú proliferáciu a migráciu HGC-27 a MGC-803 buniek, v danom poradí (obr. 5a a 5b). Tieto výsledky naznačujú, že mier-10a funguje ako nádorový supresor v GC buniek podľa potlačenie HOXA1 výrazu.

MIR-10a, ktorý epigenetické tlmičom v GC bunkových líniách

Ak chcete zistiť, či sa na nízku expresiou spätných 10a v GC tkanive bol výsledok epigenetical úprav, sme liečili HGC-27, MGC-803, SGC-7901 a MKN-45 buniek s inhibítorom metylácie DNA 5-aza. Expresie MIR-10a bola up-regulované v HGC-27, SGC-7901 a MKN-45 bunky, keď boli liečení AZA, čo naznačuje, že expresia MIR-10a môže byť potlačené v týchto bunkách pomocou metylácie DNA (Obr. 6a).

Ak chcete štúdium regulácia MIR-10a metylácie DNA, sme prehľadali databázy genómu človeka na prítomnosť CPG ostrovov okolo MIR-10a pomocou softvéru "CPG ostrov Searcher" a identifikoval CPG ostrova umiestnené 1638 bp proti smeru MIR-10a
(viď obr. 6b). Ďalej sme zistili stav metylácie DNA pomocou qMSP a MSP v štyroch GC bunkových línií. CPG ostrova bola hypermethylated vo všetkých štyroch GC bunkové línie, ktorá bola v súlade s nízkou expresiou Mir-10a v týchto GC bunkových línií. Keď boli GC bunkové línie ošetrené s 5-aza-CdR, úroveň metylácie bola znížená v porovnaní so skupinou DMSO (viď obr. 6c).

Down-regulácia MIR-10a v GC pacientov bolo spôsobené hypermetylace jej CPG ostrovov

ďalej sme skúmali stav metylácie CPG ostrova v GC tkaniva a priľahlé normálneho tkaniva 55 náhodne vybraných prípadov cez qMSP. Úroveň metylácie v 55 GC tkanív bola vyššia ako v priľahlých non-rakovinové tkanivá (p 0,01), ktorá bola v súlade s nízkou expresiou Mir-10a GC tkanivách (obr. 6d). Okrem toho sme náhodne vybrané dva páry vzoriek pre analýzy DNA úroveň metylácie podľa bisulfát sekvenovania PCR (BSP) na overenie presnosti MSP. Výsledky BSP boli v súlade s tým qMSP a bola doplnená ako Obr. S2. Ďalej sa úroveň metylácie Mir-10a (M /M + U) v týchto pacientov GC vykazovali inverzný koreláciu s expresiou Mir-10a (r 2 = 0,1956, p = 0,0006) (obr. 6e). Tiež zistená úroveň metylácie Mir-10a v normálnej žalúdočnej buniek a žalúdočných nádorových bunkových línií. Výsledky qMSP odhalili, že ostrov CPG bol čiastočne metylovaný v GES bunkách, ale extrémne hypermethylated v dvoch žalúdočných rakovinových bunkových línií HGC-27 a MGC-803, ktorý tiež navrhol, že CPG ostrova pred MIR-10a
sa hypermethylated v GC buniek (obr. 6f). Súhrnne, tieto nálezy poskytujú silný dôkaz, že expresia MIR-10a bola regulovaná metylácie DNA u týchto pacientov GC. Down-regulácia MIR-10a u pacientov GC bolo spôsobené hypermetylace svojich CPG ostrovov.

Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že mier-10a bola down-regulované u človeka karcinómu žalúdka čiastočne vďaka svojej promotorové DNA hypermetylace. Ďalšie štúdie preukázali, že zvýšená expresia MIR-10a potlačená bunkovú proliferáciu, migráciu a šíri rýchlejšie v GC bunkových líniách HGC-27 a MGC-803, prípadne prostredníctvom cielenia onkogénu HOXA1.

boli hlásené miRNA regulovať rôznymi vývojovými a bunkové procesy, a sú zapojené do mnohých ľudských ochorení, najmä rakoviny. Mierny potláčajú expresiu génu cielenie mRNA prostredníctvom väzby na ich 3 'UTR. Tieto miRNA majú regulačnú úlohu v patogenéze rakoviny a sú zapojené do bunkovej proliferácie, diferenciácie, apoptózy, metastázy a odporu [4], [20]. MIR-10a hrá dôležitú úlohu v rôznych rakovín, vrátane karcinómom pečene [9], rakoviny pankreasu [17], akútna myeloidná leukémia [21] a chronickej myeloidnej leukémie [10]. Abnormálne expresie Mir-10a je pravdepodobné, že hrajú kľúčovú úlohu v malígnej transformácii a vzhľadom k tkanivovej špecifickosti. Jeho deregulácia môže prispieť k rozvoju neoplázia žalúdku.

Overenie expresie Mir-10a v klinických vzoriek ukázali, že mier-10a bola down-regulované v 58 (58/100, 58%), GC tkanív v porovnaní s okolitého tkaniva. Avšak, Weidong Chen et al.
Skúmali expresiu MIR-10a v 33 prípadoch, GC a poznamenal, že mier-10a expresie bola v GC tkanivách vyššie ako v okolitých tkanivách, [22]. Rozpor môže byť dôsledkom rozdielne množstvo klinických vzoriek a nevýrazného zmenou Mir-10a v GC tkanivách. Naše dáta by mala byť viac biologicky Loctite z dôvodu väčší počet klinických vzoriek. Iba väčšia časť, ale nie všetci pacienti GC majú down-reguláciu MIR-10a vo svojich tkanivách, hoci GC MIR-10a funguje ako nádorový supresor v nádorových bunkách žalúdka. To môže byť kvôli odlišnému mechanizmu genéza GC v rôznych jedincov. Tam by mohlo byť nejaké iné dôležité gény alebo faktory vedúce k tvorbe nádorov u pacientov GC, na ktorého GC tkaniva MIR-10a zostal bezo zmeny, alebo up-regulované. Okrem toho, expresia MIR-10a vykazoval žiadnu koreláciu s klinicko vlastnosťami okrem TNM fáze, čo ukazuje, že mier-10a môže hrať úlohu v čiastočnej nádorového ochorenia, najmä v skorých štádiách.

Veľa miRNA boli hlásené korelujú s vzniku nádorov, avšak základné molekulárnej mechanizmus zostáva nejasný. V našej správe, funkčné analýza MIR-10a, vrátane bunkovej proliferácie, migrácie a invázie testy, nám pomohli lepšie pochopiť prínos MIR-10a žalúdočné rakoviny. Transfekcia MIR-10a napodobňujú významne inhibovala proliferáciu buniek, migráciu a invazívnosť v GC buniek, čo naznačuje, že represia MIR-10a môže podporovať progresiu nádoru v žalúdočnej karcinogenéze. Je potrebné ďalšie štúdie na objasnenie tohto mechanizmu.

V ľudskom genóme, MIR-10a
leží proti prúdu HOXB4
. Mir-10b
, ďalší člen rodiny MIR-10, ktorý sa nachádza pred HOXD4
. Títo dvaja sa líšia od seba navzájom iba v jednej báze a majú identické sekvencie semien, čo naznačuje ich podobné funkcie. Kwoneel Kim [12] oznámil, že mier-10b hrá úlohu v GC ako nádorový supresor. V našej štúdii sme preukázali, že nadmerná expresia MIR-10a inhibovala proliferáciu nádoru, migrácia a šíri rýchlejšie ktorý bol podobný funkcie Mir-10b v GC. HOx gény sú vysoko konzervatívny transkripčné faktory, ktoré sú určujúce pre správne predozadná vzorovanie osi tela [23]. HOXA1 bol overený ako priamy cieľ Mir-10a v ľudskej rakoviny pankreasu [17] a megakaryocytov [18]. Pozorovali sme tiež, že nadmerná expresia MIR-10a zníženej hladiny HOXA1 proteínu v dvoch GC bunkových línií, čo naznačuje, že HOXA1 je priamym cieľom Mir-10a v karcinómu žalúdka.

epigenetických modifikácií bolo preukázané, že sú kľúčové mediátory z ktorého down-regulácia miRNA expresie a vykazujú tesnú koreláciu s karcinogenézy [12] [13], [24]. Naše dáta ukázali, že hypermetylace z CPG ostrova proti smeru MIR-10a
viedlo k down-regulácii MIR-10a v bunkových líniách GC a GC pacientov. Okrem toho, liečenie zvýšenej AZA Mir-10a v bunkových líniách GC. Na základe našich zistení, stav metylácie MIR-10a môžu byť použité ako potenciálny biomarker na GC.

Stručne povedané, táto štúdia uvádza, že mier-10a pôsobí ako nádorový supresor v GC buniek, a je čiastočne dole -regulated DNA hypermetylace. Nútená expresie MIR-10a potláča proliferáciu buniek, migrácia a invázia in vitro
. Stav metylácie a úroveň expresie Mir-10a môže slúžiť ako potenciálny biomarkery GC, a mier-10a môže mať potenciálny terapeutickú hodnotu pri liečbe rakoviny. Ďalšie štúdie o epigenetické regulácie miRNA prejavu sú nevyhnutné a regulácia miRNA expresie epigenetické liekov môže poskytnúť novú liečebnú stratégiu pre žalúdočné a iných ľudských nádorov.

Podporné informácie
Obrázok S1.
Hladina mRNA HOXA1 u pacientov 24 GC bola detekovaná QRT-PCR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0088057.s001
(TIF)
Obrázok S2.
BSP analýza metylačného statusu u dvoch pacientov GC. Naplnené a prázdne krúžky predstavujú methyluje a nemethylovaný miesta CPG respektíve
doi :. 10,1371 /journal.pone.0088057.s002
(TIF)
Tabuľka S1.
Primery sú použité v tomto článku
doi :. 10,1371 /journal.pone.0088057.s003
(XLSX)
Tabuľka S2. Združenie
medzi expresiou MIR-10a s klinicko funkcií u pacientov s karcinómom žalúdka
DOI :. 10.1371 /journal.pone.0088057.s004
(XLSX)

Poďakovanie

autori ďakujú Huali Zhao od IBMs (Institute of základných lekárskych vied), PUMC (Peking Union Medical College) pre technickú pomoc a Dr. Hongkai Zhang z Jiuxianqiao nemocnice za jej pomoc pri imunohistochémia.

Other Languages