Ploche ONE: microRNA 135a Potláča lymfatických uzlín cez down-regulácia ROCK1 v ranej rakoviny žalúdka

abstraktné

mikroRNA (miRNA) zohrávajú kľúčovú úlohu v progresii žalúdočné rakoviny a metastáz. Táto štúdia skúmala úlohu miRNA-135A na začiatku rakoviny žalúdka (EGC), vrátane lymfatických uzlín (LN) metastáz. Skúmali sme vzťah medzi miRNA-135a prejavu a klinické výsledky u 59 pacientov, ktorí podstúpili operáciu za EGC. Za použitia žalúdočné rakovina bunkových línií sme vykonali funkčné a cieľový gén analýzy. miRNA-135a bola expresie down-regulované v 33,9% pacientov. Títo pacienti vykazovali výrazne pokročilejšie fázy (TNM stage≥IB, 35,0% verzus 12,8%, p = 0,045) a vyššiu rýchlosť LN metastáz (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) než tí s up-regulácia miRNA-135a výraz. V viacnásobnej analýzy, down-regulácia miRNA-135A bol nezávislý rizikový faktor pre LN metastáz (pomer Upravené kurzy, 8,04; 95% CI, 1,08 až 59,81; p = 0,042). Funkčná analýza pomocou žalúdočnej rakovinové bunkové línie ukázalo, že miRNA-135a potlačená životaschopnosť buniek, epiteliálne-mezenchýmových prechod, invázie buniek a migrácie. ROCK1 bol terčom miRNA-135a a jeho expresie bola nepriamo úmerná k tomu miRNA-135A. ROCK1 expresia bola významne zvýšená u pacientov s EGC LN metastázy, ako u pacientov bez metastáz LN. Naše výsledky potvrdzujú nádoru potlačujúci úlohu miRNA-135A, a preukázať svoju úlohu v LN metastázy v EGC. miRNA-135a a jeho cieľový gén ROCK1
môže byť nová terapeutická a prognostické ciele pre EGC

Citácia :. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) microRNA 135a Potláča lymfatických uzlín cez down-regulácia ROCK1 v skorej rakoviny žalúdka. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko

Prijaté: 28. októbra 2013; Prijaté: 23.listopadu 2013; Uverejnené: 21.januára 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol financovaný z grantu 1110532-3 z National Cancer Center, Kórea. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy :. HA je ploche ONE redakčné člen predstavenstva a to nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

karcinóm žalúdka zostáva druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu po celom svete, a to napriek klesajúcej incidencie a úmrtnosti v rozvinutých krajinách [1 ].

V oblastiach, vrátane Kórei a Japonsku, kde screening rakoviny žalúdka sa vykonáva všeobecne, včasné odhalenie je často možné. Vzhľadom k tomu, zvýšená miera včasné odhalenie rakoviny žalúdka môže viesť k zlepšeniu prognózy, podielov na zlepšenie kvality života pacientov a s využitím minimálne invazívnej liečbu sa zvýšili. U pacientov s rakovinou žalúdka, lymfatické uzliny (LN), metastáza je jedným z najdôležitejších prognostických faktorov, a celkový výskyt v LN metastázy v skorej rakoviny žalúdka (EGC) sa pohybuje v rozmedzí od 5 do 20% [2] - [4].

gastrektómii s LN rozrábke je považovaná za štandardnú liečbu karcinómu žalúdka; Avšak, 80 až 95% pacientov s EGC nevyžadujú LN disekcia v prípade, že rakovina žalúdka je úplne vystrihnutá menej invazívne procedúry, ako napríklad endoskopické resekcii [5] - [7] alebo minimálne invazívne chirurgii ( napr
, jednoduchý klin resekcia alebo sentinel LN navigačné chirurgie) [8] - [10]. Hoci neboli vykonané štúdie biologických prognostických a prediktívnych markerov pre LN metastáz u EGC, žiadne prediktívne nástroje existujú pre metastáz v lymfatických uzlinách z EGC skutočnosti.

Niektoré štúdie uvádzajú, že hĺbka invázie, veľkosti nádoru a lymfatické invázie sú LN spojené s metastázami v EGC [4], [11]. Avšak, väčšina z týchto faktorov sa stanovili po konečnom patologické vyšetrenia pacientky po resekcii tkaniva, čo nie je užitočné pri určovaní liečebnej stratégie.

mikroRNA (miRNA) sú malé RNA kódujúci non-proteín. Štúdie preukázali, že zmeny v expresii miRNA prispieva k patogenéze rakoviny, vrátane tých, tráviaceho traktu [12] - [15].

miRNA bolo tiež preukázané, že sú užitočné v odlíšenie nádorových a normálnych tkanív [ ,,,0],16], [17]. Okrem toho, miRNA sú vyjadrené odlišne v každej fáze karcinómu žalúdka karcinogenézy [18]. miRNA-27 [19] a miRNA-200 family ZEB1 regulované [20], sa ukázali byť vo vzťahu k fáze epiteliálne-mezenchýmových prechodu (EMT) v karcinómu žalúdka. Z tohto dôvodu, miRNA môže byť spojená s procesom LN metastáz v EGC. Medzi miRNA, miRNA-135a, bolo preukázané, že je tumor supresívny miRNA a jeho expresie je down-regulovaná v niekoľkých nádorov, vrátane karcinómu obličky [21] a [22] lymfómu. Na druhej strane, nadmerná expresia alebo obnove miRNA-135A podporuje apoptózu a potláča množenie nádorových buniek prostredníctvom svojich cieľových génov c-myc [21] a JAK2 [22], resp. V in vitro
štúdie miRNA-135a potlačená migračnej a invazívne činnosť buniek karcinómu žalúdka [23]. Avšak, tumor supresívnu rolu miRNA-135a v karcinómu žalúdka, je nejasný.

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť vzťah medzi miRNA-135a expresie a klinické výsledky u pacientov EGC vrátane LN metastáz.

materiály a metódy

vzorky ľudských tkanív a klinické údaje

Päťdesiat deväť dospelých pacientov s diagnózou EGC v Národnom Cancer Center, Kórea, od januára 2011 do apríla 2013 bolo perspektívne zahrnuté táto štúdia. Títo pacienti boli liečení s otvorenou alebo laparoskopicky asistovanej gastrektómii s D1 + alebo viac LN pitvy. Rozsah LN pitvy nasledovala odporúčania japonského rakovina žalúdka asociácie [24]. Javisko po operácii bola hodnotená podľa 7. ^{ročníka spoločného výboru amerického pre staging systém Cancer TNM [25]. Ľudské tkanivá, vrátane ako žalúdočných rakoviny a zladené normálneho tkaniva od každého pacienta boli okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C. Z prehľadu lekárskych schémy, patologickým charakteristiky, vrátane veku, pohlavia, Helicobacter pylori
stav, nádorové charakteristiky, štádium, a stav LN metastázy boli získané a analyzované. Informovaný písomný súhlas bol získaný od všetkých pacientov a štúdia bola schválená Institutional Review Board of National Cancer Center, Kórea (NCCNCS-11-445).}

Bunková kultúra a transfekcia

normálny ľudský žalúdočné epiteliálne bunkové línie HFE145 [26], [27] bol dar od Dr Hassan Ashktorab a Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) a komerčne dostupných bunkových línií karcinómu AGS žalúdka, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 a SNU719 boli získané z Kórey bunkové línie Bank (KCLB, Soul, Kórea). Všetky bunkové línie boli udržiavané v médiu RPMI 1640 s obsahom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka (FBS) a 1% antibiotiká (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Z bunkových línií karcinómu žalúdka, MKN28 a SNU668 bunkové línie boli vybrané, pretože len zriedka exprimujú miRNA-135A, a YCC a KATOIII bunkové línie boli vybrané preto, že majú podstatný základné expresiu miRNA-135a (obrázok 1A). Transfekcia s miRNA-135A napodobňuje (Mirvana ™ miRNA napodobenín, Ambion, Austin, TX, USA), inhibítora miRNA-135a (inhibítor Mirvana ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, USA), a ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 ', UGBioneer, Seoul, Korea) v SNU668, YCC2, MKN28 a bunkové línie KATOIII boli vykonané za použitia Lipofectamine RNAiMAX a činidlá Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. MKN28, SNU668, YCC2 a KATOIII bunkové línie boli zberané dva dni po transfekciu a boli vykonané rôzne analýzy.

extrakcie RNA a miRNA kvantifikácia

Celková RNA bola izolovaná z 13 bunkových línií a 59 pacientov s karcinómom žalúdka "tkaniva, respektíve pomocou TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa návodu výrobcu. Použila TaqMan Universal PCR master mix činidlá kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japonsko). Amplifikácia a detekcia bola vykonávaná s použitím sekvencie systém detekcie 7900HT (Applied Biosystems, Tokyo, Japonsko) s 40 cyklami denaturácie pri 95 ° C (15 sekúnd) a žíhanie /predĺženie pri 60 ° C (60 sekúnd). Tento predchádzala reverzné transkripciou na 50 ° C počas 30 minút a denaturácia pri teplote 95 ° C počas 10 minút. Ku kvantitatívnemu zrelé miRNA, TaqMan microRNA Detekcia sady (Applied Biosystems, Tokio, Japonsko) boli použité pre detekciu miRNA-135A a kontroly miRNA (RNU6B).

Western blot analýza

Proteín bol extrahovaný z 13 bunkových línií a 59 vzoriek EGC pacientov tkanív pomocou pufra RIPA (Biosesang, Soul, Kórea), vrátane koktejlom inhibítora proteázy (Sigma, St. Louis, MO, USA) podľa protokolu výrobcu. Ďalšie, Western blotting bola vykonaná za použitia anti-ROCK1 a anti-β-aktínu (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) protilátky. Signály boli detekované s primárnou súpravy ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) podľa inštrukcií výrobcu.

testoch bunkovej proliferácie

Proliferácia buniek bola meraná s použitím testu MTT. Bunky boli nanesené na kultivačné doštičky s 96 priehlbinami (3 x 10 ^{3 buniek na jamku) a transfekují miRNA-135A napodobňuje po dvoch dňoch inkubácie. Následne sa 200 ul MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) bol pridaný do každej jamky. Po štyroch hodinách ďalšej inkubácie MTT roztoky boli odstránené, 200 ul DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) bol pridaný do každej jamky a doštička bola jemne pretrepávania. Absorbancia bola meraná na čítačke ELISA (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) pri skúšobnej vlnovej dĺžke 570 nm.}

bunkového cyklu analýza

Bunky boli nanesené v 60π kultivačnej doštičky a transfekovány miRNA -135 napodobňuje alebo ich miRNA napodobňuje negatívna kontrola (napodobňuje-NC). Tieto bunky boli zozbierané trypsinizací a fixované v 70% etanolu počas najmenej dvoch hodín pri teplote -20 ° C. Bunkové pelety boli premyté studeným fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom a inkubovaná počas 30 minút pri teplote miestnosti v PI /RNázy Farbenie Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Po farbení, vzorky boli analyzované pomocou FACScan prietokovom cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a 10.000 udalostí boli zhromaždené na vzorku. Dáta z prietokovej cytometrie boli analyzované pomocou Cell Quest softvéru (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

migrácie Trans-filter a invázie testy

Bunky boli transfekovány s miRNA-135A napodobňuje inhibítory miRNA-135a, ROCK1 siRNA, a ROCK1 siRNA negatívna kontrola (scrn) na jeden deň a potom sa prenesie do hornej komory transwell doštičky potiahnuté 0,5 mg /ml kolagénu typu aj (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) a 1:15 riedenie Matrigelu (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 s 10% FBS a 1% antibiotiká (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) bolo pridané do dolnej komory a doska sa inkubácia po dobu 20 hodín. Migrácia a napadajúce bunky boli kvantifikované pomocou hematoxylínom a eosínu.

luciferázové reportéri plazmidy stavby

Divoký typ 3 'UTR ROCK1 obsahujúce väzobné miesta pre miRNA-135A bola amplifikovaná za použitia gDNA z SNU668 bunky ako šablónu. Porovnávaných mutantný konštrukty boli vytvorené mutáciou semien regióny väzobných miest miRNA-135. Ako divokého typu a mutantný 3 'UTR boli klonované v po smere od génu luciferázy v kontrolnom pGL3 vektora. Tieto konštrukty boli overené sekvenovaním.

Luciferase Assay

luciferázy testy boli vykonávané v SNU668 a YCC2 buniek. SNU668 a YCC2 bunky boli transfekovány s každým z plazmidov (prázdny vektor [MOCK], ROCK1 3 'UTR divokého typu [WT], a ROCK1 3' UTR mutant [MUT], ako väzobné miesto pre miRNA-135a), spolu s miRNA- 135a napodobňuje, inhibítory miRNA-135a, a negatívne kontrolné RNA v 24-jamkových doštičkách. Dva dni po transfekciu boli bunky zozbierané a lyžovanie. Luciferázové testy boli vykonané na lyzátov s použitím luciferázového testovacieho kitu (Promega, Madison, WI, USA). Aktivita luciferázy sa normalizovali na beta-galaktozidázu.

Imunohistochemické farbenie

Imunohistochemické (IHC) farbenie bolo vykonané za reprezentatívnych 20 prípadov z ROCK1 nízke a vysoké expresie skupín. Antigén vyhľadávanie bolo vykonané tepelné spracovanie po dobu 30 minút pri pH 8,0 Tris-EDTA pufra (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) pri teplote 95 ° C. Tkanivové rezy boli inkubované pri teplote 42 ° C počas 30 minút s anti-ROCK1 mAb (ab134181, klon EPR638Y, králičie monoklonálne, 1: 5,000; abca, Cambridge, MA, USA). Negatívne kontroly boli zhodne používané s nonimmunized IgG. Výsledky boli interpretované skúseným patológom (MC Kook).

Štatistická analýza

Scale Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Chi-štvorcové alebo Fisherov presný test a test Mann-Whitney U boli použité k porovnaniu kategorické premenné a spojité premenné, resp. Pearson korelačný koeficient bol použitý pre porovnanie expresie génu vzor medzi miRNA-135A a ROCK1. S viac premennými logistický regresný model bol použitý pre určenie nezávislé faktory spojené s LN metastáz. Premenné, ktoré boli významné pomocou chi-kvadrát alebo Fisherov presný test ( P Hotel < 0,05) boli vložené do modelu logistickej regresie. Všetky dáta sa analyzujú za použitia Stat 12,1 (Stat Corp, College Station, TX, USA). A P
hodnota je nižšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

Výsledky

úrovňou miRNA-135a expresie sú spojené s progresiou a LN metastáz u EGC

predchádzajúce štúdie ukázali, že miRNA-135a expresie je down-regulovaná v žalúdočných rakovinových bunkových líniách [23]. Pomocou QRT-PCR sme tiež zistili, že miRNA-135a expresie je down-regulované v rôznych bunkových línií karcinómu žalúdka v porovnaní so, že v normálnej žalúdočnej epiteliálne bunkové línie (obrázok 1A).

Avšak, je vzťah medzi miRNA-135a výraz a klinické výsledky u karcinómu žalúdka nebola skúmaná. Preto sme merali hladiny miRNA-135A výraz v primárnej rakoviny žalúdka a ich zodpovedajúce hodnoty v normálnych tkanivách z 59 pacientov s EGC. Následný a up-regulácia génov v nádorových tkanivách s ohľadom na normálnu tkanivá boli definované ako pomer nádoru na normálnych tkanivách génovej expresie < 1,0 a >. 1,0, v danom poradí

A naopak k výsledku zo in vitro
experiment, iba 20 (33,9%) zo 59 pacientov s EGC vystavoval down-regulácia miRNA-135a výrazu. Avšak títo pacienti významne ukázal pokročilejšie fázy (TNM stage≥IB, 35,0% verzus 12,8%, p = 0,045; surový nepárny pomer [OR], 2,11; 95% CI [CI], 1.08-4.10) a vyššia miera LN metastáz (30,0% oproti 5,1%, p = 0,014 surovej OR, 2,73, 95% CI, 1,50 až 4,98), než tie s up-regulácia miRNA-135a expresie (tabuľka S1). Citlivosť a špecifickosť miRNA-135a expresné status pre predikciu LN metastáz bolo 75,0% a 72,5%, resp. Okrem toho, u pacientov s pokročilejšom štádiu (obrázok 1B) alebo LN metastázy (obrázok 1C), vykazovali významne nižšiu pomer nádor na normálne hladiny miRNA-135a expresie, než tie, ktoré sa štádiom IA alebo bez LN metastáz. Viacrozmernom logistické regresná analýza tiež ukázala, že miRNA-135a, down-regulácia sa nezávisle spojené s LN metastázy (upravené OR, 8,04, 95% CI, 1,08 až 59,81; p = 0,042; tabuľka 1). Súhrnne, tieto nálezy naznačujú, že down-regulácia miRNA-135a expresie môže byť spojená s progresiou rakoviny žalúdka, vrátane LN metastáz.

miRNA-135a potláča životaschopnosť buniek karcinómu žalúdka, EMT, migrácia a invázia

Aby sa ďalej skúmať vzťah medzi miRNA-135A a klinických výsledkov sme vykonali funkčné testy na životaschopnosť buniek, bunkový cyklus, EMT, migráciu a inváziu v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Nadmerná expresia miRNA-135A od miRNA-135A napodobňuje výrazne potlačená životaschopnosti buniek (obrázok 2A) a zvýšila subdiploid frakcie SNU668 bunky, bunkové línie, ktorá zriedka vyjadruje miRNA-135A (obrázok 2B), čo naznačuje zvýšenú apoptózu buniek karcinómu žalúdka. Avšak, potlačenie miRNA-135A inhibítory miRNA-135A indukovanej ani k zvýšeniu životaschopnosti buniek, ani k poklesu subdiploid frakcie v YCC2 buniek, bunková línia, ktorá exprimuje podstatnú miRNA-135A (obrázok 2A a 2B). Tiež sme skúmali súvislosť medzi miRNA-135a expresie a EMT do buniek karcinómu žalúdka, pretože miRNA-135a, down-regulácia bola nezávislým rizikovým faktorom pre LN metastáz u pacientov EGC (Tabuľka 1). Zvýšená expresia miRNA-135A bolo spojené s potlačením EMT a došlo k nárastu expresie E-cadherinu a potlačenie oboch N-cadherinu a Slug, že v SNU688 bunkách. Na rozdiel od toho inhibícia miRNA-135a expresie viedla k aktivácii EMT, vrátane potlačenia E-cadherinu expresie a up-regulácia ako na N-cadherinu a Slug expresiu v YCC2 bunkách (Obrázok 2C). Pri posudzovaní pre funkčné následky, nadmerná expresia miRNA-135A od miRNA-135A napodobňuje významne potlačil migrácie a invázie schopnosti SNU668 buniek karcinómu žalúdka (obrázok 2D). Naopak, blokáda miRNA-135A inhibítory miRNA-135A výrazne zvýšila migráciu a inváziu YCC2 buniek karcinómu žalúdka (Obrázok 2e). Celkovo naše výsledky naznačujú, že miRNA-135a je regulátor tumor potlačujúci pre žalúdočné proliferácie a metastázovaniu rakoviny.

ROCK1 je cieľový gén miRNA-135A v žalúdku rakoviny

Na objasnenie mechanizmov podkladových účinky miRNA-135A na klinické výsledky, hľadali sme predpokladané ciele pomocou databázy TargetScan 6.2. 718 konzervovaných ciele sme vybrali ciele s najvyšším skóre, ktorého down-regulácia by mohlo mať za následok zvýšenú proliferáciu nádorových buniek, migrácie a invázie. Zistili sme, že ROCK1 môže byť cieľový gén miRNA-135A, pretože inhibícia alebo potlačenie ROCK1 bola označená podporovať apoptózu a potlačiť migráciu, inváziu, a proliferáciu nádorových buniek, vrátane tých, rakoviny žalúdka [28] - [30]. TargetScan analýza ukázala, že 3 'UTR sekvencie ROCK1 má jeden možný väzobné miesto pre miRNA-135a (obrázok 3A). Ak chcete overiť, či ROCK1 je terčom miRNA-135A, bol vykonaný test luciferázy. Luciferázy 3 'UTR konštrukty opísané v časti Metódy boli kotransfekovány do buniek SNU688 s miRNA-135A napodobňuje a do YCC2 buniek s inhibítormi miRNA-135A. Tiež sme konštruované ROCK1 3'UTR Mut bodovú mutáciu C → G v možnom mieste záväzného (obrázok 3A). Relatívna aktivita luciferázy z ROCK1 3 'UTR bol WT v prítomnosti inhibítorov miRNA-135A (obrázok 3b) výrazne zvýšil. Naopak, táto aktivita bola významne znížená za prítomnosti miRNA-135A napodobňuje (obrázok 3C). V žalúdočnej rakovinové bunkové línie, miRNA-135a a ROCK1 vykazovali opačný expresný vzor. Western blot analýza ukázala, že expresia bola ROCK1 down-regulované v prítomnosti miRNA-135A napodobenín, a up-regulované v prítomnosti inhibítorov miRNA-135A (obrázok 3D a 3E). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že miRNA-135a potláča ROCK1 expresiu priamo zacielenie na jeho 3 'UTR.

Expresia ROCK1 je nepriamo úmerná k tomu miRNA-135A u pacientov s EGC

Analýza 59 pacientov s EGC ukázali, že hladiny expresie ROCK1 mala výrazne negatívne koreláciu s účinkami miRNA-135A (r = -0.697, p 0,001, obr 4A). Okrem toho, u pacientov s up-regulácia miRNA-135a expresie mali významne nižšie hladiny expresie proteínu ROCK1 než tí s down-reguláciou miRNA-135a (priemer tumoru k normálnemu pomeru, 0,81 vs. 1,55, p 0,001, obrázok 4b) .

ROCK1 je spojená s LN metastázy v EGC a je zapojený do žalúdka migráciu nádorových buniek a invázie potlačený miRNA-135a

Ak chcete ďalej vyhodnotiť spojitosť medzi ROCK1 prejavu a klinickými výsledkami v EGC, sme analyzovali vzory ROCK1 expresie vo vzťahu k stavu LN metastázy zahŕňala pacientov. U pacientov s metastázami LN signifikantne vyššia expresiu proteínu ROCK1 než tí bez metastáz LN (znamenať nádor k normálnemu pomeru, 1,86 vs. 0,93, p = 0,007, obr 5A). Okrem toho hladiny ROCK1 IHC farbenie boli podobné tým z ROCK1 expresie vo western blot analýze ( tj
, pacienti bez LN metastáz mal slabé IHC farbenie vzorca [Obrázok 5B], ale tie sa LN metastázy malo silne pozitívny IHC farbenie [5C]).

a konečne, aby vyšetrila, či sú potlačené migrácie a invázie schopnosti vyplývajúce zo miRNA-135A up-regulácia pozorovanou v žalúdku rakovinových bunkových línií boli výsledkom ROCK1 up-regulácia, sme vykonali migráciu a invázie testy za použitia žalúdočné rakovina bunkové línie transfekované siRNA špecifické ROCK1. ROCK1 siRNA potlačil migračnej a útočnej činnosti v SNU668 bunkách (Obrázok 5d). V YCC2 bunky ko-transfekovány s inhibítormi miRNA-135A a ROCK1 siRNA (Obr 5E), migrácia a invázia testy ukázali, že inhibícia ROCK1 o siRNA významne zmiernila zlepšujúce migračnej a invazívne účinky miRNA-135A down-regulácia inhibítory miRNA-135A (obrázok 5F).

Spoločne tieto výsledky naznačujú, že je spojená s ROCK1 LN metastáz u pacientov EGC, a to má za následok, že zo zvýšenej expresie ROCK1 v súvislosti s miRNA-135a down-reguláciu. Preto ROCK1 môžu byť zapojené do miRNA-135a-potlačenú žalúdka nádorových metastáz.

Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že miRNA-135a mal nádorové supresívnu role v rakoviny žalúdka. U pacientov s EGC, down-regulácia miRNA-135a bol nezávislý rizikový faktor pre LN metastáz. Do buniek karcinómu žalúdka, up-regulovaný miRNA-135a potlačená žalúdočné karcinogenéze tým, že potláča bunkovú proliferáciu, EMT, a metastáz. Ďalej sme tiež identifikovali nový cieľový gén miRNA-135A, ROCK1, ktorá bola spojená s LN metastáz u rakoviny žalúdka.

U pacientov s EGC, vyhodnotenie LN metastáz pred liečbou je dôležitým krokom pri stanovení z liečebných stratégií. Menej invazívne zákroky, ako je endoskopické resekcii [5] - [7] alebo sentinel LN navigačné chirurgii [9], malo by byť možné [10] v EGC pacientov bez LN metastáz. Tieto liečebné prístupy majú lepšiu kvalitu života pacientov vo vzťahu k neskorej komplikácie spojené s bežnými chirurgickými procedúr, vrátane dumping syndrómu, chudnutie a príznakov refluxu súvisiacich [31]. Preto, viac špecifické a citlivé biomarkery sú nutné predvídať stav LN metastáz u pacientov s EGC. V tejto štúdii, miRNA-135a, down-regulácia bol nezávislý faktor pre LN metastáz, a predikčná hodnota miRNA-135a expresie stavu bola pomerne vysoká, s citlivosťou 75% a špecifickosťou 73%. Aj keď sú potrebné ďalšie overovacej štúdie, tieto výsledky ukázali, že meranie hladiny miRNA-135A pred stanovením liečebného plánu pre pacientov EGC by mohli byť užitočným testom pre predikciu stavu LN.

Je zaujímavé, že bola hlásená miRNA-135a že je nádor supresívne a onkogénny. Nadmerná expresia miRNA-135A bola spojená s potlačenie nádorového bujnenia a rastu rakovinu obličiek [21] a so zvýšenou apoptózu a lepšie prežitie bez ochorenia v lymfómu [22]. Na rozdiel od toho miRNA-135a bol zapojený v kolorektálneho karcinómu progresie ochorenia [32], a na zvýšenú migráciou a inváziou [33] buniek prsníka. V tejto štúdii, miRNA-135a, bolo preukázané, že nádor supresívnu miRNA, čo je v súlade s výsledkom predchádzajúce štúdie [23]. Špeciálne, vyššia expresia miRNA-135A potlačil niekoľko krokov žalúdočné karcinogenézy, vrátane proliferácie, migrácie a invázie. Ďalej sme tiež zistili, že miRNA-135a môže potlačiť EMT, ktorý oznámil, že sú spojené s začatia viacstupňovom procese karcinogenézy a propagácie metastáz [34], [35]. Pred tejto štúdie, vzťah medzi miRNA-135A a EMT sa neskúmalo, aj keď predchádzajúce štúdie ukázali, že miRNA, ako miRNA-27 [19], je miRNA-200 rodiny [20], miRNA-7 [36] a miRNA-1228 [37] potlačiť EMT prostredníctvom svojich vlastných cieľových génov u karcinómu žalúdka. Dohromady miRNA-135a je nádor potláčajúcich miRNA u karcinómu žalúdka.

Predchádzajúce štúdie analyzuje 353 rakovina žalúdka u ľudí tkanív ukázala, že expresia vzory miRNA sú rôznorodé a že niektoré miRNA boli spojené s progresiou a prognózou u žalúdočných rakoviny [14]. V štúdii, miRNA-135a bol klasifikovaný ako onkogénne miRNA v karcinómu žalúdka na základe výsledkov DNA microarray analýzy. Avšak, v nedávnej [23] a našej štúdii miRNA-135a sa správal ako nádorový supresor napriek vysokej miere u pacientov s miRNA-135a up-regulácia. Hoci mnoho pacientov (66%) malo up-regulácia miRNA-135A podobným výsledkom predchádzajúcej štúdie [14], u týchto pacientov významne menej pokročilom štádiu a nižšiu mieru LN metastáz. Okrem toho, ďalšie in vitro
štúdie tiež ukázali, že vyššia expresie miRNA-135A bolo spojené s potlačením žalúdočnej rakoviny. Tieto výsledky naznačujú, že expresia vzory miRNA sa môže líšiť od klinické výsledky, a preto boli potvrdené presné role konkrétnych miRNA sú potrebné ďalšie štúdie.

ROCK1 je členom Rho-spojené serín /treonín kináz, ktorá funguje ako centrálny regulátor aktinového cytoskeletu organizácie a dynamiku [23], [38]. ROCK1 má rôznorodú škálu funkcií vo vzniku nádorov, vrátane migrácie, invázie a metastáz [28]. ROCK1 je cieľom niekoľkých miRNA v rôznych druhov rakoviny, vrátane miRNA-584 v karcinómom obličiek [39], miRNA-335 u neuroblastómu [40], a miRNA-146a v karcinómu prostaty [41]. V karcinómu žalúdka, ROCK1 bol pozitívne koreluje s LN metastázy a TNM fázy [42], a je zapojený do miRNA-148a-indukovaného potlačenia žalúdočné migrácie a invázie [30] nádorových buniek. Ďalej, ROCK1 inhibítor podporoval apoptózy u buniek karcinómu žalúdka [29]. V tejto štúdii sme zistili, že je ROCK1 terčom miRNA-135a v karcinómu žalúdka a jeho expresie je pozitívne spojená s LN metastáz u pacientov s EGC. In vitro
experimenty tiež ukázali, že ROCK1 je zapojený do žalúdka nádorových buniek motility a invázie. Tieto výsledky naznačujú, že ROCK1 môže byť nový terapeutický cieľ so schopnosťou inhibovať žalúdočné nádorových metastáz.

Na záver, sme identifikovali miRNA-135A ako nový prognostický biomarker LN metastáz u pacientov s EGC a ukázal, že miRNA-135a potlačená žalúdočné karcinogenéze ( tj
, množenia, EMT a metastázy v žalúdočných rakovinových bunkových línií) zacielením ROCK1. Hoci tieto nálezy vyžadujú overovanie na iných nezávislých skupín pacientov, ktoré naznačujú, že miRNA-135a a jeho cieľový gén ROCK1 môže byť nový biomarker a terapeutickým cieľom pre rakovinou žalúdka s LN metastáz.

podporné informácie
tabuľke S1 ,
patologickým charakteristiky pacientov s včasnou rakovinou žalúdka podľa miRNA-135a stav výraz
doi :. 10,1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

• Ploche ONE: Asociácie medzi polymorfizmy v géne XRCC1 a liečbe výsledkoch pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka: systematického prehľadu a metaanalýzy
• Ploche ONE: Zacielenie Cadherin-17 inaktivuje Ras /raf /MEK /ERK signalizáciu a inhibuje proliferácie buniek v žalúdku Cancer