Ploche ONE: Zacielenie Cadherin-17 inaktivuje Ras /raf /MEK /ERK signalizáciu a inhibuje proliferácie buniek v žalúdku Cancer

abstraktné

Cadherin-17 (CDH17), jeden člen 7D-cadherinu superrodiny, bol nadmerne exprimované žalúdočné rakoviny (GC) a bola spojená so zlou prežitie, recidívy, metastázy a pokročilom štádiu nádoru. Doteraz bunkové funkcie a signalizačné mechanizmus CDH17 v GC zostáva nejasný. V tejto štúdii sme ukázali, že viac ako 66% GC bunkových línií (20/30) boli CDH17 pozitívne. Mikroskopické sústavy tkanív (TMA), test ukázal, že 73,6% čínskej GC tkaniva (159/216) boli CDH17 pozitívne, zatiaľ čo 37% príslušnej priľahlej normálne tkanivá boli CDH17 pozitívne. Vyradenie CDH17 inhibuje tvorbu bunkovej proliferácie, migrácie, adhézie a kolónií, a tiež indukuje zástavu bunkového cyklu a apoptózu v ľudskej AGS GC buniek. Na druhej strane, zvýšená expresia CDH17 uľahčil MGC-803 GC rast nádorov u nahých myší. Protilátka poľa a Western blot testu ukázali, že vyraďujúce CDH17 v AGS bunkách down-regulované integrín beta radu bielkovín, ďalej inaktivovať Ras /Raf /MEK /ERK dráhy a viedol k p53 a akumuláciu p21, čo viedlo k inhibíciu proliferácie, bunkového cyklu zatknúť a indukcie apoptózy. Súhrnne, naše dáta najprv preukázať schopnosť CDH17 regulovať aktivitu Ras /Raf /MEK /ERK dráhy na proliferáciu buniek v GC, a naznačujú, že CDH17 môže slúžiť ako atraktívny terapeutický cieľ pre ďalší výskum.

citácie: Lin Z, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Y, Z Zhou et al. (2014) Targeting Cadherin-17 inaktivuje Ras /Raf /MEK /ERK signalizáciu a inhibuje bunkovej proliferácie v rakoviny žalúdka. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10,1371 /journal.pone.0085296

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francúzsko

prijatá: 10. júna 2013; Prijaté: 26.novembra 2013; Uverejnené: 20.januára 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov: Všetci autori sú zamestnanci alebo skorší zamestnanci Roche R &D Center (Čína), s výnimkou YanFen Fang, ktorá je zamestnancom Východočínske Normal University, Shanghai, Čína .. To však nič nemení priľnavosť jednotlivých autorov do všetkých politík ploche jeden na zdieľanie dát a materiálov.

Úvod

Karcinóm žalúdka (GC) je hodnotená ako druhou najčastejšou príčinou globálneho úmrtnosti na rakovinu a štvrtou najčastejšou rakovinou na svete [1], [2]. Stredná doba prežitia pacientov s GC je 7 ~ 10 mesiacov. Väčšina pacientov s GC súčasnej dobe s ochorením neskorej fáze s celkovým 5-ročné prežitie približne o 20% a miere objektívnej odpovede konvenčné chemoterapeutickej rozsahu režimami chemoterapie môže byť zlepšená z 20% na 40% [1], [3]. V súčasnej dobe, liečba s cisplatinou je ešte široko používaný v klinickej praxi pre pokročilých a metastatické GC. Okrem toho u HER2-neu expresiou žalúdočné adenokarcinómov trastuzumab (Herceptin) v kombinácii s chemoterapiou predlžuje stredná doba celkového prežívania 11,1 mesiacov (chemoterapia sám) na 13,8 mesiacov [4]. Vzhľadom k vysokej úmrtnosti GC, stále existuje obrovská nenaplnená medicínska potreba nájsť citlivý a spoľahlivý biomarker pre včasnej diagnostiky GC a silné terapeutické ciele pre liečbu GC.

CDH17, jeden člen 7D-cadherinu nadčeľade, predstavuje fetálne pečeň a gastrointestinálny trakt počas embryogenézy, a tým je tiež menovaný ako pečeň a črevnú cadherinu (LI) cadherinu. CDH17 je nadmerne exprimovaný u hepatocelulárneho karcinómu [5], [6], rakoviny žalúdka [7], duktálny karcinóm pankreasu [8] a kolorektálny karcinóm [9] - [11]. Ako už bolo popísané, CDH17 bol hlavne prítomný na bunkovej membráne, a chýba v normálnej žalúdočnej tkaniva a pozitivita bola takmer 78,4% [12]. Hladina expresie CDH17 bola charakteristická pre pokročilého karcinómu žalúdka, ktorá bola spojená so zlou prognózou [13]; a to bolo tiež významne spojená s metastázy lymfatických uzlín u karcinómu žalúdka [14]. Knockdown CDH17 s lentivirus sprostredkovanú miRNA inhibuje proliferáciu, priľnavosť, nádorový rast a metastázovanie BGC823 ľudských buniek karcinómu žalúdka a to ako in vitro, tak in vivo [15] - [17]. CDH17 bol navrhnutý ako onkogén a užitočný marker pre diagnostiku rakoviny žalúdka [18]. Bolo preukázané, že CDH17 sprostredkované onkogénne signalizácie v HCC súvisí s Wnt signalizácie [5]. Nedávno bolo oznámené, že CDH17 indukované tumorigenezi a lymfatický metastáz v GC prostredníctvom aktivácie NFkB signálnej dráhy [19]. CDH17 regulovanú α2β1 integrín signalizácia vyvolať špecifickú fokálnou adhézne kinázy a aktiváciu Ras, čo viedlo k zvýšeniu adhézie buniek a proliferácie nádorových buniek hrubého čreva [11]. Avšak, hlavné role a signalizačné mechanizmus CDH17 v GC zostáva nejasný. V tejto štúdii, pre overenie CDH17 ako potenciálny terapeutický cieľ pre GC a vyšetrovať signalizačné mechanizmus CDH17 v GC, vyznačujúci sa tým sme expresiu CDH17 v ľudských bunkových líniách GC a GC čínskych tkanív, skontrolovať vplyv CDH17 príklepu alebo nadmerne výraz tumorigénny a metastatického účinku GC bunkových línií, a preskúmal možný signál kaskády súvisiace s CDH17. Pozorovali sme vysokú CDH17 expresiu v ľudských bunkových líniách GC a GC čínskych tkanív, a jasnú inhibíciu bunkovej proliferácie, migrácie, adhézie, vznik kolónií, indukcia apoptózy a bunkového cyklu po umlčanie CDH17 v ľudských bunkových líniách GC. Okrem toho, naše výsledky za prvé ukazujú schopnosť CDH17 regulovať aktivitu integrínu-Ras /Raf /MEK /ERK dráhy na proliferáciu buniek v GC, a naznačujú, že CDH17 môže slúžiť ako atraktívny terapeutický cieľ pre ďalší výskum.

materiály a metódy

Ethics vyhlásenie

použitie a starostlivosť o pokusných zvierat bolo schválené používanie a ošetrovanie výboru Institutional zvierat (IACUC), Roche R &D Center (Čína). V GC tkaniva bloky ľudských so zodpovedajúcimi susednými tkanivových blokov boli získané od Šanghaja Biochip Company, CRO servisná spoločnosť. Všetky ľudské tkanivá boli zhromaždené s písomným súhlasom od pacientov zdroja. Všetky bunkové línie boli zakúpené od ATCC, USA, japonskej Collection of Research Bioresources a Šanghajské Institutes of biochémie a bunkovej biológie, čínskej akadémie vied.

bunkových línií a činidlá

Všetky bunkové línie sa z amerického Typické Cell Collection (ATCC), japončina Collection of Research Bioresources a Šanghajské Institutes of biochémie a bunkovej biológie, čínskej akadémie vied boli dodržiavané v príslušnom rastovom médiu, ktoré boli doporučené dodávateľov. PMD-18T-CDH17 plazmid bol od Sino Biological Inc. tetracyklín (Tet) bol od firmy Sigma, Cell Counting Kit-8 bol od Dojindo molekulárnej Tech. Ľudská plazma fibronektín bol od R &D systems. Transwell komory bol od Corning (6,5 mm priemer, 8-um veľkosti pórov). CDH17 oligonukleotid siRNA bola z Genepharma Čo so sekvenciou 5'AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 '. Zmizni kontrolné RNA (Allstar®) bol od QIAGEN.

Tissue micro array imunohistochémia

Dvesto šestnásť parafínové vložené bloky žalúdočné rakovina tkaniva spolu so zodpovedajúcimi susedné tkaniva bloky (priľahlé tkanivá boli odoberané vzorky najmenej 5 cm od primárnych nádorov) boli zhromaždené a uložené Shanghai Biochip Company. Tkanivá boli rozrezané a náhodne pripravená na 3 mikro snímok polí. Veky pacientov bolo 32-84 rokov (priemerný vek 65) s inscenáciou od 1A-4 v súlade s americkou Spoločný výbor rakoviny (AJCC) pokyny Ver.7. Všetky prípady boli diagnostikované dva vysoké patológov skúsenými špecialitou v žalúdku patológie rakoviny. Sklíčka sa vyliahli v blokujúcom séra po dobu 20 minút, potom sa vzťahuje 100 ul anti-humánne-Cadherin 17 afinitnej čistené monoklonálne Ab, myší IgG (R &D MAB1032 1: 2000 v TBS /T) pri 4 ° C cez noc. Sklíčka bola pokrytá 100 l Dako Envision + /HRP, Králik /Mouse potom, čo bol dôkladne premytý TBS. Sto mikrolitrov substrátu chromogénový roztoku (DAB) boli aplikované na sklíčka a inkubované pri izbovej teplote po dobu 10 minút. Zafarbené rezy boli skúmané mikroskopicky dvoma imunohistochemické odborníkmi. Normálny myšou IgG bol použitý ako negatívna kontrola. Farbenie bolo považované za negatívne, ak nie je pozitívny bunková membrána farbenie bolo možné identifikovať a pozitívny, ak viac ako 10% nádorových buniek ukázali, buniek s membránou pozitívne na imunologické.

TR stabilné bunkové línie

pLenti6 /TR vektora (Invitrogen, kat. č V48020) a pLenti3.3 /TR vektora (Invitrogen, kat. č A11114) boli použité na vytvorenie stabilných bunkových línií, ktoré konštitutívne exprimujú vysoké hladiny Tet represor. Tieto expresné plazmidy obsahujú časti, ktoré slúžia na balenie konštruktu do viriónov a blasticidin alebo geneticinu odporu marker pre selekciu stabilne transdukovaných bunkových línií. Stručne povedané, 293FT obalové bunky (Invitrogen, kat. Č R700-07) boli transfekovány s pLenti6 /TR alebo pLenti3 /TR a ViraPower ^{TM Balenie Mix (Invitrogen, kat. Č K4975-00) vyrábať lentivirálním častice. Lentivirus boli použité pre transdukciu buniek alebo AGS MGC-803 a blasticidin (8 ug /ml, Invitrogen, kat. Č R210-01) alebo geneticin (200 ug /ml, Invitrogen, kat. Č 10131-027) bol používa na výber pre stabilnú TR expresiou AGS buniek pomenované TR-AGS stabilné bunkové línie alebo TR-exprimujúce MGC-803 bunky s názvom TR-MGC-803 stabilný bunkové línie. Tieto TR vyjadrenie bunkové línie boli použité ako hostitelia pre expresiu konštruktov, ktoré uľahčujú Tet-regulovanú expresiu CDH17 zhrnieme (short vlásenka RNA) alebo CDH17 génu, resp.}

Stabilný AGS bunky s Tet-regulovaná expresia zhrnie z CDH17 génu

Four Mirna oligonukleotidy zamerané CDH17 gén ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) boli navrhnuté s použitím systému internetovej aplikácie (Invitrogen). Tieto dvojvláknovej DNA boli ligovány do pcDNA6.2 ™ expresné systém -GW /EmGFP-MIR (Invitrogen, kat. Č K4936-00), ktoré potom boli prechodne transfekovány do AGS buniek štandardnými postupmi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, kat č. 11668-027). V súlade s real-time PCR analýzy sekvencie 90-2 (Forward primer: 5'-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 ', reverzné primer: 5'-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3') z miRNA ukázal najvyššiu účinnosť a bol vybraný, aby na formulár BP rekombinácie získať pentru-Mirna. Tento záznam vektor bol potom použitý v LR rekombinácie s pLenti4 /TO /V5 (Invitrogen, kat. Č K4920-00) s cieľom získať pLenti4 /k /V5-miRNA lentivirus s použitím technológie Gateway® (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Lentivirus boli použité pre transdukciu TR-AGS stabilný buniek a 200 ug /ml Zeocinu (Invitrogen, kat. Č R250-05) bol použitý pre výber pre stabilnú Tet-regulované CDH17 zhrnieme expresných buniek pomenované TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunkové riadok.

Stabilné MGC-803 bunky s Tet regulované zvýšenej expresii génu CDH17

Stručne povedané, CDH17 sekvencia bola amplifikovaná z PMD-18T-CDH17 plazmidu (Sino Biological Inc.) a subklonována do IRES -EGFP vektor pre získanie CDH17-IRES-EGFP s použitím primerov: primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 '; Reverzný primer: 5'-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 '). Tento konštrukt bol použitý na vykonanie BP rekombinácie získať pentru-CDH17-IRES-EGFP. Potom vstup vektor a pLenti6.3 /TO /V5 (č V370-06 Invitrogen, kat.) Vektor boli použité v LR rekombinácie získať pLenti6.3 /k /V5-CDH17-IRES-EGFP. Potom lentivirus boli vyrobené pre transdukciu TR-MGC-803 stabilný bunky a 4 ng /ml blasticidin sa používa na výber pre stabilnú Tet regulovaných CDH17 génovej expresie buniek pomenované TR-MGC-803-CDH17_Over stabilné bunkové línie.

testu proliferácie buniek

siRNA testoch prechodnej transfekciu boli bunky schovať na 10 cm misky s hustotou 5 x 10 ^{6 buniek /misku a transfekovány 20 nM siCDH17 alebo šifrovacím siRNA. Po 48 hodinách inkubácie boli bunky oddelené a prevedené do 96-jamkové doštičky v hustote 3000 buniek /jamku, inkubujú ďalších 72 hodín. Životaschopnosť buniek bola testovaná pomocou CCK-8 kit (Donjindo, Japonsko). Pre TR-indukovatelný AGS-CDH17_KD stabilných buniek, bunky boli schovať na misky 60 mm x 15 mm a spracuje sa s alebo bez Tet (0, 2,5 a 5,0 ug /ml) po rôznu dobu. Bunky boli zozbierané po 2, 3, 4, 5 a 6 dní a počet buniek bol počítaný podľa ScepterTM Handheld Automated Cell Counter (Millipore). Pre záchranu testu proliferácie, TR-indukovatelné AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli schovať na misky 60 mm x 15 mm a kultivované po dobu 10 dní bez alebo s 5,0 ug /ml Tet. Pre záchrannej skupiny, kultivačné médium, obsahujúce Tet bolo nahradené čerstvým médiom v deň 4, a bunky boli naďalej kultivované na deň 10. bunky v každej skupine boli zozbierané v deň 2, 4, 6, 8 a 10 pre počítanie počtu buniek a Western blot analýzy.}

migrácie buniek test

TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli schovať na 10 cm misky a spracuje s alebo bez Tet (5 ug /ml). Po 120 hodinách kultivácie boli bunky pozbierané a spočítané. Pridá sa 0,1 ml bunkovej suspenzie (1, 2, 3 x 10 ^{4 buniek /ml) na hornej priestoru komory. 0,6 ml 10% FBS médium sa pridalo do spodného priestoru ako chemo atraktant. Po 24 hodinách inkubácie pri 37 ° C, bunky boli fixované 90% etanolom pri teplote 4 ° C počas 30 minút a potom farbené 0,1% kryštálovou violeťou po dobu 15 min. Non-migrujúci bunky boli odstránené z hornej plochy transwell membrány s vatovým tampónom. Zafarbený Bunky boli následne vyfotografoval a počítané pod svetelným mikroskopom.}

Cell Adhesion test

TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli schovať na 10 cm misky a spracuje s alebo bez Tet (5 ug /ml). Pre-povlak 96-jamkové doštičky bolo vykonané inkubáciou jamiek s 25 ug /ml fibronektínu pri teplote 4 ° C cez noc. Na zníženie nešpecifickej väzby, 1% hovädzí sérový albumín (BSA) bol pridaný do každej jamky a inkubovať počas 60 minút pri 37 ° C, BSA sa premyje dvakrát sterilným PBS. 120 hodín po smiešne nízke CDH17 s Tet, bunky boli zhromaždené a schovať do vopred potiahnuté 96-jamkové doštičky s 4 x 10 ^{4 buniek /jamka. 2 h neskôr, neadherentní bunky boli odstránené premytím sterilné PBS dvakrát. Adherentní bunky boli testované na CCK-8 súpravy.}

Colony testu tvorenie

Po prvé, 6-jamkové doštičky boli pripravené so spodnou vrstvou (agar 0,6% gél). Potom, TR-AGS-CDH17_KD bunky alebo siCDH17 transfekované bunky (ako proliferácia test) boli suspendované v kompletnom médiu obsahujúcom 0,3%, 0,4% agar Noble (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a vrúbľovať do pripraveného 6-jamkové doštičky a kultivované počas 7 a 14 dní. Bunky boli zafarbené tiazolylová modrá tetrazoliumbromid (MTT) počas 2 hodín. Celkový počet bunkových kolónií bol počítaný.

bunkového cyklu analýza

TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli nasadené na šiestich jamkové doske pri 1,0 × 10 ^{5 buniek /jamka a spracuje s 5 ug /ml Tet. 120 hodín neskôr boli bunky izolované trypsínom a fixované etanolom pri teplote 4 ° C počas 3 hodín. Potom sa bunky odstredia pri 1500 g počas 5 minút a premyté PBS. Resuspendované buniek v RNase /PBS roztoku (20 ug /ml), inkubované pri 37 ° C počas 15 min, potom sa pridá PI /PBS roztoky (20 ug /ml) a inkubujú sa pri teplote miestnosti po dobu 30 minút, kontrolované zafarbených buniek BD FACS Calibur a analyzovali dáta s BD CellQuest Pro softvér.}

apoptóza analýza

TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli nasadené na šiestich jamkové doske pri 1,0 × 10 ^{5 článkov /jamka a spracuje sa s 5 ug /ml Tet. 120 hodín neskôr boli bunky izolované trypsínom a premyje sa pre-chladeným PBS raz. Bunky boli resuspendované v 500 ul 1 x väzbovým pufrom a 5 ul PI a bolo pridané 5 ul AnnexinV (BD). Po inkubácii v tmavej (izbovej teplote) po dobu 10 min, sa zafarbené bunky boli kontrolované pomocou BD FACS Calibur. Získané dáta boli analyzované pomocou BD CellQuest Pro.}

Western blot analýza

Bunky boli Lyžovanie RIPA pufra [150 mM NaCl, 1% NP40, 0,25% deoxycholát a 10 mM HEPES (pH 7,4)] obsahujúce kokteilu inhibítora proteázy (Roche Molecular Biochemicals). Koncentrácia proteínov bola kvantifikovaná pomocou metódy kyselina bicinchoninic (BCA) (Pierce). Tridsať mikrogramov proteínu na vzorku sa varí v nanášacím pufri a podrobia elektroforéze na 8-12% gradientu SDS polyakrylamidové gély (Invitrogen) a prenesené na nitrocelulózové membrány. Membrány boli testované protilátkami (CDH17, integrín D1, integrín β4, integrín β5, p-p53, p53, p21 boli od R &D, Raf, p-MEK, MEK, p-EKR, EKR boli z bunkovej signalizácie, a k-Ras bola od Santa Cruz) a nasleduje peroxidázou konjugované imunoglobulínu. Western bloty boli vizualizované pomocou rozšírenej chemiluminiscencie (ECL) súpravy (GE Healthcare)

protilátok sady testu

tri typy polí protilátok boli získané od firmy R &. D Systems, Inc. pre protilátku poľa test. Humánne fosfo-kinázy Array Kit (kat. Č ARY003) obsahuje 43 rôznych kináz. Ľudský rozpustný receptor Array Kit nehematopoetického Panel (kat. Č ARY012) obsahuje 119 rôznych rozpustné receptory. Ľudský Apoptóza Array Kit (kat. Č ARY009) obsahuje 35 rôznych apoptózu protilátky. Viac vyčerpávajúce informácie o týchto poliach možno nájsť v odkaze o R &D Systems: http://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD stabilné bunky boli zozbierané po 120 hodinách ošetrených s alebo bez Tet (5 ug /ml) a proteíny boli lyžovanie lyzačním pufri s inhibítormi proteázy, bunkové extrakty boli rozriedené a inkubuje s tromi typmi polí protilátok cez noc , Čipy boli premyté za účelom odstránenia nenaviazaných proteínov nasleduje inkubácie s koktailom biotinylovaných detekčných protilátok. Všetky procedúry sú podľa pokynov súpravy. Škvrny boli analyzované pomocou denzitometria, a expresia proteínu sa normalizované vzhľadom na pozitívnu kontrolu, ktorá bola znázorneného na každej membrány.

Meranie aktivity in vivo

TR-MGC803-CDH17_Over bunky (1 x 10 ^{7 buniek v 0,2 ml PBS) sa vstrekne do ľavého podpazušia 5 ~ 6 týždňov Balb /c nu /nu athymických myší samice (Sino-britskej SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Čína). Objem nádoru (mm 3) sa meria posuvným meradlom a vypočíta ako (W 2 x L) /2, kde W je šírka a L je dĺžka. Keď objem nádoru dosiahol -100 mm 3, boli myši randomizované do dvoch skupín (9 myší v každej skupine). Tetracylcine indukcia (Invitrogen, 0,2 mg /ml, dodávané vo sterilizované pitnej vode obsahujúcej 2,5% sacharózy) sa inicializuje na zoskupenie deň. Sterilizovaná pitná voda s obsahom 2,5% sacharózy bola dodaná do myší non-indukovanej skupiny. Nádorové objemy boli zaznamenávané za 3 dni, kým zvieratá usmrtia. Po 35 dňoch indukcii, nádorové tkanivá xenografe boli zhromaždené a podrobené Western blot analýzy pre relatívnu expresiu proteínu.}

Štatistická analýza

Dáta bola vyjadrená ako priemer ± smerodajná odchýlka a štatisticky podrobené Studentov nepárového t-testu. Úroveň P menšia ako 0,05 bola považovaná za významnú

Výsledky

Expression profil CDH17 v karcinómu žalúdka

úrovňou expresie proteínov v CDH17 30 bunkových línií bol zaradený do kategórie. do 4 skupín na základe údajov z optickej analýzy hustoty proti beta-aktínu. AGS bunková línia bola použitá ako vnútorný štandard pre zamedzenie rozdiel medzi gély. Viac ako 66% z GC bunkových línií (20/30) boli CDH17 pozitívny (1A).

Expresia a lokalizácia CDH17 v primárnych bunkových kultúrach, parafínový bola detekovaná imunohistochemicky na mikroskopických sústav tkanív. V porovnaní s kontrolnými preparátov farbených normálne myšou IgG, CDH17 mAb farbenie bolo preukázané jasné bunkové membrány lokalizáciu (obrázok 1B). Medzi 216 prípadov, u ktorých bol potvrdený správou patológie diagnostiky, 73,6% rakovinové tkanivá (159/216) kryl kladný CDH17 škvrnu skórovanie od + do +++, zatiaľ čo 37% pozitívne CDH17 škvrna v príslušných susedných normálnych tkanivách (tabuľka 1). V CDH17 pozitívnych prípadov, úroveň expresie CDH17 má pozitívnu koreláciu s lymfatických uzlín. Avšak úroveň expresie je spätne spojené s žalúdočnej stenou inváziou nádoru, vzdialených metastáz, a tumor TNM fáz. Naše pozorovania je v súlade s predchádzajúcimi klinickými správ [20] - [22]. Medzi CDH17 pozitívnych prípadov, rakovinové tkanivá vystavil silnejšie zafarbenie CDH17 (32,1% ako bodovacia + 25,2% za skórovanie ++ a 42,8% za skórovanie +++) než susediacich normálnych tkanív (62,5% ako bodovanie + 21,3% as bodovania ++ a 16,3%, ako vyhodnocovanie +++). Aj keď žiadny významný vzťah bol zaznamenaný medzi škvŕn bodovania a klinickej fáze. Vezmeme to všetko svedčí dohromady, CDH17 môže byť diagnostický marker skorých štádií rakoviny žalúdka v čínskej populácie.

RNAi sprostredkovanú zraziť CDH17 na GC bunkových línií ukázali potlačenie bunkovej proliferácii a tvorbe kolónií in vitro

na základe výsledkov CDH17 expresného profilu v paneli GC bunkových línií (obr 1A), AGS (vyššia CDH17), BGC-823 (nižšia CDH17) a HGC-27 Based (žiadna CDH17) bunkové línie boli vybrané pre ďalšie in vitro bunkovej hodnotenie funkčné s RNAi sprostredkovanú CDH17 umlčania. Westernový prenos ukázal, že AGS bunky mali vysokú úroveň CDH17 bielkovín a expresie CDH17 bol zrazený k zemi takmer úplne podľa siCDH17. BGC823 bunky mali nízku úroveň CDH17 bielkovín a HGC-27 nemal žiadny CDH17 proteín (obrázok 2A). V porovnaní s kontrolnými bunkami zhon, CDH17 zrážanie malo malý účinok na proliferačnú schopnosť BGC823 a HGC27 bunky, zatiaľ čo mala dramatický vplyv na AGS (o 60%, pri 72 hodinách, Obrázok 2B). Mäkký agar test ukázal, že schopnosť tvoriť kolónie bola inhibovaná v AGS bunkách, ak CDH17 bol zraziť (o 66%, 14 d), ale v BGC823 buniek a HGC27 buniek, CDH17 zrážanie mal malý vplyv na schopnosť tvorby kolónií (obrázok 2C). Nebol zrejmý rozdiel medzi BGC823 buniek (nízka úroveň) a CDH17 HGC-27cells (non-CDH17) na inhibíciu proliferácie a tvorba kolónií vyvolané siRNA CDH17 príklepu.

Stabilné bunkové línie nesúce TR inducibilní vyraďujúce CDH17 v AGS buniek a nadmerná expresia CDH17 v MGC-803 buniek

cieľová sekvencia v exon13 (90-2) poskytla výšky 90% zníženie hladiny mRNA (obrázok 3A). Potom sme použili pLenti4 /k /V5-miRNA-90-2 CDH17 lentivirus pre transdukciu TR-AGS stabilné bunky a dostal stabilné Tet-regulovanú expresiu zhrnieme génových buniek CDH17 (TR-AGS-CDH17_KD), ktorá bola hladina CDH17 proteín zníženú asi 90% po indukovanej s 5 ug /ml Tet (obrázok 3B). PLenti6.3 /TO /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus bol použitý pre transdukciu TR-MGC-803 bunky a stabilné vybrané blasticidin získať stabilný Tet-regulovanú expresiu génov bunky CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) , Zvýšená expresia CDH17 v tejto stabilné bunky bola potvrdená na úrovni proteínu metódou Western blot (obrázok 4A).

Vyradenie CDH17 indukované inhibíciou bunkovej proliferácie, migrácie, adhézie, tvorby kolónií a indukciu zastavenia bunkového cyklu a apoptóza

TR-AGS bunky (kontrolné bunky) a TR-AGS-CDH17_KD bunky boli použité na vyhodnotenie potenciálu bunkovej funkčné účinky zhrnieme sprostredkované CDH17 knockdown v AGS bunkách. TR-AGS-CDH17_KD bunky ošetrené s 5 ug /ml Tet došlo k zníženiu proliferácie buniek (o 75,8% po 5 dňoch), bunková migrácia schopnosť (o 68,1% po 16 hodinách), bunkové adhézne schopnosť (o 46,8%, po 30 minútach ), a kolónie schopnosť (o 92,7% na 7 dní tvárnenie) v porovnaní s voľným Tet (obrázok 3C). V proliferácia záchrannej štúdii CDH17 porazený v TR-AGS-CDH17_KD buniek indukovaných Tet môžu byť zachránené odstránením Tet. Po odstránení Tet v deň 4, re-expresia CDH17 bol pozorovaný v deň 8 a 10 kultúry v CDH17 zhrnie knockdown AGS buniek. Re expresia CDH17 mohol zachrániť proliferačnú schopnosť TR-AGS-CDH17_KD bunkách (obrázok 3D). V porovnaní s Tet voľne TR-AGS-CDH17_KD buniek, Tet na bunky vykazovali podstatne vyššie percento buniek v G0 /G1 a G2 /M fáze a výrazne zosnulého percento buniek v S-fáze (obrázok 3e). Do tej doby, tiež pozorované, že sa počet apoptotických buniek (o 52,2% na 5 dní) bola zvýšená o down-regulácii CDH17 v TR-AGS-CDH17_KD bunkách (Obrázok 3F). Žiadny významný rozdiel bol zistený v TR-AGS stabilné bunkové línie s alebo bez Tet inkubácie.

Nadmerná expresia CDH17 podporoval rast nádorových xenoimplantátů u nahých myší

TR-MGC-803-CDH17_Over buniek boli injikované podkožne do bokov Balb /c nahých myší za vzniku pevného tumoru. Expresia CDH17 bola pod kontrolou Tet v pitnej vode. Výsledky ukázali, že po 35 dňoch indukcii, Tet-indukovanej skupiny (objem nádoru = 1849,08 ± 423,46 m3) vykazoval 2,27-násobne vyššia miera rastu pokroku oproti Tet bez skupiny (objem nádoru = 814.04 ± 234,69 m3) (p menšie ako 0,05) ( obrázok 4B), a indukované CDH17 expresie v nádorovom tkanive môže byť analyzovaný metódou Western blot (obrázok 4C). To je uvedené, že CDH17 hrá dôležitú úlohu v karcinogenéze karcinómu žalúdka. Tiež sme použili bunky TR-AGS-CDH17_KD sledovať, či umlčanie CDK17 môže ovplyvniť tumorigeničnosti u nahých myší. Bohužiaľ, nádor sa miera tejto bunkovej línie bola veľmi nízka a nie je spoľahlivé výsledky in vivo sa pozorovala s bunkovou líniou TR-AGS-CDH17_KD.

Stanovenie súvisiace množstvo bielkoviny po porazený CDH17 protilátkou testom polí

v súlade s tumorigénny účinkami (inhibícia proliferácie buniek, tvorbu kolónií, a rast tumoru in vivo) a metastatických účinky (inhibícia migrácie buniek a adhézie) zo CDH17 príklepu, zvolíme tri protilátok poľa (od R &D systems ) testovať relatívnej zmeny bielkovín a dúfať, že nájdeme silný CDH17 regulované príbuzných proteínov. V apoptózy poľa, fosfo-p53 (S15, S46 a S392) a p21 /CIP1 /CDNK1A expresie zvýšená o dva krát po 5 ug /ml liečenie Tet počas 5 dní v porovnaní s neošetrenými bunkami (Obrázok 5A (a) a 5B). V poli fosfo-kináza, fosfo-p53 (S15, S46 a S392) výraz takisto zvyšuje po ošetrení Tet a, súčasne, expresie fosfo-ERK1 /2 (T202 /Y204) sa znížil (obrázok 5A (b) a 5B). V poli rozpustného receptora, Vyradenie CDH17 v AGS bunkách môže významne znížiť expresiu integrínu D1, β4, β5, pričom nemal vplyv na expresiu EGFR (obr 5A (c) a 5b). Zmena pomery zúčastnených proteínov medzi Tet-on a Tet bez AGS bunky boli zhrnuté na obrázku 5B.

Vyradenie CDH17 v AGS downregulated beta-integríny a Ras /Raf /MEK /ERK signálnej dráhy

proteínové zmení z testu poľa protilátky bola potvrdená Western blot analýzou. Výsledky ukázali významné zníženie integrínu β1, β4, β5 a fosfo-ERK v CDH17 porazený AGS bunky, ale žiadne významné zmeny v celkovej EKR (obrázok 5C). Potom sme vyhodnotili zapojenie ďalších komponentov signálne dráhy Ras /Raf /MEK /EQF. Vyradenie CDH17 za následok down-reguláciu RAF, fosfo-MEK a fosfo-ERK proteíny (obr 5c). Z TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo štúdii sme pozorovali, nadmerná expresia CDH17 posilnila integrinové D1, β4, β5 výraz a EQF aktiváciu (obrázok 4C) a je v súlade s vyššie uvedeným zisteniam. Ak chcete zistiť, či efekt CDH17 na integrínov alebo Ras proteínu je priama interakcia alebo nie, ko-Imunoprecipitácia CDH17 s integrínu D1, integrín β4, integrín β5, integrín a2, a Ras bola vykonaná v žalúdočných rakovinových buniek AGS, resp. Mimo očakávania, na rozdiel od výsledku BARTOLOME v [11], neexistuje žiadny priamy vzťah medzi CDH17 a jedného z týchto integrínov alebo Ras proteínu (dáta nie sú uvedené).

Diskusia

Je veľkou výzvou, aby lekárom a základných vedcov na určenie molekulárnych markerov spojených s progresiou a prognózou rakoviny súvisiace. V pečeni a karcinómov žalúdka, má sa za to, že vysoká expresia CDH17 bola spojená so zlou prežitie, recidívy nádoru, invázia tumoru, metastázy tumoru a pokročilé fázy [23] - [25]. V súčasnej štúdii, medzi 30 panelov GC bunkových línií, viac ako 66% našich testovaných bunkových línií (20/30) sú CDH17 pozitívne, a takmer polovica z týchto bunkových línií majú vyššiu expresiu CDH17. V našej správe patológie diagnostiky, 73,6% čínskej GC rakovinové tkanivá (159/216) kryl kladný CDH17 škvrnu. V CDH17 pozitívnych prípadov, úroveň expresie CDH17 má pozitívnu koreláciu s lymfatických uzlín. Avšak úroveň expresie je spätne spojené žalúdočnej steny invázie nádoru, vzdialené metastázy, a tumor TNM fázy. Naše pozorovania je v súlade s predchádzajúcimi klinickými správ [20] - [22]. Vezmeme to všetko svedčí dohromady, CDH17 môže byť diagnostický marker skorých štádií rakoviny žalúdka v čínskej populácie.

Ak chcete zistiť vplyv CDH17 v žalúdku tumorigensis rakoviny a metastatického potenciálu, a to ako oligo siRNA a TR indukovatelné pLentiviral vektorov s špecifické miRNA (exton13) proti CDH17 boli použité pre knock-down CDH17 expresie v žalúdočnej nádorových bunkových línií. CDH17 umlčanie by oligo siRNA môže inhibovať bunkovú proliferáciu a tvorbu kolónií v GC bunkových línií s vysokou expresiou CDH17. Inhibičný účinok bol dramatický na AGS, ktorý má vyššiu expresiu CDH17, ale nie na BGC823 a HGC27 buniek, ktoré majú veľmi nízka alebo žiadna expresia z CDH17 proteínu (obrázok 2). Uviedla, že výraz CDH17 môže prispievať k proliferácii nádorových buniek a schopnosť tvorby kolónií v AGS bunkách. Okrem toho, podobné výsledky boli tiež pozorované v tet-indukovanej zhrnieme sprostredkované CDH17 Knockdown v AGS buniek, čo viedlo k inhibícii bunkovej proliferácie, migrácie, adhézie, vznik kolónií a indukcie apoptózy a zastavenie bunkového cyklu in vitro. Re-expresia CDH17 mohol zachrániť proliferačnú schopnosť TR-AGS-CDH17_KD buniek (obrázok 3). Okrem toho, Tet indukovanej nadmernej expresie CDH17 v TR-MGC803-CDH17_Over buniek by mohol podporiť rast nádorových xenoimplantátů in vivo (obrázok 4). Pričom to všetko svedčí dohromady, môžeme konštatovať, že existuje významná korelácia medzi expresiou CDH17 a metastatických nádorových a schopností karcinómu žalúdka, a CDH17 môžu slúžiť ako potenciálny terapeutický cieľ pre ďalší výskum.

Aj keď niektoré predchádzajúce štúdia bola označená na to, že umlčanie CDH17 môže inhibovať bunkovú proliferáciu v GC buniek, signalizačné mechanizmus CDH17 zostáva nejasný. Bolo preukázané, že CDH17 sprostredkované onkogénne signalizácie v HCC súvisí s Wnt signalizácie [5]. Avšak, tam boli niektoré rozdiely medzi našimi výsledkami a výsledky vykazované Liu v HCC. Naše výsledky ukázali, žiadnu zmenu v fosforylovanej forme glykogén syntázy kináza 3p (GSK-3p a uchovávať beta-kateninu v jadre po umlčanie CDH17 (dáta nie sú ukázaná). Tento rozdiel môže byť vysvetlený na využitie iného typu nádorových buniek a

• Ploche ONE: microRNA 135a Potláča lymfatických uzlín cez down-regulácia ROCK1 v ranej rakoviny žalúdka
• Ploche ONE: klinické výsledky u rakoviny žalúdka po adjuvantnej Chemoradiation využitím modulovanou intenzitou v porovnaní s trojrozmerná Konformný rádioterapie